Kadmium, ólom, szelén és ón meghatározása emberi agymintákból grafitkemencés atomabszorpciós módszerrel

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Kadmium, ólom, szelén és ón meghatározása emberi agymintákból grafitkemencés atomabszorpciós módszerrel Doktori (Ph.D.) értekezés SZOBOSZLAI NORBERT Témavezető: Dr. Andrási Erzsébet és Dr. Barcza Lajos D.Sc. ELTE, Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék Budapest, 2002

Tartalomjegyzék Oldal Bevezetés... 1 1. Irodalmi áttekintés... 3 1.1. A vizsgált elemek biológiai szerepe... 3 1.1.1. Szelén... 3 1.1.2. Kadmium... 7 1.1.3 Ólom... 9 1.1.4. Ón... 11 1.2. A grafitkemencés atomabszorpciós spektroszkópia... 13 1.3. Cd, Pb, Se, Sn meghatározása emberi eredetű mintákból... 19 2. Kísérleti rész... 23 2.1. Kísérleti körülmények... 23 2.1.1. A mérőberendezés... 23 2.1.2. A felhasznált vegyszerek... 24 2.2. Mintakezelés... 26 2.2.1. Mintavétel... 26 2.2.2. Mintatárolás... 28 2.2.3. A minta szárítása... 28 2.2.4. Feltárás... 30 2.2.4.1. Feltárás Parr-bombában... 31 2.2.4.2. Feltárás mikrohullámú készülékkel... 31 3. Eredmények és értékelésük... 35 3.1. GF-AAS módszer kifejlesztése... 35 3.1.1. Az ólom és a kadmium meghatározása... 35 3.1.2. Szelén meghatározása... 37 3.1.3. Ón meghatározása... 42 3.2. Analitikai teljesítmény... 45 3.3. A mérési módszer hitelesítése... 47 3.3.1. Biológiai standard referenciaanyagok analízise... 47 i

3.3.2. Szelén meghatározása neutronaktivációs módszerrel... 48 3.4. A két feltárási technika összehasonlítása... 48 3.5. A különböző agyterületek elemkoncentrációi és a hozzájuk tartozó szórásértékek... 49 3.6. A két agyi félteke elemkoncentrációinak összehasonlítása... 55 3.7. Esszenciális és nem esszenciális elemek eloszlásának vizsgálata... 55 Eredmények megbeszélése és összefoglalás... 57 Angol és magyarnyelvű összefoglalás (summary)... 60 Irodalomjegyzék... 62 Saját közlemények jegyzéke... 72 Köszönetnyilvánítás... 74 ii

Bevezetés Az utóbbi évtizedekben jelentősen megváltozott a nyomelemek élettani szerepével kapcsolatos tudásanyag. Az analitikai módszerek fejlődése következtében a korábbiaknál nagyságrendekkel kisebb koncentrációkat tudunk meghatározni, egyre több elemről derül ki a biológiai rendszerekben betöltött szerepe, kölcsönhatásuk az élő szervezetekkel és ezek mechanizmusa. A kutatások alapján számos elem toxikusnak, míg más elemek esszenciálisnak bizonyultak. Az általunk vizsgált négy elem biológiai jelentőségét széleskörűen tanulmányozzák napjainkban is. Az ólom és a kadmium toxikus nyomelemek, melyeket a fokozódó ipari termelés mind nagyobb mennyiségben halmoz fel környezetünkben. Az emberi szervezetbe jutva kis koncentrációban is káros hatásokat okoznak, melyek mechanizmusa még nem teljesen ismert. A szelén több enzimrendszerünkben is jelenlevő esszenciális elem, biokémiai antioxidáns funkciója miatt szerepe a rákkutatásban is felmerült. Az ón biológiai szerepéről nagyon kevés adat áll még rendelkezésre. A kémiai elemzés során döntő kérdés, hogy a meghatározandó komponens mellett jelenlevő egyéb, a mérést zavaró anyagok hogyan befolyásolják a mérés érzékenységét, megbízhatóságát. Minél nagyobb a kísérő anyagok (mátrix) mennyisége a mérendő elemhez képest, annál nehezebb a mérés megbízhatóságát, valamint reprodukálhatóságát biztosítani, azaz az optimális mérést kivitelezni. Az elemzést akkor tudjuk elvégezni, ha az alkalmazott módszer érzékenysége és kimutatási határa megfelelő. A nyomelemek meghatározásához szükséges, hogy a módszer kimutatási határa a ng/g (ppb parts per billion) koncentráció tartományban illetve ez alatt legyen. Igen kis anyagmennyiségek mérésére jól használható a grafitkemencés atomabszorpciós spektrometria (GF-AAS graphite furnace atomic absorption spectrometry). A mérés elve, hogy a gázhalmazállapotú atomok fényelnyelése arányos a koncentrációval. 1

Az AAS technika bevezetésekor alkalmazott láng atomforrással szemben a grafitkemence előnye, hogy a mintagőz tartózkodási ideje a fényútban 2-3 nagyságrenddel nagyobb, ami nagy érzékenységet és alacsony kimutatási határt eredményez. Az ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén dr. Andrási Erzsébet vezetésével évek óta folyik emberi agyminták vizsgálata. A korábbi kísérletek során behatóan tanulmányozták a mintavételi, -tárolási, -elõkészítési eljárásokat, valamint vizsgálták a különbözõ mérési metodikák alkalmazhatóságát emberi agyrészek nyomelemtartalmának meghatározására. A kutatások egyrészt az ún. elsõdleges idegrendszeri elváltozásban nem szenvedõk agyrészeinek vizsgálatára irányult, másrészt az egyes idegrendszeri betegségek (pl. Glioblastoma multiforme, Parkinson-kór, Alzheimer-kór, Sclerosis multiplex) és a nyomelem-koncentrációk változásai közötti lehetséges összefüggést vizsgálták [1, 2, 3, 4, 5]. Jelen dolgozat témája GF-AAS módszer kidolgozása kadmium, ólom, szelén és ón meghatározására emberi agymintákból, és ezen elemek normál koncentrációinak megállapítása. A kísérletek során tanulmányoztuk a különböző feltárási technikák alkalmazhatóságát agyminták esetén. Vizsgáltuk a kísérő anyagoknak a mérendő elemek atomabszorpciós jelére kifejtett hatását. Optimáltuk a vizsgálat körülményeit az abszorbancia-idő, az előhevítési és az atomizációs görbék felvételével. Az elemzések pontosságának ellenőrzésére nemzetközi standard referencia anyagokat használtunk. Tanulmányoztuk az elemek eloszlásának jellegzetességeit az emberi agyban, és meghatároztuk az un. normál átlagértékeket. 2

1. Irodalmi áttekintés 1.1. A vizsgált elemek biológiai szerepe 1.1.1. Szelén A szelén a természetben négy különböző oxidációs állapotban fordul elő, elemi szelén(0), szelenid(-2), szelenit(+4) vagy szelenát(+6) [6]. A szervetlen szelénvegyületek jelentős mértékben szaporodhatnak fel természetes vizekben. A növények általában szelenát formájában veszik fel, majd aminosavakba építik, a gabonafélék és a zöldségek is tartalmaznak szerves kötésű szelént. A szelént felhasználják színanyagként az üveg-, és a kerámiaiparban, fényérzékenysége miatt napelemekben, fotoelektronikai eszközökben, félvezető tulajdonsága miatt az elektronikai iparban [7]. A szelén az emberi szervezetbe a táplálékkal kerül be, amit nagymértékben befolyásol a talaj szeléntartalma. Azokon a területeken, ahol a termőföldek szeléntartama alacsony, általános szelénhiány alakul ki, például Kína bizonyos területein. Ausztriai mérés a gabonák szeléntartalmát 400 µg/kg-nak mutatta. Spanyolországi mérés alapján a gabonákban mérhető szelén 2-78 µg/kg között változik, a becsült napi szelénbevitel 15,4 µg/fő [8]. A szelén az ember számára esszenciális nyomelem. Az első enzim, amelyben szelén létezését igazolták a glutation peroxidáz volt 1973-ban [9]. Azóta számos fehérjéből izoláltak szelént, ezeket összefoglaló néven szelenoproteineknek nevezzük. A szelenoproteinekben a szelén a ciszteinhez vagy a metioninhez kötődik, ezeket szelenocisztein és szelenometionin néven külön aminosavaknak tekintjük. Ma tizenegy szelenoproteint ismerünk: négyféle glutation peroxidáz, szelenoprotein P, szelenoprotein W, háromféle iodothyronin dejodináz, thioredoxin reduktáz, szelenofoszfát szintetáz. A glutation peroxidázok általános funkciója 3

a szervezetben lévő peroxidok redukciójának elősegítése, vagyis sejtvédő hatás. A klasszikus vagy sejten belüli glutation peroxidáz [10] képes a hidrogén-peroxid, vagy bármely szerves peroxid redukciójára is. A bevitt szelén ebben az enzim formában raktározódhat is. Az enzim aktivitása csökken szelénhiányos táplálkozás következtében, ezért mérése használható a szervezet szelénállapotának meghatározására. A plazma vagy sejten kívüli glutation peroxidáz a vese proximális tubulusaiban szintetizálódik, 1987-ben szintetizálták emberi plazmából [11]. Funkciója a sejten belüli enzimhez hasonló. Ezen enzim aktivitása is csökken szelénhiány hatására. A gasztrointesztinális glutation peroxidázt a gyomorból, a májból, és a bélrendszerből mutatták ki, feltételezhetően fontos szerepet játszik az emésztés során képződő lipidhidroperoxidok elleni védelemben [12]. Kimutatták, hogy szelénhiányban szintézise kiemelt jelentőségű. A foszfolipid hidroperoxid glutation peroxidáz redukálja a zsírsavakból képződő peroxidokat a sejtmembránokban, és védi az alacsony sűrűségű lipidfrakciót (low density lipoprotein - LDL) az oxidációtól. Az oxidált LDL szerepe ismert az arterioszklerózis kialakulásában, az érfal endotélium sejtjei és makrofágjai felveszik az LDL-eket, így a betegség első lépéseiben játszik fontos szerepet [13]. A szelenoprotein P is a plazmában levő szelenoprotein [14]. Pontos funkciója még nem ismert, állatkísérletekben szerepe bizonyított a peroxidok elleni védelemben, illetve a szeléntranszportban. Úgy tűnik, hogy a szelenoproteinek közül a szelenoprotein P szintézisének elsődleges prioritása van szelénhiány esetén. A szelenoprotein W a fehér harántcsíkolt izomszövetben, szívben, kisebb mennyiségben a májban található, szelénhiányos 4

állapotban az un. white muscle disease betegség jelentkezhet [15]. Funkciója nem ismert, feltételezik az antioxidáns hatást. A thyroid dejodinázok a tiroxin-trijódtironin átalakulásért felelősek, itt is szelenocisztein formában épül be a szelén az enzimbe [16]. Ennek a rendszernek a szelénszükséglete kisebb, mint a glutation peroxidázoké és a hiánybetegség is ritkább. A tioredoxin reduktázt az emberi T sejtekből azonosították, itt is az antioxidáns hatás dominál. Kimutatták, hogy a dehidroaszkorbinsavat aszkorbinsavvá redukálja, s így biztosítja a máj aszkorbinsav tartalmát [17]. Szelénhiányos állapotban az enzim aktivitása csökken, s ezzel magyarázzák a rákos betegségre való hajlam és a szelénhiány közötti összefüggést. A szelenofoszfát szintetáz a szelenoproteinek képzésében résztvevő enzim, a szelénfoszfát képződését katalizálja, amely az aktivált állapot a további reakciókhoz. Az első bizonyított eset, hogy szelénhiány a betegséget okozhat, a Kínában évtizedek óta ismert Keshan-kór [18]. A betegség fő tünete a kardiomiopátia, az enyhébb szívműködési zavaroktól az akut szívelégtelenségig. Kína más területein, a délnyugat-északkeleti régióban az un. Kashin-Beck betegség fordul elő [19], amely főként csontrendszeri betegség, s porcelhalással, hiányos csontfelépüléssel, és osteoartrosissal jár. Mindkét esetben igazolták a szelénhiányos táplálkozást, és szelén bevitelével jelentős javulást értek el, a betegségek előfordulási gyakorisága drasztikusan csökkent. A betegségek kialakulásához más tényezők is szükségesek, a Keshanbetegséget egy Coxsackie-vírus és a szelénhiány együtt okozza [20]. Humán vizsgálatok szelénhiányos állapotról az 1980-as évekből származnak, ekkor még a mesterséges tápszerek nem tartalmaztak szelént. A fő tünetek: izomgyengeség, fáradékonyság valamint mozgási nehézségek [21]. A ma alkalmazott tápszerek 50-100 µg/kg szelént tartalmaznak. 5

A szelén nagy mennyiségben toxikus elem [22]. Krónikus mérgezés esetén a fő tünetek a haj, a bőr, és a körmök elváltozásai, a bőr vörös színű, fölpuffadt, hólyagos, a haj hullik és töredezik, idegrendszeri tünetek is jelentkeznek: ingerültség és fáradékonyság. Fatális akut esetben hányás, hasi fájdalom lép fel, melyet a motoros idegrendszer súlyos zavarai követnek, görcsök s végül bénulás következik be. 1984-ben az Egyesült Államokban egy szelénpótló készítmény szeléntartalma 150µg helyett átlagosan 27mg volt, több halálesetet okozva [23]. Olaszországban 2065 embert vizsgáltak, akik hosszú ideig nagymennyiségű szervetlen szelént tartalmazó ivóvizet ittak. 11 év alatt a rosszindulatú daganatok mortalitása 17 %-kal nőtt, kiemelkedően a bőr- és a bélrendszeri daganatoké. Az érrendszeri betegségeket illetően a cerebrovasculáris halálozási arány nőtt, míg a koronária betegségeké csökkent [24]. Szelénhiány több betegség kialakulásában is szerepet játszhat. Összefüggést találtak a kardiovaszkuláris betegségek előfordulása, és a vérben mérhető alacsony szelénszint között [25]. A szelén hiánya a glutation peroxidázok csökkent aktivitását okozza, ezáltal a zsírsavakból származó peroxidok felszaporodhatnak, mely feltételezhetően e betegségek kialakulásáért felelős egyik faktor. A rák és a szelén közötti kapcsolat intenzív kutatás alatt áll [26, 27]. Nagy dózisú szelént állatkísérletekben hatékonynak találtak bizonyos tumorok ellen, jóval nagyobb dózisban, mint amennyi az enzimek optimális aktivitásához szükséges. A rákos betegségek nagyobb gyakoriságát igazolták szelénhiányban, bár az eredmények nem egyértelműek. Egy 10 éves kísérletsorozat után azt találták, hogy a szelén nem gyógyítja a bőrrákos betegeket, de napi 200µg szelén csökkenti a tüdő-, a vastagbél- és a prosztatarák mortalitását [28]. A kontrolcsoporthoz viszonyítva, minden ráktípust tekintve a csökkenést 44%-osnak találták. 6

1.1.2. Kadmium A kadmium toxikus elem [29], biológiai rendszerekben a cinket és a rezet helyettesítheti. Az ipari termelés éves kadmium kibocsátása a világon évente 17000 tonna. Felhasználják színanyagnak a festékgyártásban, stabilizátornak a műanyagiparban, akkumulátorokban elektródként és az acélgyártásban korrózióvédelemre. A cigaretták kadmiumtartalma jelentős, napi egy csomag évi 1 mg terhelést jelent. Állatkísérletben cigarettafüst hatására a tüdő, a máj és a vese kadmiumtartalma nőtt [30]. Az emberi szervezetbe élelmiszerekkel, cigarettafüsttel, ipari területeken a szennyezett por belélegzésével kerül. Felszívódása a bélrendszerből 5% körüli, a tüdőből meghaladhatja az 50%-ot. A keringésből gyorsan eltűnik, a szervezetben található összes kadmium fele a májban, illetve a vesében található. Biológiai felezési ideje rendkívül hosszú, 10-30 év, ezért kismennyiségű kadmium folyamatos bejutása is lassan növeli a szervezet összes kadmium tartalmát. A kadmiumot egy kis molekulatömegű fehérje, a metallotionein köti meg a szervezetben, egy gyakorlatilag inert komplex képződik, s ebben a formában tárolódik. A szabad kadmium a szervezetben kötődhet szerves tiol-, foszfát-, klorid-, karboxil-csoporthoz egyaránt. A glutationt és más szulfhidril-csoportokkal rendelkező fehérjéket megköti, így nő a szabad oxidatív anyagok (szuperoxid-ion, hidrogén-peroxid, hidroxilgyök) mennyisége, melyek felelősek a kadmium toxikus hatásainak (DNS-törés, membránkárosodás) nagy részéért [31]. Ezek a hatások antioxidánsokkal kivédhetőek [32]. Számos enzimben a kadmium a rezet vagy a cinket helyettesítheti, megváltoztatva annak hatását. Kimutatták, hogy a kadmium kalciumagonistaként kötődhet a kalmodulinhoz is és kiváltja a kalmodulinfüggő aktivációs reakciókat. Ez a hatás kalmodulingátlókkal vagy kalciumcsatornablokkolókkal megakadályozható [33]. A kalmodulin számos enzimnek 7

az aktivátora, így az említett mechanizmus lehet felelős a kadmium toxikus hatásainak egy részéért. A kadmiummérgezés tünetei a felszívódás helyétől, a dózistól, a környezeti és a táplálkozási tényezőktől függenek. Akut mérgezéseknél az elsődlegesen érintett szövet károsodik (a tüdőilletve a bélhám), többszöri expozíciót követően a vese- és a máj károsodása is tapasztalható. Akut kadmiummérgezés főleg az iparban fordul elő kadmiumtartalmú gőz vagy por belélegzésekor, a tünetek émelygés, mellkasi fájdalom, szédülés, légzési nehézségek, majd tüdőödéma alakul ki, ami súlyos esetekben halálhoz vezet. Orális mérgezés esetén hányás, hasmenés illetve hasi görcsök jelentkeznek s a halál oka metabolikus acidózis. A krónikus kadmiummérgezés leghíresebb esete az itai-itai betegség [34]. Az 1940-es években Japánban történt nagyszámú mérgezés oka az volt, hogy egy ólom-cink-kadmium bánya szennyvizét rizsföldekre vezették, s a rizs akkumulálta a kadmiumot. A mérgezés során észlelt tünetek az izületi- és az izomfájdalmak, a csontleépülés, a csonttörés, valamint a vese károsodása volt (a betegség neve a fájdalomra utal). Főként idősebb nők betegettek meg. Más esetekben ritka a csontrendszer ilyen fokú elváltozása, feltételezhetően ebben az esetben más tényezők is szerepet játszottak. A kadmium csontrendszeri hatását vizsgálva igazolták, hogy a kadmium közvetlenül hat a csontszövetre, csökkenti a csont kalciumtartalmát és növeli az oszteoklasztok aktivitását [35]. Kismennyiségű kadmium folyamatos belélegzése először krónikus bronchitist, majd az alveólusok károsodásával emphysemát okoz. A vitálkapacitás csökken, a reziduális térfogat nő, mely tünetek klinikailag mérhetőek. A pulmonáris toxicitás az α-1-antitripszin szintézis gátlásával van összefüggésben. A krónikus kadmiummérgezés fő támadáspontja a vese kéregállománya, az első tünet a proteinuria, majd aminosavak, glukóz, és foszfát is megjelennek a vizeletben. A vesetoxicitás mechanizmusa ismert. A 8

vérkeringésben levő kadmium-metallotionein komplex filtrálódik, majd endocitózissal visszaszívódik a vese proximális tubulus sejtjeibe. A komplexet lizoszómális enzimek elbontják, a felszabaduló kadmium indukálja a sejtet metallotionein szintézisét. Amennyiben a kadmium mennyisége meghaladja a 200 µg/g értéket, a kadmium-metallotionein komplex kialakulása nem elegendő, és az érintett sejtek elpusztulnak [36]. A kadmium rákkeltő hatása mind állatkísérletekben, mind a humán adatok alapján bizonyítást nyert, az IARC (International Agency for Research on Cancer) carcinogénnek nyilvánította [37]. Ez a hatás a kadmium direkt genotoxicitásán alapul. Emberi vizsgálatok igazolták, hogy a kadmium tüdőrákot okozhat [38], szerepe más daganatok (prosztata-, gyomor-, májrák) kialakításában is felmerült. A legújabb epidemiológiai vizsgálatok nem találtak összefüggést tartós kadmiumexpozició és a rákos betegségek előfordulása között [39]. 1.1.3 Ólom Az ólom környezetünkben általánosan előforduló elem, felhasználja: a kohászat, az akkumulátorgyártás, a festékgyártás, és a nyomdászat [40, 41]. Megtalálható az edények zománcaiban, a vízvezetékekben, és a lakkokban. A benzinekhez adott tetraetil-ólom ólom-dioxid formában kerül a levegőbe. Az ólomtartalmú benzinek használatát ma már több országban korlátozzák. Az emberi szervezetbe orálisan és a levegővel juthat be, a szerves ólomvegyületek átjutnak a bőrön is. A bélnyálkahártyán az orálisan bejutott ólom 8-10 %-a szívódik fel, míg gyermekekben ez az érték 40% is lehet. Angliai mérés alapján 1997-ben a napi ólombevitel 0,026 mg, mely a korábbihoz képest jelentős csökkenést jelent az ólomtartalmú festékek betiltásával, és az ólommentes benzin elterjedésével [42]. A tüdőből gyakorlatilag teljes mértékben 9

felszívódik, ezért a mérgezések többsége ólomtartalmú gőzök vagy porok belégzéséből ered. A vérkeringésbe került ólom a vörösvértestekbe kerül, majd a vesében, illetve a májban kumulálódik. Innen néhány hónap alatt a teljes ólommennyiség 95%-a a csontokba kerül, ahol a kalcium-hidroxiapatitban a kalciumot helyettesíti [43]. A csontban tárolódó ólom inaktív, de patológiás állapotokban és kalciumhiányban kiáramlása fokozódik. Terhesség alatt ez különösen veszélyes, mert átjut a placentán is. Eliminációja nagyon lassú, biológiai felezési ideje 20-30 év. Az epével ürült ólom újra visszaszívódik, a vese által kiválasztott mennyiség is csekély. Ennek fő oka, hogy a vérkeringésben a sejtes elemekhez kötődik, vagyis nem jut be a glomeruláris filtrátumba. Ha a napi ólombevitel meghaladja az 1 mg-ot, ez a mennyiség már krónikus mérgezéshez vezet. Az ólom a szervezetben a szabad szulfhidril-csoportokhoz kötődik, s ezáltal bénítja az ezen csoportot tartalmazó enzimeket. Részletesen vizsgálták a hem bioszintézisében betöltött szerepét [44]. Az ólom gátolja az ALA-dehidratázt, a koprogén-oxidázt és a ferroketalázt, kisebb mértékben pedig az uroporfirinogén szintetázt. A gátolt enzimek szubsztrátjai felszaporodnak, illetve az enzimek aktivitása csökken, ezeket mérve lehetőség nyílik az ólommérgezés korai felismerésére. Ez különösen fontos, mivel kimutatták, hogy a gyermekekben 10µg/dl ólom már szellemi károsodáshoz vezethet [45]. Az ALA-dehidratáz aktivitásának logaritmusa fordítottan arányos az ólomkoncentrációval, az akivitás mérése 10-50 µg/dl ólomtartományban jól használható [46]. Ennél magasabb ólomszintnél az enzim szintézise fokozódik. Olyan embereknél akiknél genetikai okok miatt hiányzik az ALA-dehidratáz, az ólommérgezés a hemszintézis elégtelenségét eredményezi. A cinkhez kötött protoporfirin, és a koproporfirin mennyisége egyenesen arányos a vér ólomkoncentrációjával, melyek szintén alkalmasak ólommérgezés igazolására [44]. 10

Az akut ólommérgezés tünetei a gyomor- és a bélrendszer nyálkahártyájára kifejtett összehúzó hatás miatt a hányás, a hasmenés, a hasi fájdalom, illetve súlyos esetben a sokkos állapot. A felszívódott ólom vesekárosodást idéz elő mivel károsodnak a proximális tubulussejtek. A krónikus mérgezés tünetei igen változatosak. A bőr szürke, a fogakon sötét csík jelenik meg (PbS lerakódás), jellemző az étvágytalanság, fémes íz érzete a szájban, valamint székrekedés, és bélgörcsök. Jellemző a kéz feszítőizmainak bénulása, ez a motoros beidegzés károsodásának következménye. A vérnyomás emelkedik, anaemia jelentkezik a vérképzés károsodása miatt. Az idegrendszeri tüneteket demielinizáció, és axondegeneráció okozza, melyek súlyos megnyilvánulása az encephalopathia. Gyakoriak az izületi fájdalmak. A vesekárosodás albuminuriát, és haematuriát okoz. 1.1.4 Ón Az ón a talajban µg/g, vizekben ng/g koncentrációban van jelen [47]. Bizonyos növényekben koncentrálódik, mely nincs összefüggésben a talajtartalommal. Tengeri állatok szervezetében (csigák, tüskésbőrűek) nagy mennyiségben koncentrálódik, de nem bizonyított sem a növényekben, sem az állatokban, esszenciális volta. Ónvegyületeket használnak a konzervgyártásban, stabilizátorként a műanyaggyártásban, a műtrágyákban, a biocidek előállításánál, a festékgyártásban és a kozmetikai iparban. Az emberi szervezetbe konzervekből, ón tartalmú flakonokból, és csomagolásra használt fóliákból orálisan jut be. Franciaországban vizsgálták élelmiszerek óntartalmát, mely azt mutatta, hogy a konzervekből vett élelmiszerminta óntartalma 76,6 ± 36,5 µg/g. Védőlakkréteggel ellátott konzerv esetén lényegesen alacsonyabb értéket találtak 3,2 ± 2,3 µg/g az eredmény. A friss élelmiszer óntartalma ezzel szemben mindössze 0,03 µg/g [48]. Emberben a thymusban találtak magasabb koncentrációt, ezért feltételezik, hogy a csecsemőmirigy termel egy 11

vagy több ónkötő vegyületet, s ezáltal az ónnak szerepe lehet az immunrendszerben [49]. Az ón már a születéstől fogva mérhető, de a fémek többségével ellentétben mennyisége nem növekszik az életkorral. Állatkísérletben kimutatták, hogy ónhiányos táplálás (17 ng/g ón) növekedési zavart okoz patkányokban [50], de a mai napig sem találtak olyan enzimet vagy biokémiai folyamatot, ahol kimutatható lenne ón jelenléte. Mind a Sn(II)-, mind a Sn(IV)-sóknak a bélből való felszívódása rossz, 1-5 % körüli [51]. Orális toxicitásuk alacsony, állatkísérletek szerint az 50%-os letális dózis (LD 50 ) értéke 700-1200 µg/g. Szerves ón(iv) vegyületek toxicitása jelentősen nagyobb is lehet, trietilón(iv) esetében 6 mg/kg, de az alkilcsoport szénatomszámának növekedésével toxicitása jelentősen csökken. Nagymennyiségű ón irritálja a bélrendszert, növekedési zavart, anaemiát okoz, valamint csökken a keringő hemoglobinszint. Az ólomhoz hasonlóan gátolja a koprogenázt, így nő a koproporfirin mennyisége [52]. A szerves származékok hepato- és neurotoxikusak. Ón tartalmú por tartós belélegzése pneumoconiosist okoz, lerakódik a tüdőben, de nincs sem fibrosis, sem légzésfunkció-csökkenés. Krónikus mérgezése nem ismert, ennek fő oka, hogy gyorsan távozik a szervezetből a széklettel és a vizelettel. Nincs megfigyelhető karcinogén, mutagén, illetve teratogén hatása. Számos ónvegyület tumorellenes aktivitását vizsgálták [47], melyek szerkezetileg R 2 SnO, R 2 Sn(OH)X, (XR 2 Sn) 2 O, R 2 SnX 2 L 2 képletekkel jellemezhetőek, ahol R = alkil-csoport, X = halogén, L = kétfogú ligandum oxigén vagy nitrogén donor atommal. Nagyszámú vegyület szintézise, illetve ezek in vitro és in vivo vizsgálata van folyamatban, de a terápiában még nem kerültek felhasználásra. 12

1.2. A grafitkemencés atomabszorpciós spektroszkópia Az 1900-as évek elején készítettek először a mai grafitküvettákhoz hasonló eszközöket [53]. A King által használt cső 20 cm hosszú volt, külső átmérője 16mm, a belső átmérő 5 mm. Először elektromos ívfűtést alkalmaztak 30 A áramerősséggel és 220 V feszültséggel, majd a későbbi verziónál a grafitcsövet ellenállásként kapcsolták az áramkörbe, a mai műszereknél is alkalmazott fűtési technikát alkalmazva. Ez az eszköz már sok hasonlóságot mutat az 50 évvel később készült első grafitkemencével. A küvettát emissziós spektrumok felvételére használták, molekulasávok azonosítására és jellemzésére, illetve atomvonalak meghatározására. Kvantitatív vizsgálatra nem volt alkalmas, mivel a minta párolgása nem volt tökéletes, a gőztérben lévő atomszám nem függött a mintában levő elemmennyiségtől. Ebben az időben az atomok vizsgálatánál emissziós, míg a molekuláknál abszorpciós technikákat alkalmaztak. 1955-ben Walsh [54] vetette fel az atomabszorpciós spektrum analitikai felhasználásának lehetőségét, és néhány évvel később készültek el L vov [55] és Massmann [56] tervei alapján az első kvantitatív célra is használható grafitkemencék. A készülékeknek az iparban való elterjedéshez a következő feltételeknek kellett eleget tenniük: teljes legyen az atomizálás, az abszorbeáló atomok gyorsan képződjenek, az atomok megfelelő hosszú ideig tartózkodjanak a mérőtérben, illetve a mérés után teljesen eltávozzanak a mérőtérből, rövid legyen a ciklusidő, valamint a bemérhető mintatérfogat elegendő legyen a megfelelő kimutatási határ eléréséhez, további feltételek a készülék könnyű kezelhetősége, és a költséghatékonyság. Az atomizáló küvetta anyagával szemben támasztott követelmények: a jó elektromos vezetőképesség, a magas 13

olvadáspont, hogy a nehezen párolgó elemek is atomizálódjanak, a gyors fűtéssel és a mintából származó reaktív anyagokkal szembeni rezisztencia, impermeábilisnak kell lennie a mintából származó gázhalmazállapotú anyagokra, hogy a mérendő anyag megfelelő ideig maradjon a fényútban, nagy tisztaság és a kis költséggel történő egyszerű előállíthatóság. Bár az atomizálók többsége különböző technikával előállított grafitból készült, kétféle fémet, a molibdént, és a wolframot is sikerrel használták fel atomizálók anyagaként. A grafit felületét magas hőmérsékleten (2500 o C) szénhidrogénnel, általában metánnal kezelik, így un. pirolitikus réteget hoznak létre, mely a grafitcső élettartamát nagymértékben megnöveli [57]. Az eljárás jelentősen csökkenti a küvetta felületi reaktivitását, porozitását, és a mérés során fellépő karbidképződést. Kísérleteztek teljesen pirolitikus grafitból készült csövekkel, de ezek a pirolitikus réteggel bevont grafitcsövekhez képest nem mutattak különösebb előnyöket, viszont az előállításuk jelentősen költségesebbnek bizonyult. A grafitcső, mint elektrotermikus atomizáló (ETA) jellemzője, hogyan változik illetve oszlik el a hőmérséklet a grafitcsőben a különböző fűtési szakaszokban [58]. Főként ezek a paraméterek határozzák meg az atomizáció hatékonyságát, ezzel a mérés érzékenységét, a háttérabszorbanciát, illetve a lehetséges zavaró hatások mértékét. A térbeli és időbeni hőmérséklet-eloszlások vizsgálata alapvető az atomizálók fejlesztéséhez. Az atomizálók fűtése általában elektromos árammal történik. Az áramerősség függ a feszültségtől, a fűtendő cső hosszától, a keresztmetszet felületétől, és az anyagi minőségtől. A szükséges áramerősség 500 A is lehet az 1000 o C/s fűtési ráta eléréséhez. Nagy hőmérsékleti állapotban a fűtőegységnek ellensúlyoznia kell a hőmérsékleti sugárzásból és a hővezetésből származó hőveszteséget. E faktoroknak, melyek az atomizáló fűtésének dinamikáját meghatározzák, mind saját 14

hőmérsékletfüggésük van, ezért még az egyszerű geometriával rendelkező atomizálók hőmérsékletprofilja is igen komplex. Kezdetben a két grafitkónusz, amelyeken keresztül az áramvezetés történik a grafitcsövek két végére került, ezeket a csöveket végein fűtött grafitcső -nek - end-heated - nevezzük. Egyszerű felépítésük miatt ezeket a csöveket gyakran ma is használják. Az ilyen típusú csövek fő problémája, hogy az előkezelési és az atomizációs hőmérsékleten hőmérsékleti gradiens lép fel a cső hosszirányában. A hőmérsékletkülönbség a cső szélei és a közepe között gyors fűtésnél (1000 o C/s) 2000 o C hőmérsékleten 200 o C, az atomizálás hőmérsékletén pedig már 400-600 o C is lehet. A cső különböző részein lévő alacsonyabb hőmérsékletek az elpárolgott anyag kondenzálódását illetve adszorpcióját okozzák. Ha az atomizációt hosszan tartó magas hőmérsékletű előhevítés előzi meg, és a minta atomizációja egy növekvő hőmérsékletű térben valósul meg, az abszorbancia nem lesz arányos a mintában levő meghatározandó elem mennyiségével. Ennek a problémának az áthidalására L vov egy grafitlapnak, az un. platform -nak a használatát javasolta [59]. A platformot a csőben helyezik el, a két széle hozzáér a cső falához, de tulajdonképpen a gáztérben foglal helyet, s erre injektálják a mérendő anyagot. A platformos cső hőmérsékleti tulajdonságai nem különböznek jelentősen a platform nélkülitől, viszont a platform hőmérséklete csak lassan követi a grafitcső hőmérsékletét, mivel maga a cső fűti. A csőfalhoz képest a platformról történő párolgás időben lassabban történik magasabb hőmérsékleten. Mivel a platform és a belső gáz hőmérséklete közel azonos, időben izoterm állapotról beszélhetünk, viszont a csőben fellépő hőmérsékletgrádiens megmarad, így térben nem izoterm az állapot. Többféle platformtípust próbáltak ki, újabban a csőprofilhoz illeszkedő un. integrált platformok használata terjedt el, melyeket a csővel együtt gyártanak és pirolitikus grafitréteggel vonnak be. Az 15

így készült platformok homogén felülettel, kiemelkedő rezisztenciával és jó fűtési tulajdonságokkal jellemezhetőek. A GFAAS optimális működéséhez szükséges feltételeket Slavin dolgozta ki, megalkotva az STPF (Stabilized Temperature Platform Furnace) koncepcióját [60]. Ezek szerint az atomabszorpciós készülék optimális működéséhez szükséges feltételek a következők: pirolitikus bevonattal ellátott grafitcső, pirolitikus L vov platform, gyors felfűtés, az integrált abszorbancia mérése, a megfelelő háttérkorrekció és a kémiai módosítók használata, valamint a gyors digitális jelfeldolgozás. A kémiai módosítók (chemical modifier-matrix modifier) használatát Ediger vezette be 1975-ben [61]. Kémiai módosítónak nevezzük azt az anyagot, melyet a mintához (és a standardokhoz) adagolva a mérésnél fellépő zavaró hatást vagy hatásokat csökkenti vagy megszünteti. A módosítók lehetnek szervetlen sók, szerves anyagok, fémek szerves komplexei, gázok, oxidatív és reduktív, savas és bázikus természetű anyagok. Hatásukat a mérendő elemre és/vagy a mátrixra fejtik ki. Leggyakrabban a mérendő elem termikus stabilizálása a cél, ilyenkor lehetőség nyílik hosszabb ideig tartó előhevítési lépcső beiktatásával a zavaró anyagok elpárologtatására, ilyen hatást fejtenek ki a Pd- és a Mg-sók [62, 63]. Ritkábban a módosító a mérendő anyag párolgási tulajdonságait javítja, ilyen módosítóknak a karbidképző és a nehezen párolgó elemek esetén van jelentősége. A másik lehetőség, hogy a módosító a mátrixot befolyásolja. Amennyiben csökkenti a mátrix párolgási hőmérsékletét, a bontás során távoznak a zavaró anyagok a rendszerből, erre klasszikus példa az NH 4 NO 3 [64]. További lehetőség, hogy a módosító megváltoztatja a mátrix kémiai szerkezetét, s így olyan vegyület jön létre, amely által okozott interferencia lényegesen kisebb. Schlemmer és Welz [65] foglalták össze azokat a kritériumokat, amelyeknek egy univerzális módosító meg kell feleljen: 16

a meghatározandó elem hőmérséklet-stabilitását biztosítania kell, hogy a bontási hőmérséklet legalább 1000 o C legyen, minél több elemhez használhatónak kell lennie, nagy tisztaságban előállítható legyen, nem tartalmazhatja a mérendő elemet mérhető koncentrációban, sem más elemet nagy koncentrációban, használata nem csökkentheti a grafitcső élettartamát, nem okozhat zavaró hatást az elemek mérése során. Megvizsgálták az eddig használt módosítókat, és az általuk vizsgált 9 elem esetében úgy találták, hogy a Pd(NO 3 ) 2 és a Mg(NO 3 ) 2 módosítók együttes használata minden említett követelménynek megfelel. A hőmérséklet térbeli egyenlőtlenségeinek kiküszöbölésére dolgozták ki a keresztben fűtött (side-heated) grafitcsöveket, ahol a fő problémát az elektromos érintkezés megvalósítása jelentette. A Frech [66] által készített integrált kontaktussal ellátott grafitcső (integrated contact cuvette - ICC) jelentett áttörést 1986-ban, amely kereskedelmi forgalomba is került, némi módosítás után a Perkin Elmer cég gyártja integrált platformmal: keresztben fűtött grafit atomizáló (transverse heated graphite atomizer - THGA) néven. Ennél a megoldásnál a gáz és a platform hőmérséklete gyorsabban követi a cső falának hőmérsékletét, ezáltal jelentősen tovább csökkentve a zavaró hatásokat. Mivel a cső teljes hosszában kivéve a csővégeken - közel izoterm, lecsökkennek a kondenzációból származó interferenciák és a nehezen párolgó elemeknél tapasztalt memóriaeffektus. Frech és L vov módosították a THGA csövet oly módon, hogy peremmel látták el a cső végét (end cap) [67]. Ezzel növelték a cső végeinek hőmérsékletét ami további közelítést jelent a térben egyenletes hőmérséklet-eloszlás eléréséhez. A perem ezenkívül megakadályozza a mérendő elem diffúzióját a csővégeken, s így növeli az érzékenységet és csökkenti a kimutatási határt. 17

A GF-AAS módszer kezdetben egyszerre csak egy elem mérésére volt alkalmas. Az első kiterjedt vizsgálatok, melyek több elem egyidejű mérését szolgálták Harnly nevéhez fűződnek [68]. Harnly az abszorbanciacsúcsok és a görbe alatti területek függését tanulmányozta különböző atomizációs és bontási hőmérsékleteknél. Kilenc elemet vizsgálva (Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, V, Zn) azt találta, hogy a megengedhető maximális bontási hőmérséklet a Zn mérésénél 500 o C, míg a minimális atomizációs hőmérséklet a Mo és a V mérésénél 2700 o C. Összehasonlítva a Zn mérésnél ideális paraméterekkel, ezen körülmények között a Zn abszorbanciája 50%- ra csökkent platform alkalmazásával, míg csőfalról történő atomizálás esetén 5%-ra. A vizsgálatokból kiderült, hogy a végein fűtött csövek nem megfelelőek sokelemes mérések kivitelezésére. A THGA megjelenése után, a detektor [69] és az optikai rendszer fejlesztésével készült el az első, egyszerre 6 elemet mérni képes atomabszorpciós készülék [70]. Kiterjedt kutatások folynak napjainkban is az atomabszorpciós fényforrások fejlesztésére. A lézersugárzás kiváló spektroszkópiai tulajdonságait már a 80-as években igazolták [71], de az akkori technikák magas költsége és veszélyessége megakadályozta elterjedésüket. A dióda lézerek (DL) megjelenésével és tömeges ipari elterjedésével új lehetőség nyílt felhasználásukra. Az eddig használt fényforrásokkal szemben (vájtkatódlámpa - hollow cathod lamp - HCL, elektród nélküli kisülési cső - electrodless discharge lamp - EDL), a DL a következő előnyös tulajdonságokat mutatja [72]: a kibocsátott fény intenzitása legalább egy nagyságrenddel nagyobb, jobb az intenzitás, és a hullámhossz stabilitása, amely nagyon kis abszorbanciák mérésére is lehetőséget nyújt, a sávszélesség közelítően két nagyságrenddel kisebb, ami a kalibráció lineáris koncentráció-tartományának növelését teszi lehetővé, 18

csak egy hullámhosszon emittál fényt, lehetőség nyílik a műszer felépítésének egyszerűsítésére, nincs szükség monokromátorra, a hullámhossz egyszerűen változtatható, nem szükséges minden elemhez külön lámpa. A módszer fő hátránya, hogy a GF-AAS méréseknél gyakran alkalmazott 190-315 nm hullámhossztartomány - a kereskedelmi forgalomban lévő műszernél - még nem elérhető. A fejlesztések másik iránya, ahol az utóbbi időben jelentős előrelépés történt a folytonos spektrumot sugárzó lámpák (continuum source CS) fényforrásként való alkalmazása. A klasszikus AAS műszerekben használatos monokromátorok gyenge felbontóképességük miatt alkalmatlanok CS-AAS mérés kivitelezésére. Becker-Ross és Florek munkái alapján készült nagy felbontású monokromátor (double-échelle monochromator - DEMON) [73, 74] és detektor (charge coupled device - CCD) nagy felbontása nyitotta meg az utat a CS-AAS fejlődése felé. A technika lehetővé teszi az abszorpciós vonal szélein történő mérést, így a GF-AAS dinamikus tartománya 5-6 nagyságrendre növelhető, s ezáltal kiküszöbölődik a GF-AAS módszer fő hátránya, valamint csökkennek a kimutatási határok. A detektor részletes információt szolgáltat az analitikai vonal környezetéről, mely az eddigieknél pontosabb és megbízhatóbb háttérkorrekciós eljárás kidolgozását teszi lehetővé. 1.3. Cd, Pb, Se, Sn meghatározása emberi eredetű mintákból A vizsgált elemek meghatározása emberi eredetű mintákból nyomelem-analitikai módszerekkel lehetséges. A 1.táblázatban a leggyakrabban alkalmazott módszerek kimutatási határait foglaltuk össze. A táblázatból kitűnik, hogy az atomabszorpciós technikák (oldatos, szuszpenziós, hidrid-generációs) által elérhető kimutatási határok jól összevethetőek más hatékony módszerek kimutatási 19

határaival (neutron aktivációs analízis - NAA, induktív csatolású plazma tömegspektrometria - ICP-MS). A GF-AAS technika előnye, hogy a telepítési és működési költsége jelentősen alacsonyabb, mint a két említett technikáé. Mestek és mtsai. emberi vérmintákat vizsgálva megállapították a szelén analízise során különböző mérési eljárásokkal elérhető kimutatási határokat emberi vérmintákból [75]. Méréseik alapján az ICP-MS metodika kimutatási határa (6 ng/g) alig marad el a HG-AAS (hidrid fejlesztéses atomabszorpciós spektrometria), illetve a GF-AAS módszerek 8 illetve 14 ng/g értékeitől. Chiba és mtsai különböző biológiai referenciaanyagokban a NAA és a GF-AAS eljárásokat hasonlították össze ón esetében [76]. Mindkét módszert kielégítőnek találták, az értékek jó egyezést mutatnak. Japán kutatók ICP-MS és GF-AAS mérési eredményeket vetettek össze vér és élemiszermintákban kadmium, illetve ólom mérése során [77]. Azt találták, hogy az ICP-MS mérések 10-20%-kal alacsonyabb értékeket adnak, amelyet valószínűleg a minták mátrixától eredő zavaró hatások okoznak. 1. táblázat A vizsgált elemek kimutatási határai különböző mérési technikák esetén emberi minták analízise során (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) módszer Cd Pb Se Sn GF-AAS oldat 1,5-3 3-11,5 14-60 15-20 GF-AAS 30 50 70 - szuszpenzió HG-AAS - - 8-10,4 - hidridképzés NAA 1-2 100 ICP-MS 0,14 3,8 6 - - nincs adat 20

A GF-AAS eljárásokat három fő típusra oszthatjuk fel. Az első esetben a minta nedves roncsolás után kerül mérésre, a roncsolószer oxidatív sav vagy savelegy, a roncsoló lehet hagyományos bomba vagy mikrohullámú berendezés. Ducros és mtsai. a klasszikus feltárási módszert (magas hőmérséklet, zárt bomba) hasonlították össze a legmodernebb nyitott rendszerű mikrohullámú technikával [78], s a mért adatok jó egyezést mutattak. A második esetben szilárd mintát [79] vagy szuszpenziót állítanak elő [80, 81]. A szilárd minta por formában kerül bemérésre. Szuszpenzió esetén szuszpenzióstabilizáló anyagot (Triton X-100, Viscalex HV30) kevernek a mintához, és az oldathoz hasonlóan a grafitcsőbe injektálják. Ezek a módszerek főként a folyékony minták (vér, vérplazma, vizelet) analízisére alkalmasak, de a szilárd minták megfelelő porítása után is alkalmazhatóak (pl. haj). A szuszpenziós technikák kimutatási határa általában valamivel nagyobb, mint az oldatos technikáké. A harmadik eljárás a HG-AAS módszer alkalmazása szelén analízisére [75, 82]. Bár a kimutatási határ is jobb mint a GF-AAS technikánál, az eljárás fő előnye, hogy gyakorlatilag mátrixmentes mérést tesz lehetővé. A GF-AAS méréseknél alkalmazott kémiai módosítók: szelén mérésekor: Pd [80], Ni[80], Pd-Ni [83]; ólom esetén: Mg-Rh [84], Pd-Mg [85], NH 4 H 2 PO 4 - NH 4 NO 3 [86]; kadmium mérésénél: NH 4 H 2 PO 4 -NH 4 NO 3 [86], Pd-Mg [85]; míg az ón analízisekor: aszkorbinsav [87] Spanyol kutatók a nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiát ICP-MS rendszerrel összekötve használtak fel szelén meghatározására emberi vizeletből [88]. Így lehetőség nyílt a szelén speciációs vizsgálatára (szelenometionin, szelenocisztein, Se(IV), Se(VI) tartalom) rendkívül alacsony oldatbeli kimutatási határral (Se(IV) esetén 0,5 ng/g). Rahman és mtsai. atomfluoreszcenciás eljárást dolgoztak ki öt elem, köztük a szelén meghatározására emberi hajmintából, a szelén kimutatási határa 2 ng/g [89]. A 2,3- diaminonaphtalene (DAN) szelénnel alkotott komplexe alkalmasnak 21

bizonyult molekula-fluoreszcencián alapuló koncentráció meghatározásra vér és vizeletmintákban [90]. Lengyel kutatók a kadmium és az ólom meghatározására voltammetriás eljárást dolgoztak be hajmintából [91], míg kínai kutatók az ón mérésére vérmintából [92]. Az ASV (anódos sztripping voltammetria) eljárások kimutatási határa elérte az 1 ng/g értéket, és alkalmasnak bizonyult speciációs vizsgálatok kivitelezésére is. TXRF (totálreflexiós röntgenfluoreszcenciás spektrometria) módszerrel ólom és szelén meghatározást végeztek el magyar és német kutatók különböző emberi mintákból [93, 94], Pb esetén 100 ng/g, míg Se analízisekor 50 ng/g kimutatási határt értek el. A 2. táblázatban foglaltuk össze a különböző emberi szövetekben talált irodalmi elemkoncentrációkat. 2. táblázat Emberi minták Cd, Pb, Se, Sn tartalma (ng/g; száraz tömegre vonatkoztatva) minta Cd Pb Se Sn haj [81, 91] <300 <3000 540 - fog [79] 19-95 1,43-6,32 - - vér [82] 0,1-0,8 <160 <60 - máj [95] 854,3-165,8 78-1122 vese [95] 6722,1-434,3 - tüdő [96] - - 3-574 - agy [97] 100-300 100-500 115-222 30-100 - nincs adat 22

2. Kísérleti rész 2.1. Kísérleti körülmények 2.1.1. A mérőberendezés A vizsgálatokat Perkin Elmer SIMAA 6000 típusú grafitkemencés atomabszorpciós spektrométerrel végeztük. A grafitküvetták Perkin Elmer THGA elnevezésű, végein peremezett (end capped) és perem nélküli (non end capped) keresztfűtésű grafitcsövek voltak, melyek integrált platformot tartalmaztak. A készüléket optikai rendszere (Tetrahedral Echelle Polychromator, fókusztávolság 0,5m) és detektora (Solid-state Detector, diódasoros 60 dióda) multielemes mérésre teszi alkalmassá, egyszerre hat elem mérhető. Fényforrásként vonalas spektrumot sugárzó, elemspecifikus EDL (Electrodless Discharge Lamp) lámpákat használtunk, a beállítási paramétereket a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat A fényforrás paraméterei Elem lámpa típus Lámpaáram [ma] hullámhossz [nm] spektrális sávszélesség [nm] Cd EDL 230 228,8 0,7 Pb EDL 450 283,3 0,7 Se EDL 290 196,0 2,0 Sn EDL 325 286,3 0,7 Az inert körülményeket - külső gázként - argon 500 cm 3 /min áramlási sebességgel biztosította. A háttérabszorbancia kiküszöbölésére a műszerbe beépített Zeeman longitudinális háttérkorrektort alkalmaztuk. Az oldatokat Perkin Elmer AS-72 23

típusú automatikus mintaadagolóval jutattuk a grafitcsőbe. Az injektált térfogat 5-20 µl között változott. 2.1.2. A felhasznált vegyszerek A mérésekhez szükséges oldatok elkészítéséhez a 4. táblázatban felsorolt vegyszereket használtuk. 4. táblázat A felhasznált vegyszerek Elem Vegyszer Felhasználás Gyártó Cd AAS mix standard oldat GFAAS mixed standard (Perkin Elmer) c Cd = 5mg/l Pb AAS mix standard oldat GFAAS mixed standard (Perkin Elmer) c Pb = 100mg/l Se AAS mix standard oldat GFAAS mixed standard (Perkin Elmer) c Se = 100mg/l Sn AAS mix standard oldat Tin standard solution (Merck) c Sn = 1g/l Pd Pd(NO 3 ) 2 kémiai módosító Palladium modifier (Merck) c Pd = 10 g/l Mg Mg(NO 3 ) 2 kémiai módosító Magnesium-matrix PO 4 3- modifier (Merck) c Mg 10g/l NH 4 H 2 PO 4 kémiai módosító suprapur (Merck) A minták feltárásához, illetve a standard és a módosító oldatok hígításához 65%-os salétromsavat használtunk (Merck suprapur). A feltáráshoz alkalmazott 30%-os hidrogén-peroxid szintén suprapur tisztaságú volt (Merck). A vizsgálatokhoz alkalmazott vizet Millipore 24

Milli-Q RG típusú készülék állította elő, s az így nyert ionmentes víz fajlagos ellenállása 18 MΩcm. Az agymintákat Adam Equipment WA 210 típusú analitikai mérlegen mértük le. A mintákat feltárás előtt achát mozsárban porítottuk. A salétromsav és a hidrogénperoxid pontos adagolását Dispensette easy calibration típusú (0,5-5 ml térfogatú) kézi adagoló használata biztosította. A boroszilikát üvegből készült mérőlombikokat (5, 10, 25, 50 cm 3 térfogatú, A jelű) az EPA (Environmental Protection Agency) szabványnak megfelelően, 1:1 arányú HNO 3 és víz, illetve HCl (Merck suprapur) és víz elegyekkel, majd nagytisztaságú vízzel tisztítottuk. A feltárásokkal párhuzamosan vak oldatokat is készítettünk, melyek salétromsavat, hidrogénperoxidot és vizet tartalmaztak, ezeket a mintákkal megegyező módon kezeltünk. Az összehasonlító oldatokat a 4.táblázatban található Perkin Elmer GFAAS mix standard (ón esetében az ón standardoldat) hígításával készítettük. Törzsoldatként 1 mg/l koncentrációjú oldatokat használtunk, melyet hűtőszekrényben tároltunk. A mérésekhez használt standard oldatok a törzsoldat megfelelő hígításával készültek, melyeket csak egy napig tároltunk. A kalibrációs görbe felvételénél a vak értékekkel módosított abszorbancia értékeket ábrázoltuk a koncentráció függvényében és a legkisebb négyzetek módszerével egyenest illesztettünk. Kísérleteink pontosságának ellenőrzéséhez NIST (National Institute of Standards and Technology) Bovine liver 1577a, DORM 2 (National Research Council of Canada, Dogfish Muscle), IAEA 155 (International Atomic Energy Agency, Wheypowder) típusú referenciaanyagokat használtunk. 25

2.2. Mintakezelés 2.2.1. Mintavétel Kísérleteinkhez az agymintákat az Országos Traumatológiai Intézetbõl és a Balassa kórházból kaptuk. Az analízishez, illetve a következtetések levonásához feltétlenül szükséges, hogy pontosan meghatározott anatómiai területekrõl kerüljenek ki a minták, így a mintavételt neuropatológus szakemberek végezték. Az agyrészek salétromsavval és ioncserélt vízzel tisztított polietilén dobozba, majd - lehetõség szerint - azonnal mélyhûtõbe kerültek, hogy a diffúziós és a bomlási folyamatokat a minimálisra csökkentsük. A minták az agy harminc különböző területéről származtak, mindkét féltekéből külön történt a mintavétel. A 5. táblázat mutatja be a vizsgált agyterületeket és azok funkcióit. 5. táblázat A vizsgált agyrészek, illetve azok funkciói sorszám Agyterület funkció 1. lobus occipitalis látóközpont 2. caput nuclei caudati mozgató központ 3. putamen mozgató központ 4. globus pallidus mozgás koordináció 5. thalamus pályák átkapcsolódása 6. pulvinar thalami multiszenzoros központ 7. gyrus hyppocampus emlékezés, tanulás 8. cerebellum mozgáskoordináció 9. genu corpus callosi a két féltekét összekötő pályák 10. cortex cerebri kognitív funkciók 11. nucleus ruber felszállópályák átkapcsolódása 12. substancia nigra felszállópályák átkapcsolódása 13. ammonszarv emlékezés, tanulás 14. entoriális terület kognitív funkciók 15. frontális parasaggitalis vegetatív funkciók 26

kéreg 16. frontális basalis kéreg vegetatív funkciók 17. lobulus parietalis szomatoszenzoros központ superior 18. lobulus parietalis szomatoszenzoros központ inferior 19. vermis cerebelli egyensúly, helyzetérzékelés 20. corpus amygdale emlékezés, tanulás 21. corpus mamillare emlékezés, tanulás 22. gyrus frontalis primer mozgató központ superior 23. gyrus frontalis medius szaglás 24. gyrus frontalis inferior szemmozgatás 25. gyrus temporalis hallás, beszéd medius 26. gyrus temporalis hallás, beszéd inferior 27. gyrus cinguli emlékezés, tanulás 28. colliculus superior fényre kiváltott reflexek gátlása 29. corpus pineale hormonális tevékenység 30. nucleus basalis érzőközpont Meynert A minták ún. normál emberekbõl származtak. A mintavétel szempontjából azok az emberek számítanak normálnak, akiknél ún. elsõdleges idegrendszeri elváltozás mind az anamnézis, mind a patológiai vizsgálat alapján kizárható volt. Az 5. táblázatot tanulmányozva láthatjuk, hogy a mintavétel során a mozgató rendszer (piramis-, extrapiramidális-rendszer, koordináció), az általános és specifikus érzõrendszer, valamint a limbikus rendszer (tehát érzelmi szféra, memória stb.) egyaránt érintve volt. 27

2.2.2. Mintatárolás Az emberi agyszövetek vizsgálata során a mintakezelés fontos lépése a minták tárolása, hiszen a boncolást gyakorlatilag sohasem követi az azonnali mintafeldolgozás. A minták legbiztonságosabban tömegállandóságig szárított formában tarthatók el, mivel ez gátat szab a szerves anyag bomlásának, és az aktív transzport megszűnésével előtérbe kerülő passzív diffúziónak. Arra azonban nincs lehetõségünk, hogy a boncolás helyszínén elvégezzük a szárítást, tehát megoldást kellett találni arra, hogy a minta eltartható legyen, amíg a szárításra sor kerül. Eleinte a mintákat formalinnal fixálták, ez természetesnek látszott, hiszen a kórházak és a patológiai intézetek is ezt teszik, de kiderült, hogy a formalinos tárolás analitikai problémákat okozhat, melyek a következõek: a formalin szennyezései beoldódnak a mintába. a mintából kioldódnak egyes elemek a formalinba. a különbözõ területek között diffúzió lép fel (amennyiben az egész agyat egyben tárolják) [98]. A másik megoldás a mélyhûtéssel történõ tárolás. A korábbi kísérletek során meghatározták a mélyhûtés idejének függvényében az elemkoncentrációkat, és azt találták, hogy a módszer kiválóan alkalmas tárolásra, s amellett, hogy egyszerû és biztonságos, megbízhatóbb adatokat szolgáltat mint a formalinban fixált minták. A kísérletek alapján kiderült, hogy a minta -18C körüli hõmérsékleten akár hónapokig is eltartható anélkül, hogy számolnunk kellene a szennyezõdés és a kioldódás veszélyével (ma már csak ezt a módszert alkalmazzuk) [99]. 28

2.2.3. A minta szárítása A mélyhûtve tárolt (nedves) mintákat tömegük mérése után szárítószekrényben tömegállandóságig szárítottuk. A szárítás tiszta kristályosító csészében, 105 o C-on 36 órán keresztül történt. Így könnyen kezelhetõ, tárolásra alkalmas anyagot kaptunk. A szárított minta tömegét lemértük. A szárítási faktorok számítása (ezek az ún. F-faktorok) a következõ képlettel történik: F = (száraz tömeg/nedves tömeg) *100 A mélyhûtéssel tárolt minták százalékban megadott F-értékeit, illetve a formalinban tárolt, valamint a friss minták faktorait foglaltuk össze a 6. táblázatban. 6. táblázat Néhány agyrész százalékban kifejezett átlagos szárítási faktorai különbözõ tárolási módok esetén Minta friss minta mélyhűtött minta formalinban tárolt minta caudatum 17,79 18,01 16,27 putamen 20,34 19,64 17,25 pallidum 23,14 23,71 23,68 thalamus 20,21 21,04 18,66 hyppocampus 16,16 16,77 18,31 nucleus ruber 27,43 26,06 23,05 substancia nigra 21,50 21,66 21,68 Az adatokat összevetve azt láthatjuk, hogy a mélyhûtött minták F-értékei gyakorlatilag megegyeznek a friss mintákéval, míg a formalinozott minták szárítási faktorai több agyrészben is jelentõs eltérést mutatnak. 29