Szakdolgozat A Ca2+-ion hatása a szarvasmarha kimotripszin aktivitására, stabilitására, mozgékonyságára és szerkezetére Készítette: Barabás Orsolya Témavezető: Náray-Szabó Gábor 2001
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek Prof Náray-Szabó Gábornak, hogy megteremtette számomra a munka lehetőségét és feltételeit, valamint hogy hasznos tanácsaival és támogatásával mindvégig segítette a munkámat Köszönet illeti Kaslik Gyulát a probléma felvetéséért, a munka menetének megtervezésében és megszervezésében nyújtott segítségéért Köszönöm Prof Gráf Lászlónak, hogy az autolízis sebesség és GdnHCl-denaturáció mérésekre az ELTE Biokémiai Tanszékén levő laboratóriumában lehetőséget biztosított, és Prof Závodszky Péternek a kalorimetriás és FT-IR spektroszkópiás mérések az MTA SzBK Enzimológiai Intézetében történő elvégzésének lehetőségét Hálával tartozom Harmat Veronikának, aki egyrészt a krisztallográfiai mérések és adatfeldolgozások során járult hozzá jelentősen a munkaterv megvalósításához, másrészt munkámat mindvégig figyelemmel kísérte és barátságával, szaktudásával mindig segített túljutni a felmerülő problémákon Köszönetet szeretnék mondani még dr Böcskei Zsoltnak és Gérczei Tímeának, akik bevezettek a fehérjekrisztallográfiába és részt vettek a munka krisztallográfiai részének első fázisában Köszönöm dr Rohonczy Jánosnak az NMR spektroszkópiás méréseknél nyújtott segítségét Ezek a mérések az ELTE Általános és Szervetlen Kémiai Tanszékén készültek Ezúton mondok köszönetet Kardos Józsefnek a kísérletek megvalósításában nyújtott segítségéért, és azért, hogy a felmerülő problémák megvitatásában mindig partner volt Köszönet illeti továbbá valamennyi kollégámat és családtagomat türelmükért és hasznos tanácsaikért 2
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 2 Tartalomjegyzék 3 Rövidítések jegyzéke 5 Bevezetés 6 1 A kimotripszin 7 11 A kimotripszin funkciója és szerkezete 7 12 A Ca2+-ion hatása a kimotripszinre 17 13 Célkitűzések 21 2 A felhasznált módszerek elmélete 22 21 Autolízis sebesség mérése 22 22 Triptofán-fluoreszcenciával követett guanidin-hidroklorid indukált legombolyodás 23 221 Guanidin-hidroklorid indukált legombolyodás 24 222 Triptofán-fluoreszcencia 26 23 Differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) 27 24 Hidrogén-deutérium izotóp kicserélõdés FT-IR spektroszkópiával követve 29 25 Hidrogén kicserélődési folyamatok vizsgálata 1D 1H-NMR spektroszkópiával 32 26 Röntgendiffrakció 37 261 A röntgendiffrakció alkalmazása 37 262 Kristályosítás, adatgyűjtés 38 263 A röntgendiffrakció elméleti alapjai 43 264 A fázisprobléma megoldása 46 3 A kalciumion kimotripszinre gyakorolt hatásának vizsgálata 50 31 Autolízis sebesség változása Ca2+-ion hatására 51 32 Stabilitás változása Ca2+-ion hatására 53 321 Konformációs stabilitás 53 322 Hőstabilitás 56 33 Konformációs mozgékonyság változása Ca2+-ion hatására 331 Átlagos konformációs mozgékonyság 3 58 59
332 Az aktív hely környezetének konformációs mozgékonysága 34 A Ca2+-kimotripszin komplex térszerkezetének meghatározása 62 65 4 Az eredmények összefoglalása 81 5 Felhasznált anyagok 84 6 Irodalomjegyzék 85 4
Rövidítések jegyzéke DSC: Differenciális pásztázó mikrokalorimetria (Differencial Scanning Microcalorimetry) FT-IR spektroszkópia: Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia H/D kicserélődés: hidrogén/deutérium izotópkicserélődés NMR-spektroszkópia: Mágneses magrezonancia spektroszkópia (Nuclear Magnetic Resonance) 1D 1H-NMR: 1 dimenziós proton-nmr UV-spektroszkópia: Ultraibolya spektroszkópia CD-spektroszkópia: Cirkuláris Dikroizmus spektroszkópia CCD: töltés-kapcsolt eszköz (Charge Coupled Device) PDB: Protein Data Bank, fehérjék térszerkezeti adatbázisa BMCD: kristályosítási adatbank (Biological Macromolecule Crystallization Database and the NASA Archive for Protein Crystal Growth Data,) ESRF: European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble LURE: Laboratoire pour l Utilisation du Rayonnement Electromagnétique, Orsay AMoRe: Automated Package for Molecular Replacement GdnHCl: guanidin-hidroklorid Tris: trisz-(hidroximetil)-aminometán EDTA: etilén-diamin-n,n,n',n'-tetraecetsav Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC: szukcinil-ala-ala-pro-phe-aminometilcoumarin fluoreszcenciás peptid-szubsztrát AMC: 7-amino-4-metil-kumarin PMSF: fenil-metil-szulfonil-fluorid DSS: 2,2-dimetil-2-szilapentán-5-szulfonsav 5
Bevezetés A kimotripszin peptidkötés hidrolízisét katalizáló emésztő enzim, amely az enzimműködést befolyásoló tényezők vizsgálatának egyik legkedveltebb modellje Régóta ismeretes, hogy fiziológiás körülmények között megfigyelhető teljes aktivitását csak kalciumiont tartalmazó közegben tudja kifejteni, és önemésztése is felgyorsul kalciumionok hiányában E hatások okainak felderítése érdekében azonban mindeddig kevés vizsgálat történt Az ELTE Biokémiai Tanszékének Gráf László és Venekei István által vezetett csoportjai kimotripszinnel végzett más irányú kutatásaik során megfigyelték, hogy a kalciumion a fentieken kívül az enzim más tulajdonságaira (stabilitására, mozgékonyságára) is hatással van Felvetésük nyomán olyan kísérletsorozatot terveztünk, amely a probléma minden lehetséges, eddig nem kellőképpen tanulmányozott aspektusát megvizsgálja Az ELTE Elméleti Kémiai Tanszékén végzett fehérjekrisztallográfiai vizsgálatoktól várt szerkezeti információ mellett az enzim stabilitásáról és flexibilitásáról kívántunk információkat gyűjteni Mára már nyilvánvalóvá vált, hogy minél több oldalról vizsgálunk egy problémát, annál teljesebb képet kapunk a valóságról Így makromolekulák vizsgálata során sem szorítkozhatunk egyik vagy másik módszer kizárólagos használatára Be kell látnunk, hogy abszolút módszer nem létezik A problémaorientált kutatás terjedése ma Magyarországon a kutatócsoportok komoly együttműködését követeli meg, különösen nagyműszeres technikák alkalmazása esetén Ez a munka különböző kutatócsoportok közötti összefogásnak is jó példáját nyújtja 6
1 A kimotripszin 11 A kimotripszin funkciója és szerkezete A kimotripszin a szerin-proteázok családjába tartozó fehérjebontó enzim A szerinproteázok olyan, láncon belüli peptidkötést hasító enzimek (endopeptidázok), amelyek működéséhez a polipeptid lánc egy meghatározott helyzetű szerin OH-csoportja szükséges Kulcsszerepet játszanak a táplálék emésztésében, és fontos szabályozó szerepük is van, mivel részt vesznek fehérjék lebontásában, valamint más enzimek és hormonok aktiválásában Az utóbbi évtizedekben a szerin-proteáz család tagjai, különösen a kimotripszin kedvelt modellé vált az enzimológia több kérdésének vizsgálatára, beleértve a proenzim aktiválás, a szubsztrát-specifikus katalízis, valamint ligandumok, effektorok és fémek kötődésének és hatásának molekuláris mechanizmusát A szerin-proteázoknak három alcsaládját különböztetjük meg: a tripszin, a szubtilizin és az oligopeptidáz családot, amelyek közül a kimotripszint a tripszin családba soroljuk A szerin-proteázok nagy része a neutrális ph közelében fejti ki hatását, ph optimumuk 7-9 közé esik Hőmérsékleti optimumuk a fiziológiás hőmérséklet A kimotripszin molekulatömege 25000 Da, teljes aminosav-sorrendje és térszerkezete1 ismert Az emlősök hasnyálmirigyében (pankreász) termelődik inaktív proenzimje (zimogénje) a kimotripszinogén, amely a bélcsatornában aktiválódik tripszin hatására A hasnyálmirigy külső elválasztású mirigyei termelik a hasnyálat, amely a kimotripszin mellett tartalmazza a tripszin, a karboxipeptidáz, az elasztáz zimogénjét, a szénhidrát bontó amilázt és a zsírbontó lipázt2 A hasnyálat a pankreász a patkóbélbe üríti, a zimogének itt aktiválódnak N-terminális propeptidjük lehasadása révén A bonyolult aktiválási kaszkád első lépése a tripszinogén aktiválása az enteropeptidáz által A többi proteáz proenzimjének aktiválását alapvetően más enzimek (főkét tripszin) végzik A kimotripszinogén aktiválása több lépésben megy végbe, és többféle útvonalon haladhat, így több, kisebb-nagyobb mértékben eltérő aktivitású és stabilitású kimotripszin keletkezéséhez vezet (11 ábra) A zimogénből két láncközi dipeptid hasad ki, az így keletkező stabil termék az α- és a γ-kimotripszin Ezek három polipeptid-láncból álló aktív enzimek, amelynek láncait diszulfidhidak tartják össze Az első lánc a Cys1-Leu13 aminosavakat tartalmazza: ez a lehasított propeptid, amely a Cys1-Cys122 aminosavak közötti diszulfidhíddal kötve marad az enzimhez A két további lánc: Ile16-Tyr146 és Ala149-Asn246 Az aktivációs folyamat a fehérje térszerkezetének 7
jelentős megváltozását idézi elő, amelynek hatására kialakul az aktív centrum A két stabil aktív forma - az α- és a γ-kimotripszin - kémiailag azonos, térszerkezetük és aktivitásuk egyes kutatócsoportok szerint - némileg különbözik A legnagyobb térszerkezeti különbség valószínűleg két felszíni hurok (loop), nevezetesen az autolízis hurok és a feltételezett kalciumkötő hurok szerkezetében van1 Legkönnyebben kristályosodási sajátságaik (eltérő optimális kristályosítási körülmény és tércsoport) alapján lehet megkülönböztetni őket1,3 E két aktív enzimforma tulajdonságairól és arról, hogy miben különböznek egymástól, az irodalomban sok egymásnak ellentmondó, vagy csak részben átfedő információ található1,2,4,5,6 Még ma sem világos, hogy e két hagyomány alapján fennmaradt elnevezés valódi eltérést takar-e, és ha igen, akkor pontosan mi a különbség a két forma között Úgy tűnik, az α-kimotripszin ph=5,0 alatt stabil, a ph lassú emelésének hatására γ-kimotripszinné alakul7 Az α-kimotripszin különös tulajdonsága, amiben különbözik a többi formától, hogy dimerizációra hajlamos A tápcsatornában a γ-kimotripszin keletkezése a legvalószínűbb, mivel fiziológiás körülmények között ez a legstabilabb, legaktívabb, és mivel ez keletkezik az úgynevezett gyors aktivációs mechanizmussal LASSÚ GYORS aktiválás kimotripszinogén π-kimotripszin önemésztés önemésztés neokimotripszinogén δ-kimotripszin aktiválás és önemésztés önemésztés α-kimotripszin γ-kimotripszin 11 ábra A kimotripszinogén aktiválása2 A kimotripszin és általában a szerin-proteázok által katalizált reakció8 azonos proton transzfer mechanizmust követ2,9 Három aminosav, a hisztidin, az aszparaginsav és a szerin, az úgynevezett katalitikus triád, nélkülözhetetlen a peptidkötés hasításához, térbeli elhelyezkedésük (His57, Asp102 és Ser195) konzerválódott a tripszin-típusú szerin-proteázok 8
családján belül A szubsztrát-kötő zseb bejáratánál helyezkednek el, térbeli helyzetük hidrogén kötések által erősen rögzített A kimotripszin esetében az oldalláncok szelektív kémiai módosításával bizonyították, hogy a Ser195 és a His57 aktívan közreműködik a katalitikus funkció kifejtésében A konzerválódott, eltemetett Asp102 aminosav esszenciális szerepét a katalitikus reakcióban először a kristályszerkezet alapján írták le,10,11 majd irányított mutagenezissel igazolták Az aktív centrumban hidrogénkötés-hálózat alakul ki a Ser195, His57 és az Asp102 oldalláncok között (12 ábra), amelyeknek nagy szerepe van a katalitikus hatás kifejtésében, a proton vándorlás ugyanis ezek mentén játszódik le Ezek a hidrogénkötések Markley és csoportja eredményei szerint12 a szubsztrát megkötődése után válnak igazán erőssé, sőt a His-Ser hidrogén kötés valójában csak a szubsztrát bekötődése után alakul ki 12 ábra A proton-transzfert lehetővé tevő hidrogénkötés-hálózat a kimotripszin aktív centrumában, a katalitikus aminosavak között13 acilezés dezacilezés (ahol X = OH) 13 ábra A szerin-proteázok által katalizált reakció lépései4 A peptidkötés hidrolízise az 13 ábrán feltüntetett módon játszódik le A Michaeliskomplex létrejötte után a katalitikus szerin nukleofil támadást intéz a szubsztrát elhasadó peptidkötésében résztvevő karbonil szénatom ellen A Ser195 nukleofilitását a térbeli közelségben lévő, eltemetett Asp102 negatív töltésű karboxil-csoportja növeli a His57 9
imidazolgyűrűjének közvetítésével (lásd az 12 és az 14 ábrát) A His57 imidazolgyűrűje általános báziskatalizátorként felveszi a szerin protonját (13 ábra) Gly193 Ser195 Asp194 Ile16 His57 Asp102 14 ábra Néhány aminosav konformációja a kimotripszin aktív centrumában8 Ezután a protonált His57, mint savkatalizátor protonálja a szubsztrát peptid nitrogénjét, a peptidkötés elhasad, az ekkor szabaddá váló polipeptid távozik az aktív helyről Az elhasított peptidkötés karboxil csoportja pedig a katalitikus szerin OH-csoportját észteresíti, kovalens kötésű acil-enzim köztitermék (intermedier) jön létre (15 ábra) Ez a folyamat az acilezés Az acil-enzim azután hasonló lépéseken keresztül savra és enzimre hidrolizál (dezacilezés), itt a nukleofil támadó szerepét a katalitikus vízmolekula játssza14 (13 ábra) Az acilezési és a dezacilezési reakció minden lépése tetraéderes átmeneti-állapotokon keresztül, hidrogénkötések mentén történő proton vándorlással megy végbe Az acilezés második lépése, a tetraéderes intermedier acil-enzimmé alakulása a hidrolízis sebességmeghatározó lépése13 A leírt mechanizmust kinetikai kísérletek15 mellett, a köztitermékek elkülönítésével és krisztallográfiai vizsgálatával16,17,18 is igazolták A 15 ábrán egy acil-enzim röntgen-diffrakciós szerkezetében látható az aktív hely környezete A szerin-proetázok által katalizált peptidkötés-hidrolízis sebessége, a fenti, igen hatékony katalitikus mechanizmusnak köszönhetően, több mint milliárdszorosa (109) a nem katalizált reakció sebességének 10
15 ábra Az aktív hely környezete a szubsztrátkötésben résztvevő kölcsönhatásokkal egy acil-enzim röntgendiffrakciós szerkezetében A szubsztrát szénatomjait szürkére, az enziméit zöldre színeztem A fentiek alapján a katalitikus Asp102 szerepe másodlagosnak tűnik, megfigyelték azonban, hogy hiánya 10-4-szeresére csökkenti az enzim katalitikus aktivitását,19 tehát nélkülözhetetlen a katalízishez Szerepe kettős: egyrészt a szabad enzimben stabilizálja a katalitikus His57-nek a reakció szempontjából megfelelő tautomerjét, másrészt kompenzálja a His57-en az átmeneti állapotban kialakuló pozitív töltést Pontos térbeli helyzete nem annyira konzerválódott, mint a Ser195, His57 kettősé Hosszú ideig úgy gondolták, hogy a katalitikus reakció során a His57-ről a proton továbbvándorol az Asp102-re20 Ez az úgynevezett töltés-relé (charge-relay), vagy kétszeres proton átviteli (double proton-transfer) mechanizmus Kísérleti vizsgálatok és elméleti számítások azonban Polgár és Bender korai javaslatát21 igazolták,22 amely szerint az eltemetett aszpartát ionizált marad a katalitikus folyamat során Tehát az Asp102 fő szerepe az, hogy növeli az átmeneti állapotban a tetraéderes intermedier és a protonált hisztidin által képzett ionpár stabilitását Kvantumkémiai tanulmányok bizonyították, hogy a fehérjekörnyezet is kritikus szerepet játszik a Ser-His-Asp triádnak a katalitikus reakció első szakaszában kialakuló (-+-) töltéseloszlásának stabilizálásában23,24 A negatívan töltött Asp102 és a fehérjekörnyezet töltéseloszlása tehát elektrosztatikusan stabilizálja a katalitikus reakció poláris átmeneti állapotát a kiindulási állapothoz képest, meggyorsítva ezáltal a reakciót 22 Ilyen, úgynevezett elektrosztatikus katalízis számos enzim mechanizmusában kulcsszerepet játszik22,25 11
A katalízis hatékonyságához egyéb tényezők is hozzájárulnak Ilyen például, hogy a Ser195 mellett az Asp194 és Ile16 aminosavak közötti hidrogénkötés stabilizálja az aktív hely szerkezetét (14 és 15 ábra) Az aktiválás során szabaddá váló új N-terminális Ile16 ezen szerepe az aktív enzimben magyarázatul szolgál arra, hogy a zimogén miért nem aktív A Ser214 aminosav, amely az enzimcsalád szinte minden tagjánál megtalálható, szintén hozzájárul az enzimek katalitikus aktivitásához Hidrogénkötést létesít a C-terminálisán hasadó aminosav főláncbeli N-atomjával (15 ábra), ezáltal rögzíti a szubsztrát molekulát a katalízis által megkívánt pozícióban A Ser214 a katalitikus aszparaginsavhoz (Asp102) is hidrogénkötéssel kapcsolódik, jelentősen hozzájárulva ezzel az eltemetett oldallánc töltésének stabilizálásához A katalitikus funkció kifejtéséhez a kimotripszin-szerű enzimeknél nélkülözhetetlen az oxianion üregnek nevezett szerkezeti egység is, amelyben található Gly193 és Ser195 aminosavak amid NH-csoportja hidrogénkötés-donorként lép kölcsönhatásba az elhasadó peptidkötés karbonil-csoportjával (15 ábra), stabilizálva a karbonil-oxigénen fejlődő negatív töltést és orientálva a hidrolizálandó kötést a katalitikus His57 és Ser195 aminosavakhoz, ezáltal indukálva a tetraéderes átmeneti komplex kialakulását A kimotripszin két egymás mellé helyezett β-hordó egységből (domén, vázlatosan az 16 ábra mutatja), egy ezeket összekapcsoló úgynevezett interdomén hurokból és egy C terminális α-hélixből áll A kimotripszin röntgendiffrakcióval meghatározott szerkezete az 17 ábrán látható, amelyen a két β-hordó egységet különböző színnel jelöltem A β-hordó egységek hat antiparalel szegmensből és két hurokból állnak, egy diszulfidhíd és 11 hidrogénkötés stabilizálja őket A két egység között a katalitikus aminosavak közti hidrogénkötések "hidat" képeznek A His57 és Asp102 aminosav az egyik, míg a Ser195 a másik hordó felületén helyezkedik el (lásd az 17 ábrán) Az aktív centrum kialakulása szempontjából a domének egymáshoz viszonyított helyzete, távolsága tehát kritikus26 Mind az aktív kimotripszinben, mind a zimogénben a két domén között elhelyezkedő propeptid másodlagos kölcsönhatások révén stabilizálja a β-hordók távolságát, helyzetét A tripszin és a szerin-proteáz család legtöbb tagja aktív formában nem tartalmazza a propeptidet, a kimotripszin tehát ebből a szempontból különleges A kimotripszin propeptidje nem befolyásolja az enzimaktivitást, nem szükséges a helyes felgombolyodáshoz, viszont stabilizálja a fehérjét hő és denaturáló szerek hatásával szemben, segít megőrizni aktivitását szélsőségesebb körülmények között27 Ez azzal magyarázható, hogy rögzíti a β-hordók aktivitás szempontjából kritikus távolságát 12
16 ábra A kimotripszin vázlatos harmadlagos szerkezete13 17 ábra A kimotripszin röntgendiffrakcióval meghatározott harmadlagos szerkezete A két β-hordó egységet kétféle zöld szín jelzi, a kalciumkötő hurkot kékkel, az interdomén hurkot pedig pirossal jelöltem Az egyes szerin-proteázok működési mechanizmusa azonosnak tekinthető, de az enzimek különböznek abban, hogy melyik aminosav-oldallánc melletti peptidkötést hasítják a legnagyobb sebességgel (specifitás) Ritkák az olyan enzimek, amelyek csak meghatározott aminosavak közötti peptidkötést tudnak elhasítani A tripszin kiemelten specifikus szerinproteáz, csak azokat a peptidkötéseket hasítja el, amelyekben arginin vagy lizin karbonil csoportja vesz részt A kimotripszin kevésbé specifikus: erősen apoláris, aromás oldalláncot tartalmazó aminosavak, így tirozin, triptofán, fenilalanin és leucin után hasít elsősorban Pontosabban apoláris vagy aromás L-amino-karbonsavak olyan észter- és amidszármazékainak hidrolitikus hasítását katalizálja, amelyekben ezek az aminosavak karboxil csoportjukkal vesznek részt Mindkét enzimet gyakran fehérjeszerkezet vizsgálata során 13 használják az elsődleges
A szerin-proteázok specifitásbeli különbségeit első közelítésben a szubsztrátkötő hasadékban megjelenő kis szerkezeti különbségek okozzák A katalízis szelektivitása alapvetően az enzim és a szubsztrát között kialakuló specifikus kölcsönhatásoktól, azok szelektivitásától függ Hidrogénkötések, elektrosztatikus28,29 és hidrofób kölcsönhatások együttesen biztosítják a szubsztrát precíz illeszkedését az aktív helyhez Az egymással kölcsönhatást kialakító aminosavakat az úgynevezett S-P nomenklatúrával nevezzük el, így hivatkozunk rájuk általánosan A hasítandó kötéshez karbonil csoportjával kapcsolódó aminosavat jelöljük P1-gyel, az ezt kötő specifitási helyet (kötő zsebet) alkotó aminosav oldallánco(ka)t pedig S1-gyel Hasonlóan a hidrolíziskor keletkező N-terminális aminosav a P1', és a vele kötést kialakító enzim alegység az S1' hely A nomenklatúra kiterjeszthető a polipeptidláncok mentén mindkét irányba, így kapjuk az S2,S3,,Sn,S2',S3',,Sn' és P2,P3,,Pn,P2',P3',,Pn' elnevezéseket A szubsztrát P1-P4 aminosavai általában az enzim S1S4 helyeivel antiparalell β-redőt képezve rögzülnek (lásd az 18 és az 15 ábrát) A kimotripszin esetében az elsődleges specifitás meghatározó az S1-P1 kölcsönhatás A P1' helyen prolin kivételével bármilyen aminosav lehet Az S1 hely egy jól definiált, mély zseb, amely különböző aromás csoportokat tud megkötni (19 ábra) A zseb mélyén elhelyezkedő 189 aminosav nagyon konzervatívan aszparaginsav tripszin-szerű, míg szerin vagy más kisméretű aminosav kimotripszin- és elasztáz-szerű specifitással rendelkező enzimek esetén A tripszinben a 189 aszparaginsav biztosítja a pozitívan töltött P1 aminosav kötődését, míg a kimotripszinben ezen a helyen található szerin miatt a zseb kevésbé poláris, lehetővé téve az aromás oldalláncok kapcsolódását A specifitás kialakításában szerepet játszanak még a 216, 226 pozícióban található aminosavak oldalláncai is, ezek a kimotripszinben és a tripszinben glicinek, megengedve nagyobb oldalláncú aminosav utáni hasítást is A szubsztrátkötő zsebet alapvetően főlánc atomok közti kölcsönhatások stabilizálják Három vízmolekula is kötődik lazán a zsebben kialakuló hidrogénkötés hálózathoz, ezek a zseb bejáratához közel helyezkednek el A szubsztrát kötődésekor a vízmolekulákat kiűzi a P1 aminosav, amely bekötődik az S1 szubsztrátkötő zsebbe, szendvicsszerű komplexet kialakítva a 190-192 és a 215-216 aminosav láncokkal, amelyek az egyik β-hordó két szegmensén helyezkednek el A szubsztrát és az enzim között kialakuló, előbbiekben leírt kölcsönhatásokat az 15 és az 19 ábra mutatja 14
18 ábra A szerin-proteázok szubsztrátkötésében résztvevő antiparallel β-redő, S-P kölcsönhatások vázlatos ábrázolása 19 ábra A kimotripszin szubsztrátkötésében résztvevő kölcsönhatások9 A specifitási üreg (S1) szekvenciájában csak egy jelentősebb eltérés van tripszin és kimotripszin között, nevezetesen az említett 189 aminosav Helyspecifikus mutagenezissel előállították azokat az enzimeket, tripszint és kimotripszint is, amelyekben ezt az aminosavat cserélték ki Ezekkel az enzimekkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a specifitás nem cserélődött fel, csak az aktivitás csökkent,30,31 vagyis nem csak ez az egy aminosav felelős a specifitásért Sok aminosav cseréje, közöttük szekvenciában távol esőké is szükséges volt ahhoz, hogy a tripszin specifitását kimotripszin szerűvé változtassák,32 a fordított konvertálás pedig ez idáig nem sikerült31 Egy lehetséges magyarázata ennek a megfigyelésnek az, hogy a tripszin és a tripszinogén szerkezete valószínűleg merevebb, mint a kimotripsziné33 Mindez azt mutatja, hogy, bár sok enzim és enzim-ligandum komplex röntgendiffrakciós szerkezete ismert, távol állunk attól, hogy a szerin-proteázok szubsztrát specifikus katalízisét teljesen értsük 15
A kimotripszin inaktiválása és bomlása az aktiválási folyamathoz hasonlóan limitált proteolízissel, egyrészt más proteázok hatására (tripszin), főként azonban önemésztéssel (autolízis, autoproteolízis) történik A kimotripszin féléletidejét az önemésztés sebessége határozza meg in vitro E folyamat alapos megismerése tehát feltétlenül szükséges A fehérjén több lehetséges kimotripszin hasítási hely van, melyek közül a Leu13, Tyr146 és a Asn148 aminosavak mellett bizonyítottan történik hidrolízis az ön-inaktiválás során34,35 Utóbbi aminosavak egy mozgékony felszíni hurokban (141-155) találhatók, amelyet önhasítással szemben mutatott nagy érzékenysége miatt autolízis huroknak neveznek Az önhasítás ezeken a helyeken, sokkal gyorsabb, mint bármely más pozícióban E hasítások termékei még rendelkeznek enzimatikus aktivitással Azt a hasítási helyet azonban, amely meghatározza az ön-inaktiválódás sebességét, eddig nem sikerült kétséget kizáróan azonosítani Az autolízis mechanizmusát, kinetikáját több kutatócsoport vizsgálta Eleinte úgy gondolták, elsőrendű kinetika szerint emészti önmagát az enzim 36 A későbbiekben ez az elképzelés tévesnek bizonyult Kumar és Hein37 felismerte, hogy a nagy enzimkoncentráció polimerizáció lejátszódása miatt meghamisítja a méréseket,38 ezért kísérleteiket a korábbi vizsgálatoktól eltérően alacsony enzimkoncentrációt (0,1-1 mg/ml) használva végezték Kifejlesztettek egy gyors kinetikai vizsgálati módszert, amellyel mérték az autolízis folyamatos előrehaladását, az enzim maradék aktivitását követve Eredményeik azt mutatták, hogy a vizsgálat körülményei között az önemésztés másodrendű kinetikát követ Ennek alapján az autolízisre olyan mechanizmust javasoltak, amely szerint egyik enzimmolekula támadása egy másik molekulán (bimolekulás reakció) a sebesség meghatározó lépés Ez a mechanizmus nem egyedülálló Kunitz és Northrop a tripszin önemésztésére már 1934-ben ilyen mechanizmust javasoltak39 Ismeretes továbbá, hogy a szerin-proteázok zimogénjeinek autokatalitikus aktivációja is hasonlóan zajlik Kumar és Hein mutatták ki azt is, hogy az autolízis sebessége a ph függvényében maximumot vesz fel ph=9,0-nél37 Valamint, hogy fiziológiásnál magasabb hőmérsékleten, töményebb enzimkoncentrációnál bonyolult első- és másodrendű kevert kinetikát mutat az önemésztés Az ELTE Biokémiai Tanszékén Gráf László professzor csoportja által végzett legújabb kutatások eredményei azt mutatják, hogy az ön-inaktiválódás sebesség meghatározó lépése a két β-hordó egységet összekapcsoló (interdomén) hurokban (109-132) lévő Phe114 aminosav melletti hasítás40 (az 17 ábrán piros színnel jelöltem a hurok kritikus részét) Úgy találták, hogy a mozgékony autolízis hurokban észlelhető hasítások gyorsan és a további hasításoktól függetlenül játszódnak le Ezután kerül sor a Phe114-Ser115 peptidkötés hidrolízisére, amely az előbbieknél jóval lassabban megy végbe, mert az interdomén hurok jól 16
definiált, stabil konformációval rendelkezik (ez szükséges a két β-hordó egység térbeli helyzetének rögzítéséhez) A Phe114-Ser115 peptid kötés elhasítása után a további fragmentációk már gyorsan lejátszódnak, aminek oka az, hogy korábban eltemetett peptid kötések hozzáférhetővé válnak Az autolízis hurokban bekövetkező hasításoknak nincs ilyen hatásuk, mert ez a hurok az egyik β-hordó egység része, elhasadása után a szomszédos βredők közötti erős kölcsönhatások és közeli diszulfid hidak a molekulát egyben tartják Az önemésztés végtermékei valószínűleg hexapeptidek (átlagosan) Összegezve tehát az öninaktiválás sebességét, és ezáltal az enzim féléletidejét, az interdomén hurokban lévő Phe114Ser115 peptid-kötés hidrolízise határozza meg, és az autolízis hurok, vagy más felszíni hurok hidrolízise nincs számottevő hatással az ön-inaktiválásra 12 A Ca2+-ion hatása a kimotripszinre Évtizedekkel ezelőtt kimutatták, hogy a tripszin és a kimotripszin katalitikus aktivitása jelentős mértékben függ az oldat Ca2+-koncentrációjától (bizonyos határokon belül) 10 mm Ca2+ jelenléte az oldatban 150%-kal növeli a kimotripszin enzimatikus aktivitását41,42 Wu és Laskowski már 1956-ban felfigyeltek arra,41 hogy a kimotripszin önemésztésének sebességét a Ca2+-ion jelenléte az oldatban jelentős mértékben csökkenti Megfigyelésüket később többen igazolták precíz, időfüggő aktivitásmérési kísérletekkel43,44 E hatás okai, szerkezeti alapjai ez idáig ismeretlenek A kimotripszin Ca2+-ion komplexének szerkezete ugyanis nem ismert, így a Ca2+-kötő régió és az autolízisben valószínűleg kulcsszerepet játszó interdomén hurok kölcsönhatásáról nincs szerkezeti információnk E két hurok helyzete a kalciumot nem kötő enzim röntgendiffrakciós szerkezetében az 17 ábrán látható Az ábrán piros szín jelzi az interdomén hurkot, és kék szín a feltételezett kalciumkötő hurkot Kalciumot tartalmazó enzim szerkezet hiányában nem tudjuk biztosan, hogy a fémion kötésében mely aminosavak vesznek részt A tripszin kalciumkötő régiója45 (110 ábra), és a két fehérje szekvenciájának összevetése (lásd az 11 táblázatot) alapján gyanítható, hogy a kimotripszinben - a tripszinhez hasonlóan - a kalciumkötésért felelős aminosavak a 70-től a 80 aminosavig terjedő hurokban találhatók 17
Kimotripszin Tripszin 69 Gly Gly 70 Glu Glu 71 Phe Asp 72 Asp Asn 73 Gln Ile 74 Gly Asn 75 Ser Val 76 Ser Val 77 Ser Glu 78 Glu Gly 79 Lys Asn 80 Ile Glu 81 Gln Gln 11 táblázat A kalciumkötő hurok szekvenciájának összehasonlítása a kimotripszinben és a tripszinben Oldatkísérletek alapján korábban három különböző kalciumkötő-helyet javasoltak a tripszinben46,47,48 Végül a Ca2+-tripszin komplex kristályszerkezete45 alapján bebizonyosodott, hogy a 70-től a 80 aminosavig terjedő felszíni hurok felelős a kalciumkötésért Tekintve, hogy a kalciumion közel egyforma hatással van a tripszinre és a kimotripszinre (mindkét enzimet stabilizálja az autolízissel szemben, növeli aktivitásukat, stb), ráadásul a két enzim magas szekvencia-hasonlóságot mutat és kalciumion kötési-konstansuk is hasonló nagyságú, úgy véljük, közel azonos helyen kötik a kalciumiont E feltevésre több kutatócsoport kísérletei szolgáltattak közvetett bizonyítékot Mindegyik kísérletben a kalciumiont azonos helyen kötődő fémionnal helyettesítették, és különböző technikákkal (NMR relaxációs idő, fluoreszcenciás energiatranszfer mérésekkel49) meghatározták az aktív hely és a kalciumkötő hurok távolságát a két enzimben, amelyek közel azonosnak adódtak A kalciumkötő hurok szekvenciájának összehasonlítását a két enzimben az 11 táblázat mutatja A vastag betűvel szedett aminosavak koordinálják a tripszinben a kalciumiont A Ca2+ kötődését a marha tripszin szerkezetében az 110 és az 111 ábra mutatja Összehasonlítva a kritikus aminosavak természetét a két enzim szekvenciájában, nem lehetünk bizonyosak abban, hogy a kimotripszinben valóban ez a régió köti a fémiont Nagyobb eltérések vannak a 75 a 77 és a 80 pozícióban Ezek közül a 75 aminosav jellege lényegtelen, mert itt a tripszinben a karbonil oxigén koordinálja a kalciumiont A 77 pozíción bekövetkező Glu-Ser csere, talán nem jelent gondot, mert ez az aminosav egy vízmolekula közvetítésével kapcsolódik a kalciumionhoz, és egy vízmolekulával gyenge hidrogénkötés kialakítására a szerin is képes lehet A legnagyobb eltérést a 80 helyen található Gln-Ile csere jelenti Mivel az izoleucin oldallánca nem tartalmaz negatív nettó töltésű oxigént, a Ca2+-ionra pedig legalább hatos koordinációs szám jellemző, egy hatodik oxigénnek ezt az aminosavat helyettesítenie kell Kérdéses, mi és hogyan tudja ezt a feladatot ellátni Elbizonytalanító az a tény is, hogy a kimotripszin szekvenciájának ebben a régiójában csak egy negatív töltésű csoport van, ez pedig kevés a kétszeres pozitív töltésű (divalens) kation töltésének kompenzálásához A tripszin és a kimotripszin terbium-lumineszcenciával meghatározott kalciumion kötési konstansát50 az 12 táblázat mutatja A kötési konstans definiáló egyenlete: KCa = [ECa2+]/[E] [Ca2+] 18
Látható, hogy a marha tripszin tízszer erősebben köti a kalciumiont, mint a marha kimotripszin, ami talán magyarázható a szekvencia kedvezőtlen változásával A kimotripszin kalciumion kötési konstansa erősen függ a ph-tól, ph=4-nél már igen kis érték:51 KCa=30M-1 KCa (M-1) 0,92 104 11 104 T = 25 C, ph = 6,59 Kimotripszin Tripszin 12 táblázat A tripszin és a kimotripszin terbium-lumineszcenciával meghatározott kalciumion kötési konstansa50 110 ábra A Ca2+ kötődése a tripszin szerkezetében 19
111 ábra A tripszin Ca2+ kötő régiója vázlatosan45 A Ca2+-ion Delaage és munkatársai szerint52 hatással van a kimotripszin molekula stabilitására is A guanidin-hidroklorid és karbamid denaturáló szerekkel szemben mutatott konformációs stabilitás növekedését tapasztalták kalciumion jelenlétében Kísérletük egyik hiányossága, hogy nem biztosították a kalciumion hiányát komplexképző szer használatával Eredményeik azért sem egyértelműek, mert olyan magas enzimkoncentrációt alkalmaztak, amelynél jelentős mértékű autolízis játszódik le a kísérletek időtartama alatt Mivel nem zárták ki az autolízis hatását, nem tudjuk biztosan, hogy a kalciumion hatására valóban növekszik az enzim stabilitása, vagy az észlelt eltérést csak az autolízis sebesség változása okozza A kalciumion kimotripszinre gyakorolt további hatásait is kimutatták Aune és munkatársai igazolták, hogy a Ca2+ csökkenti az α-kimotripszin dimerizációját53 Fioretti és csoportja pedig kimutatta, hogy kation kötődése olyan konformációs változásokat indít el a kimotripszin makromolekulás inhibitorokkal alkotott komplexeiben, amelyek csökkentik a komplexek stabilitását54 20
13 Célkitűzések Összegezve elmondható, hogy az ön-inaktiválódás sebességét a Ca2+ jelenléte jelentős mértékben csökkenti A kimotripszin Ca2+ komplexének szerkezete eddig nem ismert, így a Ca2+ kötő régió és az interdomén hurok kölcsönhatásáról nincs szerkezeti információnk Ezen túl a Ca2+ hatása a kimotripszin molekula globális tulajdonságaira: stabilitására, flexibilitására sem kellőképpen tanulmányozott probléma Célul tűztük ki a kalciumion kimotripszinre gyakorolt hatásainak szisztematikus és precíz vizsgálatát Kísérleteimet, az autolízis sebességének minimalizálása érdekében általában alacsony enzimkoncentráció mellett végeztem Eredményeim igazolása érdekében analóg méréseket terveztem az inaktív, így nem autolizáló kimotripszinogénnel is A kalciumion hatásának pontos mérése érdekében, a kalciumion nélküli méréseknél az esetleg nyomokban előforduló Ca2+ ionokat komplexképzővel megkötöttem Megismételtem az önemésztés sebességének irodalomban leírt mérését a saját kísérleti rendszeremben Kíváncsiak voltunk arra, hogy a kalciumion valóban hatással van-e az enzim konformációs stabilitására, ezért precízen végrehajtott guanidin-hidroklorid indukált letekeredési kísérleteket végeztem kalciumion jelenlétében és hiányában, amelyeket triptofán-fluoresszenciával követtem A kalciumion hatását az enzim hőstabilitására differenciális pásztázó mikrokalorimetriával (DSC) vizsgáltam Felmerült továbbá a kérdés, hogy milyen hatása lehet a Ca2+-nak az enzim katalitikus aktivitás szempontjából kulcsfontosságú flexibilitására Ez utóbbi kérdést Fouriertranszformációs infravörös spektroszkópiával követett hidrogén/deutérium izotópkicserélődés módszerével és 1H-NMR spektroszkópiával vizsgáltam Célunk továbbá a Ca2+-kimotripszin komplex háromdimenziós szerkezetének meghatározása röntgen diffrakciós módszerrel E szerkezet birtokában megcáfolhatatlan bizonyítékkal szolgálhatunk a kalciumion kötődés pontos helyét illetően és megismerhetjük az észlelt effektusok szerkezeti alapjait, okait 21
2 A felhasznált módszerek elmélete 21 Autolízis sebesség mérése Több kutatócsoport eredményei arra utaltak, hogy a kimotripszin önemésztésének sebességét a Ca2+-ion jelenléte jelentős mértékben csökkenti Ennek szemléltetése érdekében megvizsgáltam az autolízis sebességét kalciumion jelenlétében és hiányában Fluoreszcenciás szubsztráton mértem az enzimaktivitás változását az idő függvényében Feltételeztem, hogy a mért enzimaktivitás egyenesen arányos az oldat enzimkoncentrációjával, vagyis úgy tekintettem, hogy az interdomén hurok hasítása után keletkező köztitermékek nem rendelkeznek enzimatikus aktivitással Ez a feltevés azért jogos, mert ilyen intermedierek legfeljebb néhány percig létezhetnek a kísérlet körülményei között A különböző időpontokban mért enzimaktivitást (enzimkoncentrációt) a kiindulási értékhez viszonyítva százalékosan adtam meg Az autolízis során olyan termékek is keletkeznek, amelyek inhibítorként hatnak a natív enzimen, védik az enzimet a további inaktiválódástól, így a reakció előrehaladtával a reakciósebesség csökken E miatt azoknak az adatoknak a kiértékelése, amikor az autolízis 70%-nál nagyobb fokú, komplikált, ezért felhasználásuk nem célszerű Kumar és Hein vizsgálatai37 kimutatták, hogy kísérletünk körülményei között, az önemésztés másodrendű kinetikát követő, bimolekulás reakció: 2E P Ilyen reakciók sebességi egyenlete: v = d[e]/dt = - k[e]2 alakú, ahol v a reakciósebesség, [E] az enzim koncentrációja adott időpillanatban, t az idő és k a sebességi állandó A változók szeparálása után az egyenlet integrálható, ekkor a [E] = 1/(1/[E]0 + k t) alakú integrált sebességi egyenletet kapjuk, amelyben [E]0 a kiindulási enzimkoncentráció A sebességi egyenletek integrált alakjának felhasználásával a reakciórend és a sebességi állandó (k) igen pontosan számítható A reakciórend meghatározásához elvégezzük több lehetséges reakciórendnek megfelelő integrált sebességi egyenlet illesztését a mért adatsorra, 22
és a legjobban illeszkedőt fogadjuk el A sebességi állandó (k) értékét pedig az illesztett görbe megfelelő paramétere nagyon pontosan megadja Esetünkben, az irodalmi adatoknak megfelelően, a másodrendű kiintegrált sebességi egyenlet illeszkedett a legjobban a mért pontokra Ezért adatsoraimra [E] = 1/(1/[E]0 + k t) egyenletű görbéket illesztettem az Origin 50 program segítségével 22 Triptofán-fluoreszcenciával követett guanidin-hidroklorid indukált legombolyodás Az enzimek felgombolyodott állapotának konformációs stabilitása gyakorlati szempontból fontos tulajdonságuk, ugyanis általában ez az a tényező, amely felhasználhatóságukat leginkább korlátozza Vizsgálatakor azt kell megbecsülnünk, hogy adott (általában fiziológiás) körülmények között mennyivel stabilabb egy enzim felgombolyodott (natív) konformációja, mint a legombolyodott Ez úgy történik, hogy előidézzük a legombolyodási folyamatot, és meghatározzuk egyensúlyi állandóját (K) és szabadentalpia változását ( G) Az ilyen kísérletekből a fehérje konformációs stabilitása mellett többek között következtetéseket vonhatunk le a legombolyodás mechanizmusára és a fehérje szerkezetére vonatkozóan Kifejezetten alkalmas a módszer kis mértékben eltérő fehérjék stabilitásának összehasonlító vizsgálatára, ami segít a konformációt meghatározó erők alapos megértésében, optimális stabilitású enzimek tervezésében A legombolyodási folyamatot előidézhetjük a hőmérséklet emelésével, vagy úgynevezett denaturáló szerekkel Utóbbiak előnye, hogy a folyamat a legtöbb fehérje esetén reverzibilisnek tekinthető, mechanizmusa jobban közelíti a jól definiált két-állapotú viselkedés esetét, valamint, hogy a méréseket valódi egyensúlyi rendszerben végezzük így az eredmények könnyebben értelmezhetők A hőmérséklet indukált letekeredés követésére ideális eszköz a kalorimetria, amivel a 23 fejezetben foglalkozom A denaturáló szerek közül legkedveltebb a karbamid, de gyakran használják az egyébként erélyesebb guanidin-hidrokloridot is A legombolyodási folyamat követésére minden olyan módszer használható, amely valamely, a legombolyodáskor megváltozó fizikai paraméterét méri a fehérjének Így felhasználható többek között az UV-, CD-, fluoreszcencia-, NMR-spektroszkópia, de mérhetjük a makromolekula biológiai aktivitását is Kis anyagigénye miatt leggyakrabban fluoreszcencia méréssel követik a legombolyodási kísérleteket Munkám során a kalciumionnal komplexált 23
és kalciumiont nélkülöző kimotripszin és kimotripszinogén konformációs stabilitásának összehasonlítására GdnHCl által kiváltott denaturációs kísérleteket végeztem triptofánfluoreszcenciával követve, a spektrum emissziós maximumának eltolódása alapján 221 Guanidin-hidroklorid indukált legombolyodás A Guanidin-hidroklorid (GdnHCl) az karbamid mellett a második leggyakrabban használt denaturáló szer, amelyet natív szerkezetű fehérjék reverzibilis legombolyítására használnak Működési mechanizmusára még nem született általánosan elfogadott elmélet, az azonban bizonyos, hogy közvetlenül a fehérjemolekulával hat kölcsön, és csökkenti a hidrofób kölcsönhatásokat, amelyek döntő szerepet játszanak a fehérje harmadlagos szerkezetének rögzítésében55 A mérések megkezdése előtt fontos megbizonyosodni arról, hogy a vizsgált legombolyodási folyamat reverzibilis, vagy legalábbis jó közelítéssel annak tekinthető, hiszen termodinamikai vizsgálatot végzünk Ezután a fehérjét különböző denaturáló szer koncentrációjú oldatokba juttatjuk Legalább 15 oldatot érdemes készíteni a 0-6 M GdnHClkoncentráció tartományban, így 15 pontot mérve, már lehetővé válik a legombolyodási-görbe precíz kiértékelése Az oldatok összeállítása után meg kell várni, hogy a reakció egyensúlya beálljon Ha megbizonyosodtunk az egyensúly eléréséről, megmérjük a választott fizikai paraméter értékét az összes oldatban Ezeket az értékeket a GdnHCl-koncentráció függvényében ábrázolva szigmiod görbéket kapunk Példaként lásd a 21 ábrát emissziós maximum (nm) 360 355 350 345 340 0 1 2 3 4 5 [GdnHCl] (M) 21 ábra Egy tipikus, GdnHCl denaturáló szerrel kiváltott legombolyodási-görbe A görbék kiértékelésekor Pace módszerének56,57,58 kissé módosított változatát alkalmaztuk Pace nyomán feltételeztük, hogy a legombolyodási folyamat két-állapotú, vagyis, hogy minden GdnHCl-koncentráció esetén (a görbe minden pontján) a fehérje csak 24
tökéletesen felgombolyodott és a teljesen legombolyodott konformációban van jelen az oldatban számottevő koncentrációban E feltételezést alátámasztja az a tapasztalat, hogy a legtöbb kisméretű globuláris fehérje jó közelítéssel két-állapotú mechanizmus szerint gombolyodik le Két-állapotú viselkedés esetén minden denaturáló szer koncentrációnál (x) fn(x) + fd(x) = 1, ahol fn a natív és fd a denaturált fehérje aránya Jelöljük y-nal a mért értéket, akkor a görbe minden egyes pontján y(x) = ynfn(x) + ydfd(x), ahol yn és yd a natív, illetve a denaturált fehérjére vonatkozó értékei a mért fizikai paraméternek olyan körülmények között ahol y-t is mérjük Meghatározásuk a görbe átalakulás előtti, illetve átalakulás utáni lineáris szakaszának meghosszabbításával (extrapolálásával) történik Fenti egyenletekből kifejezhető a reakció egyensúlyi állandója: K(x) = fd(x)/fn(x) = fd(x)/(1-fd(x)) = (yn-y(x))/(y(x)-yd) Mivel a mért pontokra a következő egyenletű szigmoid görbe illeszthető: y(x) = [(yn-yd)/(1+en(x-x0))]+yd, az egyensúlyi állandóra a fenti két egyenletből K(x) = en(x-x0) adódik Ebből pedig számolható a denaturációs folyamatot kísérő szabadentalpia változás G G(x) = -RTlnK(x) = -RTln [{yn-y(x)}/{y(x)-yd}] = -RTn(x-x0) = RTnx0 - RTnx szerint minden egyes x érték esetére, ahol R az egyetemes gázállandó és T az abszolút hőmérséklet Az előbbi egyenletben a kisebbítendő RTnx0 = G(H2O), ami a denaturáló szer mentes állapotra vonatkozó G érték, a stabilitás jellemzésére általában ezt használjuk Emellett használható még az inflexiós ponthoz tartozó denaturáló szer koncentráció értéke is, nagyon hasonló fehérjék stabilitásának összehasonlítására A fenti egyenletek értelmében a G - denaturáló szer koncentráció (x) függvény lineáris: G(x) = G(H2O) - RTnx Ez valójában közelítés A G denaturáló szer koncentráció függésére három különböző modell használatos,56 amelyek közül a lineáris modell a legegyszerűbb Mivel a denatuációs 25
folyamat mechanizmusa nem ismeretes, nincs ok a bonyolultabb modellek használatára Abban a denaturáló szer koncentráció tartományban, ahol G-t elegendő pontossággal mérni tudjuk, a függés lineáris, ráadásul Schellman59 szerint ez a modell elméletileg is indokolható A mérési pontokra illesztett szigmoid görbe egyenletét a lineáris modellt alapul véve fejeztük ki 222 Triptofán-fluoreszcencia A fluoreszcencia meglehetősen érzékeny a kromofor környezetének változására, mivel a gerjesztett állapotot viszonylag hosszú élettartama alatt sokféle kölcsönhatás befolyásolhatja Ha a gerjesztett állapot változik, az emissziós spektrum is változik (az emissziós maximum helye, intenzitása)60 Ezért a fluoreszcencia spektroszkópia rendkívül hasznos eszköz fehérjék konformációs változásainak vizsgálatában A fehérjék fluoreszcenciáját a fenilalanin, a tirozin és a triptofán oldalláncok okozzák A fenilalanin emissziója ritkán észlelhető, általában a tirozin és a triptofán kevert spektrumát kapjuk, amelyben a triptofán oldalláncok emissziója dominál, elsősorban nagyobb fluoreszcenciás érzékenységük miatt A triptofán-fluoreszcencia szelektíven vizsgálható, ha 295 nm-es, vagy annál nagyobb hullámhosszú gerjesztő fényt alkalmazunk, ekkor ugyanis a tirozin nem abszorbeál A triptofán emissziós maximumának helye a környezet polaritásától függ A spektrum maximuma apoláris, például hexános oldatban 320 nm-nél, míg poláris, vizes oldatban 350 nm-nél van Mivel a fehérje felgombolyodott állapotában a triptofán oldalláncok hidrofób környezetben, legombolyodás után pedig a vizes oldószernek kitett állapotban vannak, legombolyodáskor általában a triptofán-fluoreszcencia spektrum emissziós maximumának a nagyobb hullámhosszak felé tolódását tapasztaljuk61 A legombolyodási folyamat tehát követhető a triptofán emissziós spektrum maximumhelyének meghatározásával Mivel a fluoreszcencia érzékeny a hőmérsékletre, hő indukált legombolyodás fluoreszcenciás követése nem javasolt Denaturáló szerek által kiváltott legombolyodás követésére viszont ez a leggyakrabban használt módszer A denaturáló szerek koncentrációja is hatással van azonban az oldat emissziójára, emiatt szükséges fehérjét nem tartalmazó referenciaoldat spektrumának mérése és levonása a minta spektrumából 26
23 Differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) A kémiai folyamatok végbemeneteléhez szükséges hőmennyiség egyike a legfontosabb termodinamikai mennyiségeknek, értékéből a többi termodinamikai paraméter mind számítható A hőelnyelés legegyszerűbben kalorimetriásan mérhető A differenciális pásztázó mikrokalorimetria rendkívül fontos eszköz egy biokémikus számára, mivel sok termodinamikai és kinetikai információt szolgáltat a biológiai makromolekulák (fehérjék, nukleinsavak) minden hő hatására végbemenő, vagy hőváltozással járó folyamatáról Alkalmazzák natív térszerkezetű biopolimerek hőmérséklet-növekedés okozta legombolyodásának (unfolding) és hő hatásával szemben mutatott stabilitásának vizsgálatára Mivel a biopolimerek térszerkezetének megváltozását a termodinamikai paraméterek értékének megváltozása kíséri, domének jelenléte, alegységek közötti kölcsönhatások, szubsztrátok, effektorok kötődése, ligandummal való titrálás, mutációk mind hatással vannak a DSC görbére, kalorimetriásan tanulmányozhatók Munkám során a technikát a kalciumionnal komplexált és kalciumion mentes kimotripszin hőstabilitásának összehasonlítására használtam A mérés elve, hogy a minta és egy ismert referenciaanyag hőkapacitás-különbségét mérjük egy adott hőmérséklet-tartományban folytonos fűtés, illetve hűtés mellett, állandó nyomáson A minta és a referencia egymástól és a környezettől adiabatikusan el van szigetelve Mivel a konstans nyomáson mért hőkapacitás az entalpia-függvény hőmérséklet szerinti deriváltja Cp(T) = ( H/ T)p, a mért Cp(T) függvényből az entalpia, meghatározható: H(T) = H(T0) + T Cp(T)dT 27
22 ábra Kisméretű globuláris fehérje hőkapacitásgörbéje A besatírozott terület a hőabszorpciós folyamathoz tartozó entalpia A natív állapotú globuláris fehérjék kooperatív erők által összetartott molekulák, amelyek hőkapacitás-görbéje rendszerint éles csúcsot tartalmaz (22 ábra), szemben a nem kooperatív erők által összetartott, natív térszerkezetüket fokozatosan elvesztő biopolimerekkel, amelyek monoton növekvő hőkapacitás-függvénnyel rendelkeznek A hőindukált konformációs átalakulás (általában, de nem minden esetben letekeredés) entalpiája, az előbbi egyenlet értelmében a hőkapacitás-görbe alatti területtel (Qt) egyenlő62 Meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy a natív és a denaturált állapotú fehérje hőkapacitás értékei eltérnek egymástól, ami elsősorban az apoláris csoportok felszínre kerülésével, hidratálódásával indokolható Az úgynevezett kalorimetrikus entalpiaváltozás: Hcal = Qt/n, ahol n az anyagmennyiség Az így kapott Hcal felhasználható többek között a hődenaturációs folyamat mechanizmusának vizsgálatára Ugyanis egylépcsős folyamat (a natív és a denaturált állapotokon kívül a rendszer nem vesz fel egyéb, metastabilis közbülső állapotokat) esetére a van t Hoff-törvény felhasználásával az entalpiaváltozás elméleti úton számolható, és ezzel összehasonlítva a mért Hcal értéket megmondható, hogy a folyamat egy- vagy többlépcsős Abból, hogy a hőindukálta letekeredés milyen hőmérsékleten megy végbe, következtethetünk a makromolekula illetve molekula-komplex stabilitására A stabilitásról így szerzett információ közvetett, de nagyon hasonló rendszerek stabilitásának összehasonlítására felhasználható, ha a termodinamikai paraméterek számítására a hődenaturációs folyamat irreverzibilitása miatt nincs is lehetőség 28
A mérést úgy végezzük, hogy a kaloriméter két egyforma cellája közül az egyikbe referenciaoldatot, másikba a vizsgálandó makromolekula oldatát töltjük A referenciaoldat a vizsgált biopolimeren kívül a mintaoldat minden komponensét azzal megegyező koncentrációban tartalmazza A cellákat adott sebességgel fűtjük (leggyakrabban 1-2 C/perc), egy adott hőmérséklet-tartományt végigpásztázva Folyamatos felfűtés esetén nem állhat be tökéletes termikus egyensúly, de kis fűtési sebesség alkalmazásával megközelíthetjük azt Felfűtés közben a két cella közötti eltérést segéd fűtőkörrel kompenzáljuk, így biztosítjuk, hogy a hőmérsékletük mindvégig megegyezzen A segéd fűtőkör teljesítményét regisztráljuk Ha a mérés előtt kalibráló jelet veszünk fel úgy, hogy ismert teljesítménnyel fűtjük az egyik cellát, e jel nagysága alapján a mérés során regisztrált termogramból számszerű hőkapacitás értékek nyerhetők A cellákban mérés közben állandó nyomást tartunk fenn, így állandó nyomásra vonatkozó hőkapacitás értékeket mérhetünk Mivel a két cella tökéletes egyezését nem tudjuk megvalósítani, a minta mérésekor kapott termogramból le kell vonni egy alapvonalat, amely a két cella közötti különbséget ábrázolja, és úgy mérjük, hogy mindkét cellába a referenciaoldatot öntjük63,64 24 Hidrogén-deutérium izotóp kicserélődés FT-IR spektroszkópiával követve Fehérjék konformációs mozgékonysága (flexibilitása) kísérletileg vizsgálható infravörös spektroszkópiával (vagy NMR-spektroszkópiával) követett hidrogén/deutérium kicserélődés65,66,67 segítségével A módszer lényege, hogy a fehérjét vízmentes, liofilizált állapotban nehézvízben feloldjuk, s ebben a közegben a labilis protonok (elsősorban a peptidgerinc amidprotonjai) deuteronokra cserélődnek A fehérje felszínén lévő protonok szinte azonnal kicserélődnek, az eltemetett, nehezen hozzáférhető protonok azonban csak akkor, ha a szerkezet lokális konformáció változása ("felnyílása") vagy a nehézvíz molekuláknak a szerkezetbe való bediffundálása ezt lehetővé teszi Ez azt jelenti, hogy a kicserélődés e lassúbb fázisának kinetikáját a fehérje konformációs mozgékonysága határozza meg, a kicserélődés sebességéből a globális konformációs mozgékonyságra következtethetünk A kicserélődés folyamata a fehérje infravörös spektruma segítségével követhető, az N-H kötés rezgéséhez tartozó, 1550 cm-1 hullámszámnál található sáv 29