Nehézfém nanopartikulumok magatartás- és neurotoxikológiai hatásai állatkísérletes modellekben Nagymajtényi László SZTE ÁOK Népegészségtani Intézet Velence, 2013. október 16.
Porártalmak Kémiai kóroki tényező Porképződéssel járó munkakörök bányászat fémipar üveggyártás porcelángyártás faipar mezőgazdaság stb. Porok egészségkárosító hatása függ expozíciós idő koncentráció kémiai, fizikai tulajdonság szemcse alakja szemcse mérete ülepedő por (>10 µm) lebegő por (1-10 µm) nanorészecskék (<100nm) Eredet Nano-részecskék természetes kőzetek hő okozta mállása vulkáni tevékenység erdőtűz mesterséges égetés - fosszilis tüzelőanyagok diesel motorok fémek megmunkálása - kohászat, hegesztés, csiszolás nanotechnológiai termékek előállítása Sajátosságok 1nm-100nm tömegükhöz képest jelentős felület és darabszám biológiai aktivitás lerakódás határoló hártyákhoz való viszony
A nanorészecskék humán egészségkárosító hatásai Epidemiológia - foglalkozási, környezeti, lakossági (kozmetikumok -Ti,Zn) - UK - 1 millió dolgozó - EU - Határértékek (?), mérési lehetőségek - The recent EU definition of nanomaterials will be considered by current and future legislation - The growing importance of the nano sector for the economy and for innovation is recognised - Risk assessment can be conducted with current methods but more research is required (e.g. testing methods/protocols; nano vs bulk form) (Forrás: NanoSight Webinar) ~800.000 (+400.00) hegesztő - Al, Cd, Cr 3x,6+, Cu, F, Fe, Pb, Mn, Mg, Mo, Ni, Si, Ti, Zn; (CO, CO 2, NO, NO 2, O 3 ) - UV, IR; hő, zaj, vibráció - pulmonaris funkció, asthma, pneumonitis, pneumoconiosis, fibrosis, tumor neurofunkcionális hatások manganizmus diesel kipufogógáz - nanoparticulumok, gázok, (NO 2, CO, CO 2 stb.) szénhidrogének - légzőrendszeri és szisztémás hatás - olfactorius rendszer - oxidatív stress - légúti gyulladásos folyamat - neurológiai folyamatok (kognitív hatások)
Mangán (Mn) Kadmium (Cd) Esszenciális mikroelem enzim kofaktor (MnSOD, glutamin szintetáz) Foglalkozási expozíció fémipari folyamatok szárazelem gyártás acélgyártás hegesztés festékgyártás/használat Lakossági expozíció MMT (metilciklopentadienil-mntrikarbonil) fungicidek (Maneb, Mancozeb) Toxicitás - KIR manganizmus myoclonus megváltozott EEG és kérgi kiváltott potenciálok Foglalkozási expozíció - akkumulátor gyártás; galvanizálás - hegesztés - festék pigmentek - műanyag stabilizálók - réz, ólom cink bányászat - fém ötvözetek Lakossági expozíció - táplálkozás (gabona félék; máj, vese) - dohányzás (1-2 ug Cd/cigeretta szál) Toxicitás - KIR - amyotrophias lateralis sclerosis - nervus opticus károsodás - peripherias polyneuropathia - striatalis pályák sérülése - megváltozott vizuális és akusztikus kiváltott potenciálok - viselkedés zavarok
Ólom (Pb) Foglalkozási expozíció fém, üveg, kerámia ipar akkumulátor gyártás festékek Lakossági expozíció ólmozott benzin horgászok, vadászok dohányzás Toxicitás - KIR - csökkent tanulási képesség - hallás és egyensúly érzékelés zavara - peripherias polyneuropathia - ideg vezetési sebesség csökkenés Vas (Fe) Biológiai szerep - haemoglobin, mioglobin - enzimek kofaktora (citokróm) - neurotranszmitter-szintézis - myelogenezis - transzport mechanizmus (transzferrin, DMT-1) Foglalkozási expozíció - kohászat, acélgyártás, hegesztés - járműipar - elektronika - orvosbiológiaás (célzott terápia, diagnosztika) Toxicitás - túlzott bevitel - lerakódás - energiatermelés zavara - ROS képződés - oxidatív stressz - lysosoma degradáció - sejthalál - KIR - Parkinson- és Alzheimer-kór, SM, epilepszia - demielinizáció - AUD KP - Nano - mikrovaszkuláris permeabilitás nő - membránsérülés
Célkitűzések A humán expozíció modellezése - Bevitt anyag formája szerint oldat NP - Kezelési mód szerint per os intranasalis intratracheális - Dózis szerint - Önálló adagolás és kombinációk szerint A dózis-hatás összefüggések megállapítása - általános toxikológiai hatások (testtömeg, szervtömeg stb.) - elektrofiziológiai változások - magatartási változások
Az alkalmazott nanorészecskék Mangán Ólom Kadmium SZTE TTIK Alkalmazott és Környezeti Kémiai Tanszék
Anyagok és módszerek Per os kezelés Intranasalis kezelés Intratracheális instilláció
Anyagok és módszerek Elektrofiziológia - agykéreg Preparálás altatás (uretán ip. 1000 mg/kg) agy feltárása elektródok elhelyezése primer szomatoszenzoros (SS) vizuális (VIS) auditív (AUD) kérgi mezőkre Regisztrálás Spontán kérgi aktivitás (ECoG) Kérgi kiváltott válaszok - latencia, amplitudó, időtartam SS: 50 stimulus, 1, 2 és 10 Hz (bajuszmező) AUD: 50 stimulus, 1 Hz (hallójárat, klikk ) VIS: 50 stimulus, 1 Hz (fényvillanások) 0 A B C D 2 mv 10 ms Elektrofiziológia - perifériás ideg farokideg - ingerlés - elektromos impulzus - sorozat; kettős impulzus - kiváltott válasz - latencia (A-B, A-C),csúcstól-csúcsig amplitúdó (B-C), - második:első arány
Anyagok és módszerek Open field teszt (OF) - Spontán motoros aktivitás 10-10 perc regisztrálás állatonként megtett út hossza helyváltoztatással, helyzetváltoztatással, ágaskodással, mozdulatlansággal töltött idő események száma Biokémiai vizsgálatok - SOD, GSH (fehérje) Szerv fémtartalom mérés - (ICP-MS) (Morfológiai vizsgálatok) Statisztika: SPSS 15.0 for Windows; kétmintás t-próba; varianciaanalízis (F-próba), egyutas-anova, post hoc LSD teszt; MS Excel Lineáris illeszkedés
I. Modell per os Fém Vegyület Dózisok (mg/ttkg) Mangán oldott forma MnCl 2 4H 2 O 15; 60 NP forma MnO 2 2,63 Kadmium oldott forma CdCl 2 2,5H 2 O 3,5 NP forma CdO 2 0,04 Ólom oldott forma Pb(CH 3 COO) 2 3H 2 O 80; 320 NP forma PbO 2 Mangán Ólom Kadmium 3 hét (po.),3+3 hét (po.+ it.); 6 hét (po.); 6+6 hét (po.+ it.) 3 hét (po.),3+1 hét (po.+ it.); 1+3 hét (it.+po.)
Eredmények Open field aktivitás Mangán, : p<0.05, 0.01 vs. C; #, ## : p<0.05, 0.01 vs. VC.
Eredmények - Mn Kiváltott kérgi aktivitás Rel. latencia 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 Szsz 1 Hz 2 Hz 10 Hz MnVC3 MnL3 MnH3 MnVC33 MnL33 MnH33 Csoportok,,: p<0.05, 0.01, 0.001 vs. MnVC,,, : p<0.,.01, 0.001 vs. 1 Hz Rel. latencia VIZ AUD 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 MnVC3 MnL3 MnH3 MnVC33 MnL33 MnH33 Csoportok,,: p<0.05, 0.01, 0.001 vs. MnVC Rel. latencia 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 Szsz MnVC6 MnL6 MnH6 MnVC66 MnL66 MnH66 Csoportok Rel. latencia VIZ AUD 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 MnVC6 MnL6 MnH6 MnVC66 MnL66 MnH66 Csoportok
Eredmények - Mn Perifériás (farok) ideg,,: p<0.05, 0.01, 0.001 vs. VC
Következtetések I. (per os) A kiválasztott kezelési sémák és dózisok alkalmazhatóak voltak Az oldott formával történt per os expozícióhoz viszonyítva a NP formájú fémeknek a bevitt dózishoz képest erőteljesebb hatásuk volt Mn, Cd - testtömeg-gyarapodás Mn, Pb, Cd - OF magatartási és kiváltott válaszok A különbségek okai lehetnek NP-specifikus (oxidatív stressz) fém-specifikus (megváltozott szinaptikus ingerületátvitel) A dózis-hatás összefüggés különbségei külső dózis - belső dózis (szöveti fémszint) összefüggései
II. modell Intranasalis Intratrachealis I. II. III. IV. Anyagok Nano MnO 2 Oldott MnCl 2 Nano MnO 2 Kezelési időtartamok Egyszeri beadás 3 és 6 hét 3 hét (napi 1 vagy 2 kezelés) 3, 6, 9 hét Dózisok (Mn mg/ttkg) 10.12 10.12 2.63 5.26 (napi 2 x 2.63 vagy napi 1 x 5.26) 2.63 5.26
Eredmények - intranasalis Mn Open Field 3 hetes kezelés 6 hetes kezelés : p< 0,05 vs kontroll csoport :p<0,01 vs kontroll csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport ###: p<0,001 vs nano -csoport
18 Eredmények - intratranasalis Mn Szenzoros kiváltott potenciálok : p< 0,05 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport : p<0,05 vs 1Hz frekvencia
Eredmények - intratracheális Mn Open Field : p< 0,05 vs kontroll csoport :p<0,01 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport
Eredmények - intratracheális Mn Szenzoros kiváltott potenciálok : p< 0,05 vs kontroll csoport :p<0,01 vs kontroll csoport : p<0,001 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport
Eredmények - intratracheális Mn Perifériás (farok) ideg :p<0,01 vs kontroll csoport ###:p<0,001 vs nano-csoport
Eredmények - intratracheális Mn Mn-szintek A: kontroll tüdő, B: kontroll agy C: nagy dózissal kezelt tüdő, D: nagy dózissal kezelt agy
Következtetések II. Oldott és NP Mn kezelés - hasonló (szignifikáns) neurotoxikus hatások - spontán és kiváltott kérgi aktivitás paraméterei szignifikánsan megváltoztak - OF magatartás az inaktivitás irányába tolódott el - dózisfüggő, kezelési idő függő - a hatások a kumulatív dózissal arányosak - az oldott és nano-állapotú mangán hatásában nem volt minőségi különbség
Lehetséges mechanizmusok - Glutamáterg hiperaktivitás - EGoG lassú hullámkomponensek csökkenése, gyorsak fokozódása - Kiváltott potenciálok lassulása - glutamát-felhalmozódás, deszenzitizáció - Mitokondriális toxicitás - Ideg vezetési sebesség csökkenése - Frekvencia-függő jelenségek - a neuronok/rostok kevésbé képesek gyakori ingerlésre reagálni - Ca-csatorna gátlás - ideg vezetési sebesség, kiváltott potenciálok lassulása - Globus pallidus, striatum károsodás (energia-hiányból eredő nekrózis) - csökkent mozgássebesség - csökkent horizontális és vertikális aktivitás
III. Modell - intratracheális Csoport Kód Anyag Dózis (mg fém / ttkg) A kezelés időtartama Kezeletlen kontrol K --- --- 3, 6, 9 hét Vivőanyagos kontrol VK Desztillált víz --- 3, 6, 9 hét Mangán, kis dózis Mangán, nagy dózis Kadmium, kis dózis Kadmium, nagy dózis Mn-KD MnO 2 2,63 Mn-ND nanoszuszpenzió 5,26 Cd-KD CdO 2 0,04 Cd-ND nanoszuszpenzió 0,40 Ólom, kis dózis Pb-KD PbO 2,00 Ólom, nagy dózis Pb-ND nanoszuszpenzió 4,00 3, 6, 9 hét 3, 6 hét 3, 6 hét
Eredmények - Mn Kérgi kiváltott potenciálok SS latencia VIS, AUD latencia Perifériás (farok) ideg vezetési sebesség
Eredmények - Mn szint és oxidatív stressz paraméterek Csoportok VK Mn-KD Mn-ND Agy Mn, ppb (n=8) 1931 476 7151 2863 7230 2910 Vér Mn, ppb (n=8) 514 217 782 169 1022 206 Agy SOD, U/mg prot. (n=5) 46.65 3.26 49.83 4.83 70.57 9.52 Agy Mn-SOD, U/mg prot. (n=5) 10.97 4.89 14.94 9.51 25.54 21.01 Agy GSH, μm (n=5) 0.0937 0.0058 0.0894 0.0038 0.0825 0.0043
Következtetések III. Szuszpendált fém nanorészecskék ismételt, több hetes intratracheális instillálása technikailag kivitelezhető (6, ill. 9 hét instillálás után magas fémszintek a szervekben) Funkcionális idegrendszeri elváltozások mutathatók ki Legérzékenyebb - kérgi kiváltott potenciálok - Mn, Pb, Cd - perifériás idegvezetés, OF - Mn, Pb Az oxidatív stresszre jellemző változások mérsékeltek Mn, Pb - fémszintek - neurofunkcionális elváltozások (ECoG index) - fémszintek - oxidatív stressz markerek (agyi GSH) Cd - neurofiziológiai és biokémiai elváltozások - vérben és agyban Cd nem volt kimutatható
Hasonló neurofunkcionális elváltozások közös hatásmechanizmus (?) - oxidatív stressz, Ca-függő folyamatok, jelátvivő rendszerek - Mn, Pb, Cd glutamát forgalom megzavarása - deszenzitizálhatja a postsynapticus receptorokat gyengébb/lassúbb postsynapticus excitatio formatio reticularis fokozott corticalis aktiváció - OF dopaminerg rendszer dopaminerg neuronok különösen érzékenyek az oxidatív stresszre
IV. Modell - kombinációk I. kísérlet (Szubakut per os) II. kísérlet (Szubakut intratracheális) III. kísérlet (Szubakut intratracheális) IV. kísérlet (Szubakut kombinált intratracheális) Időtartam 6 hét 5 hét 4 hét 4 hét Az alkalmazott fémek és dózisok MnCl 2 4 H 2 O 2,5 mg/ml MnCl 2. 4 H 2 O 0,5 mg/ttkg Fe 3 O 4, MnO 2, Cr(OH) 3 NP-ok kis dózis: 2 mg/ttkg nagy dózis: 4 mg/ttkg Fe 3 O 4, MnO 2, Cr(OH) 3 NP-ok kettős, illetve hármas kombinációi: 2 mg/ttkg
Rel. latencia 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 0,85 0,8 Rel. latencia 1,3 EREDMÉNYEK - III-IV. KÍSÉRLET && & && & & &&& SS 1 Hz 2 Hz 10 Hz FMVC FeLD FeHD MnLD MnHD CrVC CrLD CrHD SS &&& && &&& & 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 Hz 2 Hz 10 Hz & &&& &&& && & & 1 0,95 0,9 0,85 0,8 VC FM MC FC FMC,, p<0,05, 0,01, 0,001 vs. megfelelő vivőkontroll &, &&, &&& p<0,05, 0,01, 0,001 vs. 1 Hz
EREDMÉNYEK - III-IV. KÍSÉRLET Rel. latencia VIZ AUD 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 FMVC FeLD FeHD MnLD MnHD CrVC CrLD CrHD Rel. latencia VIZ AUD 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 VC FM MC FC FMC,, p<0,05, 0,01, 0,001 vs. megfelelő vivőkontroll
A modellben Következtetések IV. Azonos kísérleti körülmények között a Cr ~ Mn Fe hatása minimális, részben ellentétes a Mn-éval A fémek interakciói Mn-nak a testtömeg gyarapodásra kifejtett negatív hatását a Fe kivédte Cr látszólag nem vett részt ilyen interakcióban Szöveti fémszintek - a Fe befolyással volt a Cr-ra, a Mn-ra azonban nem A belső dózisok szerepe a funkcionális elváltozások kialakításában nem kizárólagos nem a legjobb biomarkerek
A modellek általános/összefoglaló értékelése A kísérleti rendszer alkalmasnak mutatkozott a NP expozíció idegrendszeri hatásainak modellezésére bevitt anyag formája kezelési mód dózis (küls/belső dózis) önálló/kombinált adagolás Az elektrofiziológiai (és magatartási) vizsgálati módszerek megfelelkők lehetnek az idegrendszeri elváltozások detektálására és nyomon követésére egyes mért paraméterek potenciálisan biomarkernek tekinthetők - kiváltott potenciál latencia, kettős ingerlés második:első aránya Humán adatok trendbeli azonossága - adekvát a modell (?)
A kísérleteket vezették/végezték - Papp András egy. docens - Szabó Andrea egy. adjunktus - Lukács Anita egy. tanársegéd - Horváth Edina (PhD) - Máté Zsuzsanna (PhD) - Oszlánczy Gábor PhD) - Sárközi Leila (PhD) - Takács Szabolcs (PhD) Köszönetnyílvánítás - SZTE TTIK Alkalmazott és Környezeti Kémiai Tanszék - Prof. Dr. Kiricsi Imre - Kónya Zoltán és kollégái - MOL Analitikai Laboratórium (Algyő) - Szőke Attila és kollégái
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!