Abszorpciós spektrometria összefoglaló smétlés: fény (elektromágneses sugárzás) tulajdonságai, kettős természet fény anyag kölcsönhatás típusok (reflexió, transzmisszió, abszorpció, szórás) Abszorpció jelensége, fény intenzitás változása: exponenciális és logaritmikus leírás Lambert Beer törvény, abszorbancia, optikai denzitás, extinkciós együttható, koncentráció, úthossz (minta vastagság) és ezek összefüggése Abszorpció és emisszió: anyag = minta = abszorbens (szinonímák) jelenségek összekapcsolása, abszorpció emisszió, gerjesztés visszagerjesztés, foton és elektron kölcsönhatása atomi energiaszintek, energiaszintek energia különbsége, foton energia, rezonancia feltétel atomi vonalas, molekulák sávos és magas hőmérsékletű anyagok folytonos (emissziós) spektrumai (színképei) Molekulák sávos színképének értelmezése: eredet, jellemző tulajdonságok Born Oppenheimer közelítés elektromos, vibrációs, rotációs energiaszintek és azok függetlensége Jablonsky diagram (termséma) abszorpció jelenségének értelmezése a Jablonsky diagram segítségével Abszorpciós spektrometria fotométer: egységek: fényforrás, monokromátor, minta, detektor (PMT), adatgyűjtő és kiértékelő egység (PC) működési elv, egy /kétutas fotométer, minta és referencia
Abszorpciós fotometria Elektron-spektroszkópia alapjai Biofizika. félév 2012 január Orbán József PTE ÁOK Biofizikai ntézet s m é t l é s 1
Fény elektromágneses sugárzás foton (fénykvantum), energiája: E = h A fény kettős természete: Elektromágneses hullám (terjedéskor) Elhajlás (diffrakció) nterferencia Polarizáció Részecske (kölcsönhatáskor) Fotoeffektus Compton-effektus A b s z o r p c i ó R e f l e x i ó Elektromágneses hullám terjedése mágneses mező elektromos mező ha = 600 nm, akkor f = = 5 10 14 Hz x terjedési irány 2
Elektromágneses hullám terjedése E B Elektromos térerősségvektor x x hullámhossz mágneses mező elektromos mező c = x transzverzális hullám Az elektromos, és a mágneses térerősség vektorai mindig merőlegesek egymásra és a haladási irányra! Az elektromágneses sugárzások teljes spektruma Energia, frekvencia (E=h Hullámhossz ( =c/ ) Gamma Röntgen Mágneses térerősségvektor Mikrohullám Rádió sugárzás Látható tartomány 3
Fény és anyag kölcsönhatása Sugárzás anyag ygkölcsönhatás elektromágneses (vagy radioaktív) sugárzás Sugárzás anyag kölcsönhatás 0 (kezdeti intenzitás) anyag Reflexió Transzmisszió Abszorpció Szórás Rayleigh-féle ~ n n: fotonszám Mi határozza meg az elnyelés mértékét? 4
Abszorbció - elnyelés anyag 0 fényforrás 0 Exponenciális függvény!!! fotonszám: intenzitás: N ( x) ( x) N0 e 0 e 1 2 3 vastagság Melyik függvény írja le a csökkenést? x x A fény elnyelődése a mintában 0 homogén minta 0 Mindig igaz, hogy: 0 0 > 0 0 ntenzitás reflektált: R = 0-0 abszorbált: A = 0 - transzmittált : T = x úthossz (vastagság) A reflexió mértéke általában elhanyagolható! 0 = 0 5
fényforrás Abszorbancia definíciója 0 minta DETEKTOR általános egyenlet: Lambert-Beer törvény (oldatok) = 0 e - x = 0 10 - ( ) c x Miért ( ) és nem csak? OD = A = - log 10 ( / 0 ) = ( ) c x abszorbancia Mértékegység nélküli, additív mennyiség! optikai denzitás ( ): az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz P é l d a 10% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD =-log (/ 0 ) =-log (0,1) = 1 50% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = 0,301 Ha a 10% és az 1% transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi lesz az eredő transzmittancia és abszorbancia? A = 2+1 = 3, T = 0,01 0,1 = 0,001 = 0,1 % 6
Színképek - spektrumok Hidrogén Nátrium Hélium Neon Higany (vonalas emissziós spektrumok) Hullámhossz (nm) Abszorpció és Emisszió atomoknál 1. abszorpció állapot: alapállapot gerjesztett állapot e - e - + E abs = h + e - + folyamat: (foton) Abszorpció (elektron) Excitáció (gerjesztés) A foton abszorpciója és az elektron gerjesztése egyszerre zajlik le! 7
Abszorpció és Emisszió atomoknál 2. emisszió állapot: gerjesztett állapot alapállapot + e - +e - + E em = h e - folyamat: (elektron) De-excitáció (visszagerjesztés) (foton) Emisszió Az elektron alapállapotbavisszatérése és a foton emissziója egyszerre zajlik le! Az abszorbált és az emittált foton energiája azonos és megegyezik az e - alapállapota és a gerjesztett állapota közötti energiakülönbséggel! Atomok energiaszint-rendszere Bohr illetve kvantummechanikai atommodell szerint energia (szintek) energia különbség Az elektronok kvantált (meghatározott) energiával rendelkeznek. energiaszintek! Az ábra csak szemléltetés! 8
Spektrum - színkép Spektrum: (fény)intenzitás v. azzal analóg mennyiség hullámhossz vagy frekvencia függvényében Típusok: vonalas (atomok) sávos (molekulák) folytonos (magas hőmérsékletre hevített anyagok) A spektrumok megjelenési formái. emissziós abszorpiós Folytonos emissziós Vonalas emissziós Vonalas abszorpciós Kép forrása: http://csep10.phys.utk.edu/astr162/lect/light/absorption.html 9
Aktin molekula sávos (abszorpciós) spektruma szorbancia Absorption vagy OD Abs 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Ez melyik típusú színkép? Hogyan alakul ki? Az atomok vonalas- és a molekulák sávos színképe karakterisztikus! (az anyagi minőségtől függ) aktin 0,0 260 270 280 290 300 310 320 hullámhossz Wavelength (nm) Fehérjék abszorpciója - aminosavak A három fontos aminosav, amelyek UV-ban mért abszorpciója segítségével szokták pl. az oldatok fehérje koncentrációját meghatározni. (Feltételezve azt, hogy az extinkció mértéke egyenesen arányos a fehérje koncentrációjával.) Extinkciós koefficiens hullámhossz 10
Molekulák színképe A Born-Oppenheimer közelítés: Az elektronok mozgása sokkal gyorsabb az atommagokénál, mert az atommagok nehezek, ezért a molekuláris mozgások modellezésénél a molekulát klasszikus rendszernek tekinthetjük: rugókkal összekötött, töltéssel rendelkező tömegpontok. Molekuláris mozgások E össz = E elektromos + E vibrációs + E rotációs. 11
Molekula energiája sávos színkép E össz = E elektromos + E vibrációs + E rotációs Az egyes energiaszintek közötti átmenetek egymástól függetlenül mehetnek végbe. A szintek közötti energiakülönbség összegeződik: E össz = E elektromos + E vibrációs + E rotációs. Két meghatározott elektromos energiaszinthez sok vibrációs és sok rotációs energiaszint tartozhat, ezért a molekulák színképe nem vonalas, hanem kiszélesedett sáv! Az energiakülönbségek nagyságrendje: E elektromos ~ 1000 * E vibrációs ~ 1000000 * E rotációs 0 Energia Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszer rotációs szintek vibrációs szintek Az egyes energiaszintek a S nullaszint alatt vannak. 2 Minden vízszintes vonal a molekula egy jól definiált energiával rendelkező S állapotát reprezentálja 1 Az elektromos, az azokra épülő vibrációs, valamint rotációs energiaszintek sematikus ábrája látható. Alapállapotban: az e - az S 0 S 0 valamely vibrációs szintjén helyezkedik el. elektromos szintek: S 0, S 1, S 2 12
Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszer 0 S 2 1. Excitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés) 2. De-excitáció ió Emisszió (kibocsátás) Energia h S 1 Abszorpció Emisszió S 0 h A gerjesztés/abszorpció feltétele: E = h (rezonancia feltétel) ) A foton energiájától függően létrejöhet: elektromos vibrációs rotációs átmenet ezek keveréke Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer működésének elméleti sémája fényforrás monokromátor (á (rács v. prizma) Minta Detektor 1 Referencia csatorna Referencia (blank) Detektor 2 Fény Elektromos jel Kiértékelés (PC) A mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban. 13
Az alapelv Fényforrás PMT Minta Diffrakciós rács Rés Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá). Fotoelektron sokszorozó (cső) Photomultiplier tube (PMT) foto on Fotoeffektus (foton lök ki elektront, ionizáció!) fotokatód dinódák elektron Ha: 1 2 akkor az erősítés: 2 n (n: dinódaszám) gyorsító nagyfeszültség elektron lök ki (1-6) elektront áram/voltmérő Erősítés: 1 foton (fotoelektron) 1-10 millió elektron! 14
P é l d a fehérjekoncentráció meghatározása Szükség van egy referencia számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: szokásos egységei: M -1 cm -1, vagy (mg/ml) -1 cm -1 Ha A = 0,55 és = 1,1 (mg/ml) -1 cm -1 c = (A/ ) mg/ml-ben megadva c = 0,5 mg/ml Kiegészítés A fehér fényt színösszetevőire bonthatjuk egy prizma, vagy optikai rács segítségével. Vörösö Narancs Sárga Zöld Kék bolya V N S Z K A környezetünk sokszínűségét megérthetjük, ha észben tartjuk, hogy a dolgok színét a szemünkbe jutó fotonok energiája (színe) határozza meg. Csak az érzékelt fotonoké! 15
Kiegészítés Reflexió által meghatározott FELÜLET SZÍN Milyen színű az alábbi tárgy? Vörös Narancs Sárga Zöld Kék bolya Keress a következő kifejezésre: Additív / konstruktív színkeverés pl.: bútorok, falak, tinta, papír, haj, szivárványhártya színe Kiegészítés Abszorpció (transzmisszió) által meghatározott TEST SZÍN Vörös Narancs Sárga Zöld Kék bolya Milyen színű az alábbi tárgy? pl.: vörös vértestek, falevelek, ólomüveg ablakok színe 16