A krónikus enyhe stressz kiváltotta viselkedésváltozások vizsgálata patkányban DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Kompagne Hajnalka Egis Gyógyszergyár NyRt. Viselkedésfarmakológiai Laboratórium Témavezetık: dr. Bárdos György egyetemi docens, a biológiai tudományok kandidátusa, habilitált doktor dr. Lévay György fıosztályvezetı-helyettes, az orvostudományok kandidátusa Biológia Doktori Iskola Vezetıje: dr. Erdei Anna, az MTA doktora, egyetemi tanár Idegtudomány és humánbiológia Doktori Program Programvezetı: dr. Détári László, tanszékvezetı egyetemi tanár Budapest, 2008.
Bevezetés A depresszió magas prevalenciájú, heterogén tünetekkel jellemezhetı betegség. Etiológiája és patofiziológiája nagyrészt feltáratlan, ezért állatkísérletes modellezése is nehéz. A jelenleg használatos modellek többsége stresszalapú, mert feltételezzük, hogy a stressz és a depresszió között ok-okozati összefüggés van. Ezt a feltételezést a szorongásos zavarok és a depresszió gyakori komorbiditása is megerısíti. A kevert szorongás-depresszió zavar fogalmának bevezetésén kívül egyes szerzık feltételezik, hogy szorongás és depresszió kapcsolata szekvenciális jellegő: a magas szorongási szint a depresszió rizikófaktora lehet (Anisman és Zacharko 1982, Brown 1993). A krónikus enyhe stressz (CMS) patkányokban rontja a jutalmazó rendszer szenzitivitását, így például az állatok kevesebbet isznak az általuk kedvelt édes íző cukoroldatból (Willner és mtsai 1987). A krónikus enyhe stressz hatására nemcsak az édes íz iránti preferencia csökkent, de romlott az állatok asszociációs képessége olyan helyzetekben, amikor a helyet valamilyen jutalommal kellett társítani (Benelli és mtsai 1999, D Aquila és mtsai 1997, Valverde és mtsai 1997). Az averzív helykondicionálásra nem volt hatással (Papp 1996). A jutalom iránti csökkent reakciót Willner és munkatársai az anhedónia, a humán depresszió egyik vezetı tünete megfelıjének tekintették (Willner és mtsai 1987). Mivel a stressz szerepet játszhat a depresszió kialakulásában (Lloyd 1980, Anisman és Zacharko 1982), a CMS modell megfelelı konstruktív validitással bír. A CMS számos fiziológiai és viselkedési változást okozhat. Porond tesztben csökkent (Gorka és mtsai 1996, Grippo és mtsai 2003) és fokozódó aktivitást is leírtak (Harris és mtsai 1997, Gronli és mtsai 2005, Mineur és mtsai 2006). Több kutatócsoport is a depressziószerő állapot jelének tekintette, hogy CMS hatására az egerek szırzetének állapota romlott, ezt a hatást azonban ellensúlyozni lehetett krónikus antidepresszáns kezeléssel (Griebel és mtsai 2002, Pothion és mtsai 2004). Megfigyelték az alvási mintázat megváltozását, pl. a REM-alvás meghosszabbodását, az alvás töredezettebbé válását (Gronli és mtsai 2004). A cirkadián ritmus fáziseltolódása (Gorka és mtsai 1996), a szexuális funkciók károsodása és az agresszió csökkenése is jellemzı a CMS után (Pardon és mtsai 2000, Gambarana és mtsai 2001). Depressziós betegekre jellemzı lehet a kognitív funkciók romlása, amit szintén megfigyeltek krónikus enyhe stressznek kitett egereken (Song és mtsai 2006). Számos neurokémiai változás figyelhetı meg a CMS eredményeként mind egereken, mind patkányokon (Bekris és mtsai
2005, Song és mtsai 2006, Gronli és mtsai 2007). A felsorolt adatok alátámasztják a modell tüneti validitását. A legtöbb neurokémiai és viselkedésváltozás visszafordítható klinikailag hatékony antidepresszánsok krónikus adagolásával, míg az akut kezelés erre nem képes (Moreau és mtsai 1993, Papp és mtsai 1996, Sluzewska és Szczawinska 1996, Millan és mtsai 2001). A nem antidepresszáns hatású anyagok nem hatékonyak a modellben (Willner 2005), ami azt jelzi, hogy a prediktív validitás is megfelelı. Több kutatócsoport is vizsgálta a CMS hatását a szorongásszerő viselkedésre, hiszen a szorongás fontos jellemzıje lehet a depressziónak. Az eredmények azonban meglehetısen ellentmondásosak. A szorongás fokozódásáról (Griebel és mtsai 2002, Maslova és mtsai 2002) és csökkenésérıl (D Aquila és mtsai 1994, Kopp és mtsai 1999, Ducottet és mtsai 2003) is vannak adatok. Célkitőzések A CMS modell konstruktív validitását szerettük volna javítani néhány, az irodalomban elfogadott elvek szerinti módosítással. A módosított procedúrát a cukorfogyasztás monitorozásával validáltuk. Különbözı tesztekben vizsgáltuk, hogy változik-e a patkányok viselkedése CMS hatására. Vizsgáltuk, hogy van-e olyan viselkedés, amelynek változása összefügg a hedonikus értékeléssel, vagyis depressziószerő tünetként értelmezhetı. Vizsgáltuk, hogy mennyire tartósak a CMS hatására kialakuló viselkedésváltozások. Vizsgáltuk, hogy hogyan befolyásolja a CMS hatására kialakult viselkedésváltozásokat krónikus fluoxetin és akut diazepam kezelés. Vizsgáltuk, hogy változik-e a zsigeri érzettársítás a CMS hatására. Alkalmazott módszerek A kísérleteket 190-200, illetve 240-260 g tömegő, hím Wistar patkányokon végeztük. A krónikus enyhe stressz során napi 2-3 nem fájdalmas, önmagában viselkedésváltozást nem okozó stresszort alkalmaztunk. Éheztetés és szomjaztatás nem szerepelt a protokollban.
A hedonikus értékelést rövid deprivációt követı kétpalackos itatási teszttel vizsgáltuk. A viselkedésváltozásokat emelt keresztlabirintus (Pellow és mtsai 1985), erıltetett úszás (Porsolt és mtsai 1978), szociális elkerülés (Haller és Bakos 2002) és grooming tesztben vizsgáltuk a stresszt követıen különbözı idıpontokban. A zsigeri érzettársítás változásának vizsgálatához kétpalackos preferencia tesztet végeztünk, illetve vizsgáltuk a patkányok ivási viselkedésének idıbeli alakulását. A krónikus enyhe stressz ideje alatt megpróbáltuk kiépíteni a szatiációs diszkomfort és egy korábban semleges íz asszociációját. Az érzettársítást egypalackos és kétpalackos ivási tesztekben vizsgáltuk. Eredmények A módosított protokoll hatására a CMS állatok abszolút cukorfogyasztása és cukorpreferenciája csökkent a kontrolléhoz és saját alap cukorfogyasztásukhoz és cukorpreferenciájukhoz képest. A CMS hatására az állatok súlygyarapodása lelassult. A CMS állatok anxiolitikus-szerő viselkedést mutattak az emelt keresztlabirintus tesztben. A Porsolt tesztben a CMS állatok kevésbé voltak aktívak, mint a kontrollok. A szociális elkerülés tesztben a CMS állatok visszahúzódóbbak voltak, mint a kontrollok. A grooming tesztben a CMS állatok szorongásszerő viselkedést mutattak. A szociális elkerülés tesztben mért viselkedés és a hedonikus értékelés között szignifikáns pozitív korrelációt mutattunk ki. A többi viselkedésváltozás és a hedonikus értékelés között nem volt ilyen összefüggés. A CMS hatása a szociális elkerülés tesztben még 21 nappal a stressz után is mérhetı, a grooming viselkedésben 10 nap után még megfigyelhetı különbség CMS és kontroll állatok között, de a 21. napra a viselkedés normalizálódik. Az emelt keresztlabirintus és a Porsolt tesztekben nem tudtuk megbízhatóan vizsgálni a rehabilitáció hatását, valószínőleg azért, mert ezekben a tesztekben mind a kontroll, mind a CMS csoportok nagyon különbözı értékeket vehetnek fel. A fluoxetin antidepresszáns hatása a szociális elkerülés és a Porsolt tesztekben volt kimutatható. A CMS hatására megváltozott viselkedésre a diazepam a szociális elkerülés és a grooming tesztben gyakorolt hatást.
Sem a kontroll, sem a CMS csoportban nem alakult ki érzettársítás a szatiációs diszkomfort és az adagolt íz között. A CMS csoporton belül anhedonikusnak tekintett állatokban kétpalackos módszerrel kimutatható volt a negatív alliesztézia. Következtetések A módosított CMS protokoll ugyanúgy alkalmas anhedónia kiváltására, mint az eredeti módszer. Az anhedónia kialakulásához nem szükséges táplálék- és folyadékmegvonás. A cukorpreferencia alkalmasabb mérıszáma lehet a hedonikus értékelés változásának, mint az abszolút cukorfogyasztás. Módszerünk már egy hét után is a hedonikus érték csökkenését eredményezte, de a stabil hatás érdekében a három hetes stresszelést tartjuk optimálisnak. Elsıként állapítottuk meg, hogy a hedonikus értékelés változása pozitív korrelációt mutat a szociális elkerülés tesztben megfigyelhetı változással, azaz az az állat, amelyiknek hedonikus értékelése romlott a CMS következtében, visszahúzódóbb viselkedést mutatott szociális helyzetben. Ennek alapján azt gondoljuk, hogy a szociális elkerülés depressziószerő tünet lehet patkányban, legalábbis a krónikus enyhe stresszt követıen. Ez a feltételezés összhangban van a humán betegségben megfigyelhetı viselkedéssel. A többi viselkedéselem és a hedonikus értékelés között nem volt szignifikáns korreláció, vagyis nem bizonyítható (de természetesen nem is cáfolható), hogy ezek változása a depressziós állapot kialakulását jelezné. A krónikus enyhe stressz hatása idıtartamát tekintve is eltérı a vizsgált tesztekben. Az eredmények alapján a szociális elkerülés teszt és a grooming teszt megbízhatóbban méri a krónikus enyhe stressz viselkedési kimeneteit, mint az emelt keresztlabirintus vagy a Porsolt teszt. Az utóbbi két tesztben valószínőleg nem olyan erıteljes a CMS hatása, mint a szociális elkerülés és a grooming tesztben, ráadásul az egyedek viselkedése is nagyobb varianciát mutatott. A szociális elkerülés tesztben megfigyelt
tartós hatás ismét megerısíti a depresszió és a szociális deficitek közötti kapcsolat kutatásának fontosságát. A krónikus enyhe stressz után szociális elkerülés tesztben és Porsolt tesztben valószínőleg vizsgálhatóak antidepresszáns hatású anyagok, míg a többi viselkedésteszt erre kevésbé tőnik alkalmasnak. Természetesen ennek eldöntéséhez további vizsgálatok szükségesek. Az itatásos kísérletekben megfigyeltük, hogy az anhedonikussá váló állatok hasonló viselkedést mutattak, mint az izoláltan, ingerszegény környezetben tartott állatok. Ezt a jelenséget értékelhetjük a szociális deficit és a depresszió összefüggésének újabb jeleként. Az itatásos kísérletek eredménye szerint az anhedonikussá váló állatok érzettársítása megváltozott. Ennek alapján elképzelhetınek tartjuk, hogy a késıbbiekben kifejleszthetı lesz egy olyan állatkísérletes modell, amellyel a depressziót, depresszív hangulatot kísérı nemspecifikus tüneteket is vizsgálni lehet. Irodalomjegyzék Anisman H, Zacharko RM Depression: The predisposing influence of stress Behavi Brain Sci 5:89-137 (1982) Bekris S, Antoniou K, Daskas S, Papadopoulou-Daifoti Z Behavioural and neurochemical effects induced by chronic mild stress applied to two different rat strains Behav Brain Res 161: 45-59 (2005) Benelli A, Filaferro M, Bertonili A, Genedani S Influence of S-adenosyl- L -carnitine on chronic mild stress-induced anhedonia in castrated rats Br J Pharmacol 127: 645 654 (1999) Brown GW Life events and affective disorder: replications and limitations Psychosom Med (1993) 55(3): 248-59. D Aquila P, Brain PF, Willner Effects of chronic mild stress on performance in behavioural tests relevant to anxiety and depression Physiol Behav 56: 861 867 (1994)
D Aquila P, Monleon S, Borsini F, Brain P, Willner P Anti-anhedonic actions of the novel serotonergic agent flibanserin, a potential rapidlyacting antidepressant Eur J Pharmacol 340: 121 132 (1997) Ducottet C, Griebel G, Belzung C Effects of the selective nonpeptide corticotropin-releasing factor receptor 1 antagonist antalarmin in the chronic mild stress model of depression in mice Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 27: 625-631 (2003) Gambarana C, Scheggi S, Tagliamonte A, Tolu P, De Montis MG Animal models for the study of antidepressant activity Brain Res Protoc 7: 11 20 (2001) Gorka Z, Moryl E, et al. Effect of chronic mild stress on circadian rhythms in the locomotor activity in rats Pharmacol Biochem Behav 54(1): 229-34 (1996) Griebel G, Simiand J, Steinberg R, Jung M, Gully D, Roger P, Geslin M, Scatton B, Maffrand JP, Soubrie P 4-(2-Chloro-4-methoxy-5-methylphenyl)-N-[(1S)-2-cyclopropyl-1-(3-fluoro-4- methylphenyl)ethyl]5-methyl-n-(2-propynyl)-1,3-thiazol-2-amine hydochloride (SSR125543A), apotent and selective corticoreophin-releasing factor(1) receptor antagonist. II. Characterization in rodent models of stress-related disorders Pharmacol Exp Ther 30: 333 345 (2002) Grippo AJ, Beltz TG, Johnson AK Behavioral and cardiovascular changes in the chronic mild stress model of depression Physiol Behav 78:703-710 (2003) Gronli J, Murison R, Bjorvatn B, Sorensen E, Portas CM, Ursin R Chronic mild stress affects sucrose intake and sleep in rats Behav Brain Res 150: 139-147 (2004) Gronli, J, Murison R, Fiske E, Bjorvatn B, Sorensen E, Portas CM, Ursin R Effects of chronic mild stress on sexual behavior, locomotor activity and consumption of sucrose and saccharine solutions Physiol Behav 84 571-577 (2005) Gronli J, Fiske E, Murison R, Bjorvatn B, Sorensen E, Ursin R, Portas CM Extracellular levels of serotonin and GABA in the hippocampus after chronic mild stress in rats. A microdialysis study in an animal model of depression Behav Brain Res 181:42-51 (2007) Harris RB, Zhou J, Youngblood BD, Smagin GN, Ryan DH Failure to change exploration or saccharin preference in rats exposed to chronic mild stress Physiol Behav 63(1):91-100 (1997)
Llyod C Life events and depressive disorder reviewed. II. Events as precipitating factors Arch Gen Psychiatry 37:541-8 (1980) Maslova LN, Bulygina VV, Markel AL Chronic stress during prepubertal development: Immediate and long-lasting effects on arterial blood pressure and anxiety-related behavior Psychoneuroendocrinology 27: 549 561 (2002) Millan M, et al. S33005, a novel ligand at both serotonin and norepinephrine transporters: II. behavioral profile in comparison with venlafaxine, reboxetine, citalopram and clomipramine J Pharmacol Exp Ther 298:581-591 (2001) Mineur YS, Belzung C, Crusio WE Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice Behav Brain Res 175:43-50 (2006) Moreau JL, Jenck F, Martin JR, Mortas P, Haefely WE Effects of moclobemide, a new generation reversible MAO-A inhibitor, in a novel animal model of depression Pharmacopsychiatry 26:30-33 (1993) Papp M, Moryl E, et al. Pharmacological validation of the chronic mild stress model of depression Eur J Pharmacol 296(2): 129-36 (1996) Pardon MC, Gerardin P, Joubert C, Perez-Diaz F, Cohen-Salmon C Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal care behavior in mice Biol Psychiatr 47: 858 863. (2000) Pothion S, Bizot JC, Trovero F, Belzung C Strain differences in sucrose preference and in consequences of unpredictable chronic mild stress Behav Brain Res 155: 135-146 (2004) Sluzewska A, Szczawinska K Lithium potentiation of antidepressants in chronic mild stress model of depression in rats Behav Pharmacol 7 [Suppl 1]:86 (1996) Song L, Che W, Min-Wei W, Murakami Y, Matsumoto K Impairment of the spatial learning and memory induced by learned helplessness and chronic mild stress Pharmacol Biochem Behav 83(2): 186-93 (2006) Valverde O, Smadja C, Roques BP, Maldonando R The attenuation of morphine-conditioned place preference following chronic mild stress is reversed by a CCKB receptor antagonist Psychopharmacology 131:79-85 (1997)
Willner P, Towell A, et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant Psychopharmacology 93(3): 358-64 (1987) Willner P Chronic mild stress (CMS) revisited: consistency and behavioural-neurobiological concordance in the effects of CMS Neuropsychobiology 52(2): 90-110 (2005) Saját publikációk a dolgozat témakörébıl Kompagne H, Bárdos Gy, Szénási G, Gacsályi I, Hársing GL, Lévay Gy Chronic mild stress generates clear depressive but ambigous anxiety-like behaviour in rats Behav Brain Res, in press, DOI: 10.1016/j.bbr.2008.06.008 Bárdos G, Móricz K, Haraszti H Discomfort: not pain but still unpleasant feelings from the gut Acta Biol Hung 53: 423-433 (2002)