Bioinformatika 2 9. előadás

9. előadás Prof. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz. Bioinformatika proteomika Előadás és gyakorlat 2017.11.06.

Térszerkezet előrejelzés fő módszerei Homológia modellezés (komparatív modellezés): ha található ismert térszerkezetű, a vizsgált szekvenciával elegendően nagy azonossággal (> 20%) rendelkező homológ, akkor annak térszerkezete alapján a vizsgált szekvencia térszerkezete modellezhető Tekeredés felismerés (fold recognition): ha található az ismert térszerkezetek között a vizsgált szekvenciával alacsony szekvenciaazonosságot mutató ám kompatibilis tekeredés, akkor homológia modellezéssel erre is készíthető szerkezet. Ab initio predikció: ismert térszerkezetű fehérjével nincs megfelelő szekvenciaazonosság és kompatibilis tekeredés sem található. A térszerkezet előrejelzése ekkor fizikai elvek felhasználásával kísérelhető meg. 2017.11.06.

A bioinformatika térképe 3 2009. 04. 17.

Hatóanyag-receptor kölcsönhatás modellezés Ligandum szerkezete kémiai Receptor primer szekvencia 3D Farmakofór modellezés (QSAR, AAA,CoMFA) 3D Receptor modellezés Fejlettebb kvantummechanikai módszerek (pl. QM/MM) alkalmazhatóak Farm ligand konformáció Dokkolá s Ligandum-receptor komplex 3D kötöhely A hatóanyag receptor kölcsönhatás elméleti modellezésének folyamatábrája és kapcsolata a kísérletekkel. Az elméleti vizsgálatok a téglalapokban, Stabilitás elemzése míg a kísérleti adatok az ellipszisekben (Molekuladinamika) találhatóak. A szürke terület a kis molekulák modellezése, a fehér területek függenek össze a bioinformatikával. Kötésenergia számítások 4 2009. 2017.11.06. 04. (Szabadenergia szám.)

Farmakofór modellek készítése D 1 dopamin receptor Aktív vegyületek Farmakofór modell: a ligandumok térbeli egymásra illesztése. Mintegy az aktív hely 3D komplementer képe. megengedett farmakofór régiók Inaktív vegyületek nem megengedett régiók 5 2009. 04. 17.

Molekulák dokkolása fehérjékhez Kis molekula (ligandum, szubsztrát, koenzim, stb.) kötődésének jóslása / vizsgálata egy fehérje (receptor) felszínén ill. belsejében Két fehérje egymáshoz való illeszkedésének / kötődési helyének jóslása / vizsgálata Fehérje és DNS egymáshoz való illeszkedésének / kötődési helyének jóslása / vizsgálata Az illeszkedés értékelésének módja: 1. Egyszerű geometriai illeszkedés figyelembe vétele 2. Az illeszkedés értékelése: bonyolult energiafüggvény, elektrosztatikus komplementaritás, stb. A modell szerint: 1. Mindkét molekula merev 2. Az egyik molekula (általában a ligandum) flexibilis, a másik (általában a fehérje) merev 3. Mindkét molekula flexibilis (a keresés nagyon időigényes) Az algoritmus szerint: Molekuladinamika Monte Carlo módszerek (pozíciók véletlenszerű generálása) Szimulált hőkezelés: szimuláció során magas hőmérsékletről lassan lehűtjük a rendszert, ez segíti az energiaminimum elérését Egyéb módszerek 6

QM/MM módszerek A fehérjék kezelése több régióban. Az aktív hely fontos részeit és a szubsztrátot (vagy terméket, reaktív intermediert, átmeneti állapotot) a pontosabb számításokra alkalmas QM régió tartalmazza. MM régió QM régió Szubsztrát A QM régió elektronikus / kvantum kölcsönhatások elemzésére is alkalmas (szemiempírikus, HF ill. DFT módszerek). A fehérje többi részét klasszikus MM forcefield segítségével kezeljük. 7 2017.11.06.

QM/MM módszerek A klasszikus és a kvantum régió határfelülete MM régió QM régió Egy glutamát oldallánc felosztása kvantum és klasszikus régiókra. A határfelületek kezelésének két fő megközelítése van. A terminális CH 2 CO 2 csoportot kvantum mechanikával, míg a főlánc atomjait molekula mechankai force-field segítségével kezeljük. A vágási felület meghatározása a legnehezebb kérdés (általában C(sp 3 )-C(sp 3 ) kötés mentén). Az egyik az ún. link atom approach [MJ Field, PA Bash, M Karplus: J Comput Chem, 1989, 6, 700], ahol a QM régiót egy megfelelő virtuális atom hozzáadásával zárjuk le. A másik az ún. frozen orbital approach [G Monard, M Loos, V Thery, K Baka, J-L Rivail: Int J Quant Chem, 1996, 58, 153]. Itt az elektronsűrűség határfelületre eső folyamatosságát egy a kvantum és klasszikus atom közötti megfagyasztott pálya 8 segítségével biztosítják (local self-consistent field, LSCF).

QM/MM módszerek alkalmazása A trióz-foszfát izomeráz (TIM) mechanizmus Dihidroxiaceton foszfát Enediolát Enediol Enediolát D- glicerinaldehid- 3-foszfát Az aktív hely fontos részeit és a szubsztrátot a reaktív intermediereket, átmeneti állapotokat ill. terméket QM/MM módszerekkel kezelve felderíthetővé vált a trióz-foszfát izomeráz (TIM) reakció lefutásának enzimen belüli pontos értelmezése [PA Bash, MJ Field, RC Davenport, GA Petsko, D Ringe, M Karplus: Biochemistry 1991, 30, 5826 5832; JR Knowles: Phil Trans Roy Soc Lond B 1991, 332, 115 121]. 9 2017.11.06.

Kötésenergia számítások Két független kísérlettel meghatározzuk két ligand és a receptor kötési szabadenergiáját: Ligand 1 + Receptor ΔG 1 Ligand 1/Receptor Ligand 2 + Receptor ΔG 2 Ligand 2/Receptor A két ligandum relatív kötési szabadenergiája a következő ciklikus séma szerint állapítható meg: Ligand 1 + Receptor ΔG 1 Ligand 1/Receptor ΔG 3 ΔG 4 Ligand 2 + Receptor ΔG 2 Ligand 2/Receptor ahol ΔG 3 és ΔG 4 formálisan megfelel a Ligand 1 -> Ligand 2 oldatfázisbeli ill. receptorhoz kötött állapotbeli kémiai átalakításnak szabadenergia különbségének. Mivel ΔΔG ciklus = 0, ΔΔG ciklus = ΔG 1 + ΔG 2 - ΔG 3 - ΔG 4 = 0 tehát ΔΔG kötés = ΔG 1 - ΔG 2 = ΔG 3 - ΔG 4 A relatív ΔΔG kötés értékek alkalmazása kiküszöböli a tényleges ligandum receptor ΔG 1 és 10 2009. 04. 17. ΔG 2 kötésállandók igen számításigényes meghatározásának szükségességét.

Célfehérjék azonosítása Néhány évvel ezelőttig a célfehérjék direkt kísérleti azonosítása nem volt megoldható. Történetileg csak néhány olyan gyógyszer ismert, melynek célfehérjéje ugyanakkor vált ismertté, mint maga a gyógyszer. Ennek az oka az, hogy az új gyógyszerek fejlesztése tradícionálisan nagyrészt a már ismert gyógyszerek módosításán alapult a molekuláris hasonlóságok intuitív alkalmazásával. A módosítások kísérletileg azonnal tesztelhetők voltak in vitro és in vivo. Így tehát a gyógyszer hatékonysága megítélhető volt akár a célfehérje ismerete nélkül is. Ennek a következménye az, hogy a jelenleg piacon található gyógyszerek becslések szerint egy kb. 4-500 tagú célfehérje készletre hatnak [Drews, J.: Die verspielte Zukunft, 1998, Basel: Birkhauser Verlag], miközben a potenciális célfehérje készlet 2-3000 fehérjére tehető [Bull & Doig: PLoS One, 2015, 10, e0117955]. A célfehérjék azonosítása a mai orvos és gyógyszertudomány szűk keresztmetszete. 11 2017.11.06.

Célfehérjék azonosítása - genomika Manapság a molekuláris biológia új módszerei melyek csak néhány éve fejlődtek ki alapvetően új lehetőségeket biztosítanak a célfehérjék azonosítására. E fejlődés példájaként a DNS chip technológia [DeRisi, J. L, Iyer, V. R., Brown, P. O., Science, 1997, 278(5338), 680-686] említhető. Az általános képhez természetesen ezen kívül még számos fejlesztés alatt álló további módszer / lehetőség is tartozik. Az alábbi ábra szemlélteti a cellák (egy chip néhány 10 ~2 millió cella) működési elvét: rögzített próbák Jelölt DNS (minta) különböző tulajdonságok (pl. különböző gének kötése) teljesen komplementer szálak erősen kötődnek részben komplementer szálak gyengébben kötődnek 12 2017.11.06.

Célfehérjék azonosítása - genomika Az ábra egy DNS chip egy részletét mutatja. Ez a DNS chip különbség képet jelenít meg azon fehérjékról, melyeket az élesztő sejtek két különböző sejt-állapotben termelnek. Az egyik állapot (zöld) glükóz jelenlétében a sejtek egészséges állapotában, a másik (piros) glükóz hiányában a sejtek éhező állapotában készült. A világos zöld foltok olyan fehérjéket jeleznek, melyek nagyrész a sejtek egészséges állapotában expresszálódnak. A piros foltok olyan fehérjék, melyek zömében az éhező állapotban képződnek. Ha egy fehérje mindkét állapotban képződik, a folt sárga (a zöld és a piros szín additív keveréke). A sötét foltok olyan fehérjék, melyek nem nagy gyakorisággal expresszálódnak. A foltok színe alapján eldönthető tehát, hogy egy fehérje a sejt milyen állapotában képződik gyakrabban. 13 2017.11.06.

Célfehérjék azonosítása - genomika Igen fontos kérdés, hogy pontosan milyen kísérlet is eredményezi az adott képet. Ami ugyancsak nagy jelentőségű, az hogy milyen információ mennyiség rendelhető a kép egyes színes pontjaihoz. Ezzel kapcsolatban a következő általános megjegyzeseket tehetjük: 1. A fehérje azonosítására a színes folt koordinátái szolgálnak. Az egyszerűség kedvéért feltételezhetjük bár ez nem feltétlenül mindíg igaz, többszörös foltokat alkalmazhatnak pl. Kalibrációs célokból hogy a különböző foltok különböző fehérjéket jelentenek. A foltok pontos helyét a DNS chip gyártása előtt már meghatározzák. A DNS chip tervezése számos fehérje azonosítását és a chip felületén történő elrendezésének megoldását igényli. A pontos elhelyezkedés a határoló feltételektől és a kísérlet jellegétől is függ, de nem számottevő fontosságú az eredmények interpretálásának szempontjából. 2. Az egyes foltokhoz csak részleges / elemi információk rendelhetőek. A legjobb esetben a kísérlet a gén ill. fehérje teljes szekvenciájának felel meg. Számos esetben előfordul azonban, hogy a szekvenciának csak egy rövidebb ám szükségszerúen releváns 14 2009. részlete 04. 17. áll rendelkezésre.

Genomika vs. proteomika A genomika módszereivel nem a tényleges fehérjéket vizsgáljuk, hanem azokat az expresszálódott géneket, amelyek transzlációja az adott fehérjét eredményezi. A proteomika módszereivel a ténylegesen képződött fehérjéket vizsgáljuk. Az előző ábrán látható DNS chip az expresszálódott génekről szolgáltat információkat, így tehát csak közvetett adatokhoz juthatunk a tényleges fehérje termékekről. A genomikai megközelítés előnye, hogy a gének kisérletileg jobban hozzáférhetőek és egyszerűbben kezelhetőek, mint a fehérjék. Ennek köszönhetően napjainkban a genomikai módszerek elterjedtebbek, mint a proteomikai eljárások. A kísérleti technikák fejlődésével párhuzamosan előre jelezhető a proteomika egyre nagyobb térnyerése. Tisztában kell lennünk azonban a genomikai megközelítés hátrányaival is. Első az, hogy egy gén expressziós szintje nem feltétlenül felel meg a megfelelő protein magas sejtbéli koncentrációjának, holott ez fontosabb ha a tényleges protein expresszió mértékére és az ezzel összefüggő betegségre vagyunk kíváncsiak. Talán még fontosabb az, hogy a fehérjék jelentős része a transzlációt követően módosul (posttranslational modifications). Ilyen módosulások a glikozilálások (összetett cukor egységek fehérje felszínhez kötődése) és foszforilálások (foszfát egységek kötödése a fehérjéhez). Ezek a transzlációt követő módosulások az azonos primer aminosav szekvenciával rendelkező proteinek számos eltérő 15 változatához 2009. 04. 17. vezethetnek. A genomika nem képes ezen módosulások követésére, Bioinformatika amelyek számos 2 esetben alapvető fontosságűak lehetnek.

Enzim adatbázisok Enzim nómenklatúra és osztályozási adatbázisok: EXPASY ENZYME: http://www.expasy.ch/enzyme/ BRENDA: http://www.brenda-enzymes.org/ 16 2017.11.06.

Enzim adatbázisok Enzim adatbázisok: Az enzimekkel összefüggő adatok és nómenklatúra részletes adatbázisai Minden olyan jellemzett enzimosztályt részletesen ismertetnek, amelyhez az EC (Enzyme Commission) EC számot rendelt hozzá 17 2017.11.06.

ENZYME adatbázis ENZYME: http://www.expasy.ch/enzyme/ Keresés az ENZYME adatbázisban: EC szám szerint Enzim osztály szerint Leírás (official name) vagy alternatív név(ek) szerint Kémiai vegyületek szerint Kofaktor szerint A komment szövegeiben elóforduló szavakra 18 2017.11.06.

ENZYME adatbázis ENZYME: http://www.expasy.ch/enzyme/ 19 2017.11.06.

BRENDA adatbázis BRENDA: http://www.brenda-enzymes.org/ Keresés a BRENDA adatbázisban (részletes keresési lehetőségek): Nómenklatúra szerint Reakció & specifitás szerint Funkcionális paraméterek szerint Izolálás és preparálás szerint Szervezet szerint Stabilitás szerint Enzim szerkezeti sajátságok szerint Betegségek és hasonló információk szerint Alkalmazás és mérnöki vonatkozások szerint 22 2017.11.06.

BRENDA adatbázis BRENDA: http://www.brenda-enzymes.org/ 23 2017.11.06.

KEGG: http://www.genome.jp/kegg/ KEGG adatbázis rendszer 33 2017.11.06.

KEGG: http://www.genome.jp/kegg/ KEGG adatbázis rendszer - PATHWAY 34 2017.11.06.

KEGG: http://www.genome.jp/kegg/ KEGG adatbázis rendszer - PATHWAY 36 2009. 04. 17.