A kísérleti állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája I/II. The anatomy, physiology, genetics, immungenetics and behavioral biology of experimental animals I/II. MAGATARTÁST VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK AZ ORVOSTUDOMÁNYBAN METHODS FOR ANIMAL BEHAVIOR RESEARCH IN MEDICINE Dr. Tőkés Tünde Ph.D. Bevezetés Introduction A viselkedés tanulmányozására sokféle módszer áll rendelkezésre. Ezeket a módszereket két nagy csoportra lehet osztani. Az egyik csoportba azok a módszerek, illetve tesztek sorolhatóak, amelyek az állat spontán, saját maga által, saját tempójában produkált viselkedését vizsgálják. Ezen csoporton belül további alcsoportok különböztethetőek meg: 1. A spontán viselkedést vizsgáló eljárások általában az aktivitást, a mozgásmintázatot rögzítik, illetve alkalmasak lehetnek, vagy azzá tehetők a hely-preferencia, valamint a motoros működés vizsgálatára is (pl. Open-field). 2. A preferencia-módszerek lényege az, hogy valamilyen kellemes vagy kellemetlen beavatkozás következtében az egyed bizonyos helyeket, ízeket, mozgásmintákat, stb. előnyben részesít (preferencia), vagy éppen elkerül (pl. passzív elkerülés teszt). 3. A helyzeti-szorongást vizsgáló eljárások általában valamilyen konfliktus-helyzetre épülnek, ahol az egyik lehetőség, térrész, stb. az állat számára szorongást kelt, ezért azt az állat nem szereti, viszont a kíváncsiság vagy más motiváció (pl. szomjúság) mégis odahajtja (pl. emelt labirintus teszt, Open-field). 4. A szociális szorongást és/vagy szociális kompetenciát vizsgáló, illetve az agresszióval kapcsolatos tesztek két (vagy több) egyed interakciójára épülnek (pl. rezidens-betolakodó teszt, 3 kamrás teszt, automatizált cső teszt). 5. Külön csoportot alkotnak a motivációt vizsgáló tesztek, illetve ezzel kapcsolatos modellek (pl. a Porsolt-féle úszási teszt, az új tárgy felismerési teszt). A másik nagy csoportot a tanulást/memóriát vizsgáló módszerek alkotják, amelyeken belül szintén alcsoportok különíthetők el: 6. Útvonal-tanulási eljárásokban (labirintus tesztekben) választást kínálnak az alany számára. Ezek lehetnek egyszeresen vagy többszörösen elágazó labirintusok (pl. T-labirintus, Y- labirintus, sugár-labirintus teszt), melyek a memória vizsgálatára is alkalmasak, míg mások 1
(pl. Morris-féle vízi labirintus teszt, Barnes-féle Barnes féle labirintus teszt) a térbeli tájékozódás tanulmányozására is alkalmazhatók. 7. Az asszociatív tanulástt vizsgáló eljárások. Ide tartoznak a különböző különböző félelemfélelem és elhárítókondícionálások, illetve a pedálos operáns-kondícionáló operáns kamrák, amelyek leginkább a tanulási folyamat vizsgálatára és manipulálására alkalmasak. 1. Motoros funkciót vizsgáló módszer 1. Method for testing motor function 1.1. Rotarod 1.1. Rotarod A motoros funkciót és a koordinációt RotaRod készülékkel (3. ábra) ábra) vizsgálhatjuk. Az egyensúlyozó képesség és az izomerő izomer vizsgálatához az állatokat egy egyenletesen gyorsuló forgó hengerre helyezzük, majd a leesésig eltelt időt id t detektáljuk. Egy időben id több állat futtatása lehetséges. 1 ábra: Rodarod készülék, működés közben 1. (forrás: http://sciencelife.uchospitals.edu) 2. Tanulás és memória vizsgálati módszerek 2. Methods for studying ing learning and memory 2.1. Morris féle water maze teszt 2.1. Morris water maze test Kísérletekhez egy 150-200 150 cm átmérőjű,, 60 cm magas, kör alakú medencét használunk, melyet vízzel töltöttünk meg (4. ábra). A vizet ételfestékkel, tejjel, antiallergén temperával oplálossá tesszük, hogy az állatok ne láthassanak le a víz szintje alá. A medence mede körül jól látható, a tájékozódást segítő segít tárgyakat, a falra nagy jelöléseket helyezünk el. A medencét virtuálisan 4 negyedre osztjuk. Az egyikben (célkvadráns) egy 10x10 cm alapterületű platformot helyezünk el úgy, hogy annak felszíne az opálos víz szintje szi alatt 1-2 cm-el el helyezkedjen el, így a patkányok azt nem látják. Kísérletünket egy nappal megelőzően megel az állatokat habituáljuk az úsztatási teszthez, ami abból áll, hogy másfél percig úsznak a platform nélküli apparátusban. Figyelemmel követjük a motoros motoros aktivitásukat és a további kísérletbőll kizárjuk azokat, amelyeknek úszási nehézségeik adódtak. A kísérlet során az állatokat minden esetben a medence fala mellé, fejjel a fal felé helyezzük be az apparátusba, 2
innen úsznak a fix helyzetű platformra. A starthelyet ülésenként változtattuk. A patkányok addig maradnak a medencében, amíg a platformot meg nem találják. Amennyiben valamelyik állatnak ez 2 perc alatt nem sikerült, azt a kísérletvezető kihelyezi a platformra. Másodperces pontossággal lehet mérni a céltalálási latenciát (azaz, hogy mennyi idő alatt találják meg a biztonságos, fix helyzetű platformot). 2. ábra: Morris-féle water maze sematikus ábrája (forrás: http://en.wikipedia.org) 2.2. Új tárgy felismerés teszt 2.2. Novel object recognition test Ezzel a módszerrel az állatok hosszú távú memóriáját vizsgálhatjuk. Az állatokat egy tágas dobozba (vagy akár az Open-field arénájába is behelyezhetjük. Ezt a teszt dobozt állandó tárgyak vették körül a vizsgálat során (ez mindegyik tesztre vonatkozik). Az első társításban (mintavételi társítás) két egyforma tárgyat helyezünk be az arénába a faltól egyforma távolságban, a kör közepéhez képest asszimetrikusan, melyeket az egerek 5 percig szabadon vizsgálhatnak. Ezt követően a saját ketrecükbe kerülnek, és 90 perccel később sor kerül a második tásításra (vizsgálati társítás), amikor ugyancsak 5 percet tölthetnek a behelyezett tárgyak vizsgálatával. A vizsgálati társítás során az egyik tárgyat egy új tárgyra cseréljük ki, ami anyagában és formájában is különbözik az eredetitől. Az arénába behelyezett tárgyakat az adott állatnak mindkét tesztben ugyanabba a pozícióba helyezzük, a különböző állatoknak különböző helyekre. A tárgyak vizsgálatának idejét, és a tárgyak meglátogatásának frekvenciáját (alkalom) regisztráljuk. A tárgy vizsgálataként értékeljük, ha az állat szagolgatja a tárgyat, amit az orr szőrének mozgása kísér, vagy hozzáérinti-e az orrát a tárgyhoz; illetve ha a mellső lábaival érinteti a tárgyat. Azokat az egyedeket, amelyek legalább ötször nem látogatják az egyes tárgyakat, ki kell zárni a vizsgálatból. 2.3. Sugár labirintus teszt 2.3. Radial arm maze test A téri memória vizsgálatára a bonyolultabb, általában szimmetrikus labirintusok szolgálnak. Ezekben az állatok a szokott szegletek, sarkok, töréspontok mellett a külső környezet tárgyait, a fények elrendezését és más ingereit (pl. szagokat is) használják fel tájékozódásra. Ezért ezek a rendszerek magának a téri memóriának, a memória és téri tanulás alapjául szolgáló idegi mechanizmusoknak, valamint az e folyamatokat befolyásoló kémiai 3
anyagoknak és gyógyszereknek a tanulmányozására egyaránt alkalmasak. A sugárlabirintus egy - általában kör vagy sokszög alakú - központi kamrából, és az abból kiinduló sugárirányú karokból ból áll (5. ábra), ez utóbbiak száma változó, 3-tól 3 12-ig ig terjed, de használnak már 32 karú sugárlabirintust is. A karokba vízcseppeket helyeznek, a szomjaztatott állat ezeket issza ki. Mivel a vizet nem pótolják, az állatnak meg kell jegyeznie, melyik karban járt már, ahova már nem érdemes visszamennie. Másik lehetőség, lehet ség, ha nem minden karba tesznek megerősítést, meger hanem valamilyen mintázatot alkalmaznak. Az állatnak azt kell megjegyeznie, melyik karokba nem érdemes bemenni. Mindkét feladatot rövid időn id belül, esetleg 1-3 napos időközzel közzel megismétlik, így nemcsak a tanulást, hanem a megőrzést, meg rzést, azaz a memóriát is vizsgálni lehet. 3. ábra: Sugár labirintus teszt (forrás: http://www.uoguelph.ca) 2.4. Y alakú labirintus teszt 2.4. Y maze test Az állatok általában, így a patkány is, viszonylag gyorsan és hatékonyan képesek az irányváltások megtanulására. A rágcsálók többsége ehhez többnyire a felszín textúráját veszik figyelembe és főleg leg az éles sarkok, kiugró pontok alapján tájékozódnak (ún. tigmotaktikus tájékozódás). Az Y-labirintus Y labirintus a tájékozódás és iránytanulás vizsgálatára alkalmas egyszerű berendezés (6. ábra). A labirintus 3 egyenlő egyenl hosszúságú szárból áll, mindegyik végén itató van. A szomjaztatott patkányt a labirintus közepére helyezzük és 2 percig hagyjuk, hogy a terepet felderítse. Ennek eltelte után megvárjuk, amíg az egyik szárba befut, és a szárat az odakészített lemezzel lezárjuk. Ezután valamelyik, előre el kiválasztott irányba eső szár itatójába egy csepp cukros vizet teszünk, teszünk, majd a patkány útját felszabadítjuk. Ha bármelyik szárba befutott, azt lezárjuk, és most ismét az előre el re tervezett irányba eső es szárat töltjük fel, majd felszabadítjuk az állat útját. A fentieket addig ismételjük, amíg a patkány biztosan meg nem tanulja az irányt. Ezután fordítsunk az irányválasztáson (azaz ha eddig jobb volt, akkor most bal legyen, és fordítva) és újból végezzük el a kísérletet. 4
4. ábra: Y alakú labirintus teszt (forrás: http://elte.prompt.hu) 2.5. T-alakú labirintus teszt 2.5. T maze spontaneous alternation test A T-alakú alakú labirintus tesztet is az exploratív magatartás és térbeli tanulás vizsgálatára alkalmazzák, főképp képp központi idegrendszeri megbetegedések kapcsán. Három egyforma hosszúságú karból áll a mérőrendszer mérőrendszer (7. ábra). A kísérlet elején az állatot a kezdő kezd karba helyezzük el, eközben a jobb és a bal oldali kar zárt állapotban van. A záró fal eltávolítása után az állatnak döntenie kell, melyik oldali karba lép be először. el ször. Az ismételt próbák után az ismert rt karban már kevesebb időt időt fognak eltölteni, kevesebbszer lépnek be, jobban preferálják majd a még ismeretlen kart. 5. ábra: T--alakú labirintus teszt és annak sematikus ábrázolása (forrás: http://sbfnl.stanford.edu) 2.6. Barnes-féle labirintus teszt 2.6. Barnes maze test Ezt a tesztet is a kognitív deficit vizsgálatára lehet alkalmazni. A mérőrendszer mér egy megemelt, kör alakú platformból áll, melynek közepe tömör, de a peremén számos menekülésre szolgáló lyuk található. Az egyik lyuk alatt vagy az állat saját ketrece, vagy valamilyen más elbújásra alkalmas doboz található (8. ábra). A kísérleti állatot az asztal közepére helyezzük, majd hagyjuk, hogy felfedezze a platform minden szegletét, véletlenszerűen en megtalálja az egyetlen menekülő m utat, amibe bele is mászhat. A kísérlet során olyan zavaró inzultusokat alkalmazunk (erős (er s hang, fény felvillanása), melyek arra késztetik az állatot, hogy a lehetőss leghamarabb visszataláljon a védelmet nyújtó dobozba. A berendezés körül jól láthatóó jeleket helyezünk el, segítve a tájékozódást. Naponta 4 alkalommal 5
ismételjük a méréseket, mérjük a menekülési latenciát, a megtett távolságot és a sebességet. Nehezítésképp, a menekülésre alkalmas dobozt naponta át lehet helyezni másik lyukra. 6.. ábra: Barnes-féle Barnes labiritnus teszt vizsgálat közben (forrás: http://www.alibaba.com) 2.7. Passzív elkerülés teszt 2.7. Passive avoidance test Kísérleteinket két részből részb l álló passzív elhárító apparátusban végeztük (9. ábra). A kísérleti berendezés egy nagyobb, világosszürkére festett falú, jól megvilágított és egy hozzá csatlakozó kisebb fedett, sötét dobozból áll. A kisebb doboz teteje levehető, levehet az alján pedig sokkoló rács található. A két dobozt egy csapóajtó választja el. A passzív elhárító tanulási teszt általában 8 napig tart, habituáció, kondicionálás és teszt részekből részekb (2-3 (2 perc) áll. A habituáció (első nap) során az állatokat a jól megvilágított megvilágított doboz közepére helyezzük, ezt követően en szabadon mozoghatnak az egész apparátus területén. A kondicionálás során (második nap) az állatokat újra a világos doboz közepére helyezzük és mérjük azt az időt id mpben ami a sötét dobozba való belépésükig telt el (latencia idő). ). Miután az állatok belépnek a sötét dobozba, a csapóajtót lezárjuk. A kondicionálás gyenge sokkal (0,4 ma) történik, amit háromszor 1 mp-ig ig végzük, majd az állatokat visszahelyezzük a ketrecükbe. A kondicionálás után 24 órával, valamint 1 héttel később kés bb végzünk teszteket. Az állatokat ismét a világos doboz közepére helyezzük és ezúttal is mérjük a sötét (sokkoló) dobozba lépés latencia idejét. Ha az állat a 3 perces perióduson belül nem lép be a sötét dobozba, a kísérletet befejezhetjük, hiszen h az állat megtanulta elkerülni a sötét dobozt (melyben az áramütést kapta), bármennyire is jobban vonzódna a sötét helyhez, mint a világoshoz. 7.. ábra: Passzív elkerülésre használt berendezés és annak sematikus ábrája (forrás: www.waisman.wisc.edu, www.smarternootropics.com) 6
3. Szorongást és depressziót vizsgáló eszközök 3. Methods for studying depression and anxiety-like anxiety behaviour 3.1. Nyitott tér teszt 3.1. Open-field test A spontán lokomotoros aktivitás mérésére mérés Open-field field tesztet alkalmaztunk (10. ábra). Az állatokat egy 16 egyenlőő részre osztott, felülről felülr l nyitott dobozba helyezzük, majd a kísérlet 5 perce alatt videokamerával detektáljuk a következő következ paramétereket: az egy helyben, mozgással vagy mosakodással eltöltött időt, érintett mezőkk és ágaskodások számát, illetve a doboz közepén töltött időt. őt. t. Krónikus fájdalom jelenlétében fokozódik a szorongás, mellyel fordítottan arányos a mozgással és a doboz középén töltött idő, id, továbbá az időegység id alatt érintett mezőkk száma, míg a mosakodás, ágaskodás, és a sarokban töltött idő id azzal egyenesen arányos. 8.. ábra: Nyitott tér teszt és annak sematikus ábrája (forrás: psylab.idv.tw) 3.2. Megemelt labirintus teszt 3.2. Elevated plus maze test A vizsgálat alapja, hogy a földön élő él állatok - így a laboratóriumi rágcsálók is általában félnek a nyílt és magas terektől, terekt főképp képp akkor, ha azok keskenyek. A szorongásoldó szerek viszont ezt a félelmet többnyire hatékonyan oldják, így a keresztpalló vagy labirintus tesztet egyes anyagok anxiogén vagy anxiolitikus hatásának kimutatására használják. A kísérleti berendezés egymással szemben elhelyezkedő elhelyezked két nyitott és két zárt karból áll, melyek egy méterrel a talaj fölött kereszt alakban helyezkednek el. el. A zárt kar oldalfala 40 cm magas, teteje nyitott (11. ábra). A kísérleti állatot az apparátus közepére helyezzük, orral az egyik zárt kar irányába. Ezt követően ően en 5 percig figyeljük az állatok mozgását és viselkedését. A merőleges leges folyosók középen keresztezik keresztezik egymást, ahol tehát az állatok választhatnak, kilépnek-ee a nyitott részre. Mérjük a zárt karokon, a nyitott karokon és a nyitott karok végein eltöltött időt, t, valamint a zárt karokra, a nyitott karokra és a nyitott karok végeire történő történ belépések számát.. Mérjük továbbá az állatok által 5 perc alatt megtett út teljes hosszát. E paraméterrel, valamint az összes belépések számával az állatok általános aktivitását jellemezhetjük. 7
9. ábra: Megemelt labirintus teszt (forrás: www.cidd.unc.edu, www.c www-intern.mpipsykl.mpg.de) 3.3. Porsolt-féle erőltetett ltetett úszás teszt 3.3. Porsolt forced swim test A Porsolt-féle féle úszási tesztet antidepresszáns szerek vizsgálatára fejlesztették ki. Azon a feltételezésen alapszik, hogy a rágcsálók megpróbálnak megpróbálnak elmenekülni a stresszt okozó stimulustól. Ha a menekülés nem lehetséges, végül feladják a küzdelmet. Az egereket egy 30 cm magas üveg hengerbe helyezzük, mely addig van 24-30 24 ºC-os os vízzel feltöltve, hogy az állat farka ne érjen a henger aljáig, és a víz szintje felett is olyan magas szakasz legyen, amibőll nem tud kimászni, megkapaszkodni. Az egészséges állatok aktívan úsznak a kísérlet ideje alatt. Ahogy abbahagyják az úszást és a víz felszíne kiegyenlítődik, kiegyenlítődik, lenyugszik, azt a menekülés feladásának minő nősítjük. sítjük. Ha túl hamar feladja az állat, depresszióra utaló viselkedést tapasztaltunk. Folyamatos figyelmet kíván a kísérlet, hiszen ha az állat a víz felszíne alá bukik, azonnal ki kell venni a hengerből, hengerb l, szárazra törölni és visszahelyezni a ketrecébe. 10. ábra: Porsolt-féle erőltetett úszás teszt (forrás: www.dlnaturegene.com) 8
4. Szociális viselkedést vizsgáló eszközök 4. Methods for testing social behaviour 4.1. Automatizált cső teszt 4.1. Automated tube test A megváltozott tozott szociális dominancia és szociális hierarchia vizsgálatára alkalmazzák. A berendezés két oldalán (jobb és bal kalitka) várakozik a 2 vizsgálni kívánt egér. A kísérlet megkezdéséig csapóajtók választják el a 2 kalitkát összekötő összeköt folyosótól. Miután a lezáró l ajtókat eltávolítják, szabadon elindulhatnak a másik kalitka irányába. A folyosón való találkozáskor eldől, l, melyik állat a dominánsabb, melyik fog visszahúzódni a saját kezdő kezd helyére (13. ábra). 11. ábra: Automatizált cső teszt (forrás: www.noldus.com) 4.2. Három kamrás teszt 4.2. Three chamber test Ezt a tesztet az általános szociabilitás, a szociális újdonság mérésére használják, segít azonosítani a szociális deficiteket. A rágcsálók normális esetben több időt időt töltenek egy másik állattal, és nagyobb érdeklődést ődést mutatnak egy új egyed iránt, mint a már már ismert társaik iránt. A berendezés 3 kamrából áll, egy bal, középső középs és jobb kamrából. Az üres kamrában történt habituáció után megnyílik az egyik (jobb vagy bal) oldali kamra ajtaja, ahol egy soha nem látott egyed tartózkodik egy kis ketrecben. Az ellenoldali, ellenoldali, 3. kamrában pedig egy állat nélküli, üres ketrec található. Ez a rész használható a szociális viselkedés vizsgálatára, oda megy-e megy az állat ismerkedni, több időt őt tölt-e tölt a társsal rendelkező kamrában, mint egyedül. A szociális újdonság kérdését pedig úgy vizsgálhatjuk, ha a 3 kamra üres ketrecébe is elhelyezünk egy ismeretlen egyedet, és figylejük, hogy jobban preferálja-e preferálja e az ismeretlent, mint a már ismert egyedet. Autizmus vizsgálatát célzó kísérletekre kiválóan alkalmas eszköz. 9
12.. ábra: 3 kamrás teszt és annak sematikus ábrája (forrás: sbfnl.stanford.edu) Felhasznált irodalom References 1. Prof. Dr. Kállai László: Laborállat könyv, 2003. 2. Világi Ildikó: Élettani gyakorlatok, Viselkedési és tanulási vizsgálatok, ELTE 10