A női nemi hormonok akut hatása a kisartériák tónusára különböző hormonális állapotú kísérleti állatokban

A női nemi hormonok akut hatása a kisartériák tónusára különböző hormonális állapotú kísérleti állatokban Ph.D. értekezés dr. Kakucs Réka Témavezető: Dr. Székács Béla egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Programvezető: Prof. Dr. Monos Emil, az orvostudományok doktora Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest, 2002

Tartalomjegyzék Összefoglaló 4 Bevezetés és irodalmi háttér 6 A hosszútávú ösztrogénkezelés vaszkuláris hatásai 7 a) A tartós ösztrogénkezelés hatása a vérnyomásra 7 b) A tartós ösztrogénkezelés hatása a vaszkuláris reaktivitásra 8 c) A tartós ösztrogénkezelés hatása az értónus lokális, autokrin-parakrin szabályozására 9 d) Az ösztrogén genom hatásmechanizmusa 11 Az ösztrogének akut érhatásai 12 a) Interakció az endotéliummal 12 b) Direkt hatás az erek simaizmára 13 c) Az ösztrogén nongenom hatásmechanizmusa 15 A hormonális állapot befolyása az ösztrogén akut érhatásaira 18 a) Nemi különbségek az ösztrogén akut érhatásaiban 18 b) A hormonális állapot befolyása az ösztrogén akut érhatásaira nőkben 19 A progeszteron érhatásai 19 a) Az ösztrogénpótló kezelés vaszkuláris hatásainak módosulása progeszteron és progeszteron-származékok jelenlétében - Genom hatások 19 b) A progeszteron akut érhatásai 20 Célkitűzések 21 Módszerek 22 Az érátmérő mérésének technikája 22 Az ösztradiol és a progeszteron akut vazorelaxáns hatásának vizsgálata 23 A krónikus ösztrogénkezelés és az akut, nongenom ösztradiolhatások közötti interakció vizsgálata 24 Alkalmazott anyagok 25 Statisztikai analízis 26 Eredmények 26 I. A szteroidhormonok akut érhatásai 26 a) A 17β-ösztradiol akut relaxáns hatása prekontrahált saphena artériákon 26 b) A progeszteron akut relaxáns hatása prekontrahált saphena artériákon 27 c) Dexametazon hatása prekontrahált saphena artériákra 27 1

d) A 17α-ösztradiol hatása prekontrahált saphena artériákra 28 e) Az endotélium szerepe a 17β-ösztradiol okozta érválaszban 29 II. A krónikus ösztrogénkezelés hatása az akut relaxációkra 30 a) Az ösztradiol akut relaxáns hatása ovariektomizált patkányok prekontrahált saphena artériáin 31 b) Az ösztradiol akut relaxáns hatása ovariektomizált és ösztrogénpótolt patkányok prekontrahált saphena artériáin 31 c) Az ösztradiol akut relaxáns hatása ovarium-intakt kontrollcsoporton 31 d) A 17β-ösztradiol akut értágító hatásának összehasonlítása a három kísérleti csoportban 31 e) A krónikus ösztrogénkezelés hatása a papaverin és a nifedipin okozta vazodilatációra 32 f) Az ösztradiol, a papaverin és a nifedipin relaxáló hatásának összehasonlítása 34 Megbeszélés 35 A női nemi hormonok akut vazorelaxáns hatása 35 A krónikus ösztrogénkezelés és az akut, nongenom ösztradiolhatás közötti interakció 38 A kísérleti eredmények összefoglalása, új megállapítások 44 Az irodalmi adatok összevetéséből és a kísérletekből levonható következtetések 44 Klinikai jelentőség 45 Köszönetnyilvánítás 47 Irodalomjegyzék 48 Saját közlemények jegyzéke 84 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények 84 Az értekezés témájában megjelent idézhető absztraktok 86 Előadások, poszterek 87 2

Rövidítések jegyzéke Ach: acetilkolin BK Ca : Ca2+- és feszültségfüggő K+-csatornák cgmp: ciklikus guanozin-monofoszfát enos: endoteliális nitrogén-monoxid szintáz EPK: ösztrogénpótló kezelés ER: ösztrogén receptor inos: indukálható nitrogén-monoxid szintáz L-NAME: N-omega-nitro-L-arginin-metil-észter L-NNA: N-omega-nitro-L-arginin MAPK: mitogén aktivált protein-kináz NO: nitrogén-monoxid NOS: nitrogén-monoxid szintáz nnos: neuronális nitrogén-monoxid szintáz PGI 2 : prosztaciklin TK: tirozin-kináz 3

Összefoglaló Háttér: Az ösztrogénpótló kezelés szív-érrendszeri védőhatása antiaterogén és hemodinamikai hatásaiból adódhat. Mind az akut, mind a krónikus ösztrogenkezelés befolyásolja az erek tónusát és reaktivitását. A hormon akut érfali hatásait eddig nagyereken, főként koronáriákon vizsgálták. Nem tanulmányozták a perifériás rezisztencia, ezáltal a vérnyomás és a szöveti perfúzió meghatározásában alapvető szerepet játszó kisartériákra kifejtett hatásukat. Ugyancsak nem tisztázott, hogy a meglévő hormonális állapot mennyiben befolyásolja az akut érhatásokat, és milyen mechanizmusok révén. Kevés adat áll rendelkezésünkre a progeszteron krónikus és akut érfali hatásait illetően is. Célkitűzés: 1. A 17β-ösztradiol és a progeszteron kiserek tónusára kifejtett akut hatásának vizsgálata. 2. Annak vizsgálata, hogy az ösztradiol akut in vitro kisartéria-relaxáló hatását befolyásolja-e az azt megelőző hormonpótló kezelés. Módszerek: Első kísérletsorozatunkban nőstény Sprague-Dawley patkányok saphena artéria szakaszain in vitro mikroangiográfia segítségével mértük a szteroidhormonok akut hatását. Noradrenalinprekontrakció után a szervfürdő oldathoz 17β-ösztradiolt (n=8), majd egy másik érsorozaton progeszteront adtunk az oldathoz (n=8) kumulatív dózisokban. Az ösztradiolhatás specificitásának ellenőrzése céljából további sorozatokban harmadik szerként dexametazont (n=7) illetve a sztereospecifitás vizsgálatára 17α-ösztradiolt (n=7) alkalmaztunk. Végül az utolsó csoportban ismét az ösztradiol dózis-hatás görbéjét vettük fel ösztradiol-plazmareceptor antagonista jelenlétében (n=7). Második kísérletsorozatunkban ovarium-intakt (n=9), ovariektomizált (n=8), illetve ovariektomizált+ösztrogénpótolt (n=10) állatokon vizsgáltuk a 17β-ösztradiol akut relaxáló hatását. Hogy a krónikus ösztradiolkezelés általános relaxációs mechanizmusokra való hatását kizárhassuk, további ovariektomizált (n=8) és ösztrogénpótolt (n=8) állatok prekontrahált erein a papaverin és a nifedipin dózis-hatás görbéjét vettük fel az ösztradioléhoz hasonló módon. Eredmények, új megállapítások: A nagyerekhez hasonlóan a perifériás kisartériákon is megfigyelhető a 17β-ösztradiol azonnali és nem a klasszikus hormonreceptor által közvetített, tehát nongenom relaxáns hatása. Ez a hatás endotheliumtól független, direkt simaizomhatás. Hasonló akut relaxációs válasz észlelhető a kisereken progeszteron és 17α-ösztradiol alkalmazásakor, míg dexametazon alkalmazása esetén nem. Elnyújtott ösztrogénkezelés hatására az ösztradiol akut adásával kiváltható kisér-relaxáció mértéke jelentősen csökken. Az elnyújtott ösztrogénkezelés akut ösztradiolválaszt csökkentő hatása ösztradiolra specifikus, a papaverin és a nifedipin értágító hatását nem befolyásolja. Az elvégzett in vitro vizsgálatokban az ösztradiol által okozott akut relaxáció mértéke megközelítette az ugyanolyan koncentrációjú papaverin és nifedipin értágító hatását. Következtetés Az ösztrogén akut, nongenom közvetlen simaizom-relaxáló hatása perifériás kisartériákon is megfigyelhető. E hatás csak mikromólos koncentrációban érvényesül, kevéssé specifikus. A krónikus kezelés csökkenti a hormon akut kisér-relaxáló hatását. Megállapítható tehát a genom (a különböző gének működését befolyásoló) és az akut, nongenom mechanizmus faktorai közötti interakció. 4

Abstract Background: The cardiovascular benefit of estrogen replacement therapy may be due to its antiatherogenic and on the other hand, to its haemodynamic effects. Both acute and chronic administration of estrogen affect vascular tone and reactivity. The acute vascular effects of the hormone have been studied only on large vessels, mostly on coronaries. The effects of the hormone on small arteries that play an important role in determining the peripheral vascular resistance, blood pressure and tissue perfusion have not been characterized yet. Also few data are available about the influence of hormonal status on acute vascular effects of estradiol and about the chronic and acute vascular effects of progesterone. Objective: 1. To study the acute effects of 17β-estradiol and progesterone on small arteries. 2. To study whether chronic estrogen replacement therapy alters the acute vasodilatory action of estradiol. Methods: In the first series of experiments we determined the acute effects of the steroid hormones on isolated saphenous artery segments from female Spraque-Dawley rats using in vitro microangiography. After precontraction with norepinephrine, 17β-estradiol, then in an other set of experiments, progesterone was added to the bath in cumulative doses. To study the specifity of the acute estradiol effect, in further sets of experiments dexamethasone and 17α-estradiol were administered. Finally we controlled the effect of estradiol in the presence of estradiol receptor antagonist. In the second series of experiments the acute effect of 17β-estradiol was studied on vessels from ovary intact, ovariectomized and ovariectomized + estrogen replaced animals. To test a potential nonspecific effect of chronic estrogen therapy on the general relaxation mechanisms, concentration response curves with nifedipine and papaverine were recorded on precontracted saphenous arteries of ovariectomized and ovariectomized + estrogen replaced animals. Results: The immediate and not receptor-mediated, thus nongenomic relaxing effect of 17β-estradiol could be observed on peripheral small arteries, similar to previous findings on large vessels. This effect of the hormone is endothelium independent. Administration of progesterone and 17α-estradiol also causes acute relaxation of small arteries, while administration of dexamethasone does not. The acute vasodilatory action of estradiol on small arteries is attenuated by long-term estrogen treatment. This effect of long-term estrogen treatment is specific for estradiol, it does not alter the relaxations caused by nifedipine or papaverine. In these in vitro studies the vasorelaxing effectiveness of 17β-estradiol was comparable with that of well-known vasodilating agents. Conclusion: The acute, nongenomic, direct smooth muscle relaxing effect of estrogen can be observed both on large vessels and on small arteries. This effect can be detected only at micromolar doses of estradiol, and it is not specific. The acute relaxing effect of the hormone on small arteries is downregulated by chronic estrogen treatment, suggesting that an interplay should exist between the genomic and nongenomic actions of this female sex hormone. 5

Bevezetés és irodalmi háttér Irodalmi adatok bizonyítják, hogy hasonló korú férfiakhoz viszonyítva a menopauza előtt lévő nők körében a koronáriabetegség, az esszenciális hipertónia és a stroke incidenciája alacsonyabb, míg ugrásszerűen megnő a menopauza után (12,70,121,160,196). Több nagy populációt vizsgáló epidemiológiai tanulmány eredményei azt is igazolják, hogy a posztmenopauzális hormonpótlás védő hatást gyakorol mind a cerebro- mind a kardiovaszkuláris betegségek ellen (92,196,237,238,257). Ugyanakkor néhány vizsgálat eredményei arra figyelmeztetnek, hogy a populációnak létezhetnek olyan alcsoportjai, amelyek fogékonyabbak lehetnek a hormonpótló kezelés korai protrombotikus hatására (112), ilyen például a 20210 G A protrombinvariánssal rendelkező hipertóniás nők csoportja (208). Az ösztrogéneknek számos klinikailag előnyös hatását mutatták ki a lipid profilra, az LDL-oxidációra, a lipoprotein(a)-szintre, a koleszterin érfali lerakódására és a sejtproliferációra (3,38,78,172,191,220,232), azonban az antiaterogén hatások csak mintegy 25-50%-ban járulnak hozzá a kardiovaszkuláris események gyakoriságának csökkentéséhez (38,238). Egyre nagyobb jelentőséget tulajdonítanak a szív-érrendszeri betegségek megelőzésében az ösztrogének hemodinamikai hatásainak is (81). Régóta ismert, hogy az ösztrogén a vaszkuláris kontraktilitást csökkenti, a véráramlást növeli mind akutan, mind krónikusan alkalmazva (149,150,233). A szteroid hormonok genom (a különböző gének működését befolyásoló) hatásai mellett már a régebbi irodalomban is többször felmerült egy lehetséges gyors, nongenom hatás létezése is (228,234). E korai megfigyelések ellenére a szteroidok akut, nongenom hatásai csak az utóbbi években kerültek az érdeklődés középpontjába (73). Több klinikai tanulmány bizonyította például az akut szublingvális ösztradiolkezelés jótékony hatását myocardiális ischaemiában (216,217). A legújabb adatok alapján úgy tűnik, hogy akut alkalmazásakor az ösztrogén hatással van mind az érfali endotéliumsejtekre, mind a simaizomsejtekre. Bár számos munkacsoport vizsgálta az ösztrogének akut érhatásait, még mindig nem teljesen tisztázott a hatásmechanizmus, több hipotézis is született (specifikus membránreceptorok, közvetlen hatás a membránfluiditásra, second messengerek, kalcium-homeosztázis). Ugyancsak nem tisztázott, hogy a meglévő hormonális státusz 6

mennyiben befolyásolja az akut érhatásokat, és milyen mechanizmusok révén. Kevesebb adat áll rendelkezésünkre a progeszteron érfali hatásait illetően, annak ellenére, hogy már kiterjedten használják posztmenopauzális hormonpótló kezelés részeként az endometrium hiperplázia és karcinoma kialakulásának kockázatát csökkentendő. A hosszútávú ösztrogénkezelés vaszkuláris hatásai a) A tartós ösztrogénkezelés hatása a vérnyomásra A magas vérnyomás kisebb gyakorisággal fordul elő és kevésbé súlyos menopauza előtt a nőkben, mint a hasonló korú férfiakban, azonban menopauza után a szisztolés és a diasztolés vérnyomás is magasabb lesz nőkben a férfiakhoz viszonyítva (39,115, 235,236), jelezve, hogy az endogén női hormonok antihipertenzív hatásúak. A fogamzásgátló tablettát szedő fogamzóképes korú nők körében viszont valamivel magasabbnak találták a hipertenzió kialakulásának incidenciáját, amely azonban a természetes ösztrogének bevezetésével és a hormonadagok fokozatos mérséklésével csökkent (153,275). A kontraceptívumok hipertenzív hatása a testsúly, plazmatérfogat, pulzustérfogat, a renin szubsztrát angiotenzinogén expresszió és a szimpatikus-adrenerg aktivitás növelésével hozható kapcsolatba (27,79,90,264). Ez a tapasztalat sokáig gátolta a hormonpótló kezelés indikációját hipertóniás nőknél, bár epidemiológiai adatok szerint a hormonpótolt nők vérnyomása nem magasabb, illetve egyes vizsgálatok szerint éppen alacsonyabb, mint a hormont nem szedő posztmenopauzás nőké (13,180). Saját klinikai vizsgálatunkban a magas rizikócsoportba tartozó, kezelt hipertóniás, cukorbeteg nőkben a 3,5 hónapos kombinált hormonpótló kezelés még nem változtatta szignifikánsan a vérnyomást, ellenben csökkentette a proteinuria mértékét és javította a creatinin-clearance-t (245). Az "office" vérnyomásmérést alkalmazó vizsgálatokkal (10,132,245) ellentétben, a részletesebb információt adó 24 órás vérnyomásmonitorozással (ABPM) kapott eredmények szerint posztmenopauzában a hormonpótlás csökkenti a vérnyomást mind normotenziósokban mind hipertóniásokban, helyreállítja a fiziológiás napszaki ritmust és mérsékli a vérnyomás variabilitását (97,158,243,244,256). Pines és mtsai megfigyelése szerint enyhe hipertóniásoknál a hormonpótló kezelés hatására nemcsak a nyugalmi szisztolés vérnyomás csökkent, 7

hanem a terhelésre adott szisztémás vérnyomásválasz is (205). Egyes állatkísérletekben szintén kimutatták a hosszútávú ösztrogénpótlás hipertenzió kialakulását gátló illetve vérnyomást csökkentő hatását (100,104,240,273). Posztmenopauzális hormonpótlás esetén az aterotrombotikus folyamatok előrehaladásának gátlása mellett (246) az észlelt vérnyomáscsökkenés hátterében az ösztrogén számos értónust csökkentő hatása állhat, így a baroreflex érzékenység visszaállítása (64,169), valamint a továbbiakban részletesen tárgyalt endotél dependens és -independens értágító hatások. b) A tartós ösztrogénkezelés hatása a vaszkuláris reaktivitásra Régi megfigyelés, hogy normál terhességben - amikor az ösztrogéntermelés hosszantartóan magas - a megnövekedett plazmatérfogat, sóretenció és a magas angiotenzin szintek ellenére jelentősen csökken az érellenállás és a vaszkuláris reaktivitás, ezek eredményeképpen alacsonyabb a vérnyomás (144,151,175,197). Az ösztrogénpótló kezelés vaszkuláris reaktivitást befolyásoló hatásaival kapcsolatosan jónéhány, részben ellentétes eredménnyel zárult vizsgálat került publikálásra. A hormon a renin-angiotenzin rendszer és a szimpatikus-adrenerg rendszer számos komponensét módosítja (194). Növeli a renin-szubsztrát angitenzinogén expresszióját (98) és a plazma renin aktivitást (35). Ugyanakkor egyes kísérletek alapján csökkenti az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) aktivitását (34,207,247), az erek simaizomsejtjeiben az angiotenzin-1 (AT1) receptor expresszióját (190) valamint az erek angiotenzin II-reaktivitását (34,46,149,173,182,225). Léteznek ugyan régebbi megfigyelések is, melyek szerint az ösztrogénkezelés nem változtatott az angiotenzin IIválaszkészségen (186). Több munkacsoport leírta a noradrenalin-válaszkészség növekedését tartós (15-28 nap), magas dózisú ösztrogénkezelés hatására patkány és nyúl aortákon és patkány mesenterium-ereken (23,46,49,163). Munkacsoportunk kísérleteiben a 3 illetve 1 hónapos hormonpótló kezelés ovariektomizált patkányok saphena artériáin szintén növelte az adrenerg reaktivitást (2,258). Az adrenerg válaszkészség növekedésének mechanizmusaként az α1-receptorok számának és affinitásának növekedése, a noradrenalin-újrafelvétel változása illetve az általános fehérjeszintézis-fokozó hatás részeként a kontraktilis fehérjék mennyiségének növekedése vethető fel (23,57,147). Az 8

említett vizsgálatokkal ellentétben mások szintén elhúzódó (2-21 nap) ösztrogénkezelés következményeként a noradrenerg reaktivitás csökkenését észlelték hasonló preparátumokon (6,88,154,200). Huang ösztrogénpótolt patkányok arterioláin szintén kisebb mértékű norepinephrin-konstrikciót talált, mint az ovariektomizált állatokéin (107). Többen az adrenerg-reaktivitást csökkentő hatást NO-dependensnek találták (6,107,200). Az említett kísérletekben hasonló ösztrogénvegyületeket használtak: 17βösztradiolt, 17β-ösztradiol-benzoátot, -sztearátot és propionátot azokban a vizsgálatokban is, ahol a noradrenerg-válaszkészséget növelő hatást tapasztaltak, és azokban is, ahol ennek ellenkezőjét találták. Az eltéréseket az eredményekben a hormonkezelések időtartamának és adagjának különbözősége is okozhatja, elképzelhető például, hogy az alacsonyabb dózisban jelenlévő folyamatot elfedi egy magasabb dózisban fellépő ellentétes irányú mechanizmus (76). c) A tartós ösztrogénkezelés hatása az értónus lokális, autokrin-parakrin szabályozására Krónikus ösztrogénkezelés az ateroszklerotikus ereken az Ach-ra adott kóros érösszehúzódást értágulatra változtatja, ép endotéliummal rendelkező ereken pedig erősíti az Ach okozta endotéliumfüggő értágulatot (83,89,101,189,259,270,273). Szintén erősíti a bradikinin és substance P (106,125), továbbá az áramlás (shear stress) okozta endotéldependens értágulatot (107,109,141,201). Az ösztrogénkezelés ezen endotéliumfüggő hatásai nitrogénmonoxid-szintáz (NOS) gátlókkal (L-NNA, L-NAME) csökkenthetők ill. megszüntethetők (83,106-109), és kapcsolatba hozhatók az endoteliális NO-szintáz (enos) fokozott expressziójával és fokozott nitrogénmonoxid (NO) termeléssel (103,123,148,277). A NO aktiválja a guanil-cikláz enzimet, így növeli a cgmp-szintet. Ez utóbbi cgmp-dependens protein-kinázokon keresztül a simaizomsejtek K+-csatornáinak aktivációjához, a membránok hiperpolarizációjához, a Ca2+-csatornák záródásához, s így az intracelluláris Ca2+ csökkenéséhez és relaxációhoz vezet (32,52,267,278). Az értágító, aggregációgátló (170) és simaizom-proliferációgátló (58) NO termeléséért felelős NOS három formáját különítették el, ezek három különböző genom expressziójaként szintetizálódnak: 1) az endoteliális sejtekben jelenlévő Ca2+ által aktiválható konstitutív enos, 2) az először idegsejtekben leírt, szintén Ca2+- 9

dependens, konstitutív nnos és 3) a különböző szövetekben megtalálható, Ca2+independens, citokinekkel indukálható inos enzimek (130). Nemrég megismert tény, hogy nnos termelődik az érfali simaizomban is (31). Juhok méhének artériáiban az észlelt NOS-mennyiség 40%-át ez a simaizomban termelt izoenzim alkotja, és krónikus ösztrogénkezelésre mind az endotéliumban, mind a simaizomban termelt NOS enzim expressziója fokozódik (223). Néhány adat arra utal, hogy az ösztrogén nemcsak konstitutív NOS enzimek (enos, nnos) expresszióját szabályozza (266), hanem a Ca2+-independens, citokinekkel és bakteriális lipopoliszaharidokkal indukálható NOS (inos) szintézisét is (110). Ezt támasztják alá Binko és mtsainak eredményei: az ösztradiolkezelés endotéliumirtott patkány aortákon a simaizomsejtekben is növelte a NOS aktivitást és ezáltal csökkentette a phenylephrin (α1 adrenerg agonista) kontrakciót. A hatás megelőzhető volt a protein szintézis gátlásával (cikloheximid), továbbá ösztrogén-receptor antagonistával (ICI-182,780). Western blot technikával kimutatták a 24 órás ösztradiolkezelés inos termelését indukáló hatását, mely szintén gátolható ösztrogén-receptor antagonistával (29). A NO szintjét a NOS enzim működésétől függetlenül is befolyásolhatja az ösztrogén. Az antioxidáns tulajdonsággal is rendelkező NO koncentrációja csökkenhet érfalkárosodáskor, és/vagy gyulladás esetén, amikor a reaktív szabadgyökök mennyisége emelkedik. Az endotéliumban is jelen van a xantin-oxidáz enzim, mely a szuperoxid-gyök termeléséért felelős (139). Az önmagában is vazokonstriktor hatású szuperoxid-anion jelentősen hozzájárul a NO csökkentéséhez (9), NO-dal reagálva peroxinitritté alakul, ami további reaktív gyökökre bomlik, és résztvesz a membránok lipidperoxidációjában (255). A női hormon antioxidáns hatása révén (219,222,226,) szabadgyök-scavenger-ként védi a NO-ot. Előzetes kísérleteinkben a szteroid hormonok humán neutrofil granulociták szuperoxid termelésére és myeloperoxidáz (MPO) aktivitására kifejtett hatását vizsgálva azt találtuk, hogy az ösztrogén csökkenti a granulociták szuperoxid-anion termelését, melynek mechanizmusában valószínűleg a hormon által fokozottan termelt MPO által létrejövő negatív feedback is részt vesz (18,19,20). Endotéliumsejteken is kimutatták, hogy az ösztrogén - receptorán keresztül - a szuperoxid-termelés gátlása révén növeli a NO-szintet (8). A tartós ösztrogénexpozició fokozza a prosztaglandin-ciklooxigenáz gén expresszióját, illetve az értágító hatású prosztaciklin produkcióját, az erek endotélium- 10

és simaizomsejtjeiben (42,120,162,262). Többen leírták a posztmenopauzális hormonpótló kezelés hatására az erős vazokonstriktor hatással bíró endotelin plazmaszintjének csökkenését is (25,44,94, 253,269). Humán endotélium sejtekben kétnapos ösztradiol-inkubációval az endotelin-1 mrns expressziójának csökkenése idézhető elő, részben direkt ösztrogénhatásra, részben pedig az NO-termelés növelésén keresztül (28). Bár a különböző fajokon, értípusokon különböző módszerrel kapott eredményekben, illetve azok mértékében különbségek észlelhetőek, úgy tűnik, hogy a tartós ösztrogénkezelésnek az értónust szabályozó lokális faktorokra kifejtett hatásai mindenképpen a relaxáció irányába mutatnak. d) Az ösztrogén genom hatásmechanizmusa A fenti, viszonylag hosszabb távú kezelésre létrejött hatások eléréséhez (a többi szteroid hormon genom hatásaihoz hasonlóan) a zsíroldékony ösztrogénmolekula átjut a sejtmembránon, kötődik az intracelluláris ösztrogén receptorhoz (ER). Ez a ligandreceptor komplex a sejtmagba jutva kapcsolódik az általa szabályozott gének promoter szakaszának megfelelő DNS szekvenciáihoz (estrogen response element, ERE), és transzkripciós faktorként szabályozza a génexpressziót (15,17,69,133,177). E folyamatokra jellemző a késleltetett (4-24 óra) hatás, továbbá a specifikus ösztrogénreceptor (ER) -gátlókra és a transzkripciót, transzlációt gátló vegyületekre való érzékenység (16,48). Humán endotélium sejtekben például a NOS expresszió növekedését csak 24 óra (274), a prosztaciklin termelés növekedését 12 óra (161) elteltével észlelték. Az ösztrogénkezelés enos-, inos- és PGI2- szintézist fokozó, továbbá endotelin-szintézist csökkentő hatása is gátolható ösztrogén-receptor antagonistával (4,29,161,277). Mind az endoteliális enos-gén, mind simaizomsejtekben lévő inos-gén környezetében találtak ösztrogén-receptort kötő elemeket (43,80,168), ami alátámasztja, hogy a hormon ösztrogén-receptoron keresztül szabályozza a NOS gének expresszióját. A klasszikus intracelluláris ösztrogénreceptorok jelenlétét leírták az érfalban mind az endotél- (105,128,142,145,260), mind a simaizomsejtekben (122,195,202). Az ösztrogénreceptorok nemrég felfedezett béta típusának (ERβ) létezését is bizonyították mindkét sejtben (113,152,210). Patkány aortán és farokartérián a béta receptorok 11

expresszióját magasabbnak találták, mint az alfa receptorokét, míg méhartériákon az alfa receptorok dominálnak (7). Néhány nappal kísérletes érsérülés után a béta ösztrogénreceptorok expresszióját emelkedettnek találták patkányok endotél- és simaizomsejtjeiben (143). Az ateroszklerotikus plakkokban azonban hiányoznak az ösztrogénreceptorok (145). Az ösztrogének akut érhatásai A genom hatásokon túlmenően Pietras és Szegő már 1975-ben az ösztrogénnek az endometriumsejtek Ca2+-áramlására kifejtett azonnali hatásáról számoltak be (203). A tartós hormonkezelés hemodinamikai hatásai mellett szintén régóta leírták az ösztrogén viszonylag rövid időn belül létrejövő értágító hatását (150,213,233). Ennek ellenére az ösztrogén akut, nongenom hatásaira vonatkozó kutatások csak az utóbbi években gyorsultak fel. Az értónus szabályozása az ösztrogén által történhet a hormon direkt, simaizomra, továbbá indirekt, endotéliumra kifejtett hatásai révén. a) interakció az endotéliummal Klinikai vizsgálatok eredményei szerint az ösztradiol egyszeri fiziológiás dózisának alkalmazása után rövid időn belül észlelhetőek bizonyos endotél-dependens válaszok. A hormon akutan is fokozza az Ach által kiváltható endotéliumfüggő értágulat mértékét posztmenopauzális korú nők koszorúerein, alkari és femorális verőerein (55,84,86). Szintén fokozza a bradikinin- és az áramlás okozta vazorelaxáció mértékét (5,14,54,67). Valamivel magasabb dózist alkalmazó akut klinikai vizsgálatokban az érellenállás csökkenése, a véráramlás növekedése már önmagában is kimutatható ösztradiol hatására mind a koronáriákon, mind az alkar és a comb verőerein. Ez utóbbiak mechanizmusában azonban humorális és endotélium által termelt vazoaktív faktorok, továbbá direkt kölcsönhatás az erek simaizomsejtjeivel egyaránt szerepelhetnek (211,214,261). Állatkísérletekben szintén bizonyították az ösztradiol endotélium-eltávolítással, NO-szintáz- és PG-szintáz gátlásával részben vagy egészben megszüntethető - tehát endotéliumfüggő - akut relaxációt okozó (134,254) illetve Ach-relaxációt potencírozó hatását (248). 12

Az azonnali endotéliumfüggő válaszokat azzal magyarázzák, hogy az endotélsejtekben a fiziológiás koncentrációjú ösztradiol akutan (<5 perc) fokozza az endoteliális NO-szintáz (enos) aktivitását, az NO-termelést - az enos protein szintjének növekedése nélkül. Az enos aktivitásának fokozódását az intracelluláris Ca2+-szint emelkedése előzi meg, a jelenség gátolható az ösztrogén-receptor és a Ca2+beáramlás gátlásával (127,135,239). Emellett akut ösztrogénhatásra az enos-aktivitás Ca2+-independens fokozódását is leírták már (40). Az ösztrogén által okozott enos aktivitás-fokozódás mechanizmusában egyes szerzők a foszfoinozitol 3-kináz (PI3, 99,102) valamint a tirozin-kináz- (TK) és a mitogén aktivált protein-kináz (MAPK) jelzőrendszer részvételét jelzik (45,221,230), hasonlóan a bradikinin esetében leírtakhoz (77). b) direkt hatás az erek simaizmára Más munkacsoportok - szuprafiziológiás dózisokban - az ösztradiol akut endotélium-független relaxációs hatását írták le in vivo kutyák és sertések koronáriaerein intrakoronáriás Doppler módszerrel (24,241) és in vitro körülmények között izometriás tenzióméréssel prekontrahált nyúl-, sertés- és patkánykoronáriagyűrűkön (6,116,118,268), humán koronáriagyűrűkön (47,179), továbbá nyúl agyi artériákon (83). Ezen endotélium-eltávolítással nem megszüntethető, azonnali nagyér relaxáló hatás hátterében a simaizomsejtek L-típusú feszültségfüggő Ca2+csatornákon keresztül történő Ca2+-felvételének direkt gátlása, az intracelluláris Ca2+szint csökkentése (60, 83,95,116,185,229,280) és ezáltal a kontrakciót elindító miozin könnyű lánc foszforilációjának csökkentése állhat (129). Egyes eredmények szerint a simaizomsejtekben az ösztradiolnak nincs hatása az intracelluláris raktárakból való Ca2+-felszabadulásra (59,61,129), míg egy másik, patkány mesenterium rezisztencia artériáin végzett kísérletnél a relaxáló hatást éppen a hormon intracelluláris Ca2+felszabadulást gátló hatásával magyarázták (183). Az intracelluláris Ca2+-szint változtatásán kívül a K+-csatornák aktivációja szintén szerepel az ösztradiol érfali simaizomra kifejtett hatásai között. A simaizomsejtek K+-csatornái az értónus fontos szabályozói az ereken (187). Harder több, mint 20 évvel ezelőtt leírta, hogy kutya koronáriák simaizomsejt-membránján az ösztrogén akutan növeli a K+-csatornák konduktanciáját (96). 15 évvel később White és 13

mtsainak sertés koronária artériákon végzett kísérletében az ösztrogén okozta akut relaxációt 80%-kal csökkentette a K+-csatornák előzetes blokkolása iberiotoxinnal. További eredményeik alapján feltételezték, hogy az ösztradiol stimulálja a Ca2+és feszültségfüggő K+-csatornák (BK Ca ) cgmp-dependens foszforilációját, ezáltal a simaizomsejtek repolarizációját és következményes relaxációját idézve elő (268). Egyes munkacsoportok - kutyák és sertések koronáriáin és juhok méhartériáin végzett in vivo és in vitro - kísérleteiben az akut értágító hatás csak NOS-gátló és K+-csatorna-gátló együttes alkalmazása, vagy guanilcikláz-gátló alkalmazása esetén szüntethető meg teljesen. E szerzők szerint a hormon - az endoteliális és simaizom NOS enzimek aktivitásának serkentése révén - növeli a NO-termelést, ami fokozza a simaizomban a guanilcikláz enzim aktivitását. A megnövekedett cgmp aktiválja a cgmp-dependens kinázt, utóbbi pedig a BK Ca -csatornákat (62,193,218). Mások ezzel szemben patkány és kutya koronáriákon ultrahangos áramlásméréssel kimutatták ugyan a K+- és Ca2+csatornákra kifejtett hatást, de a NO-szintézis gátlásával nem csökkent az akut ösztrogén-relaxáció mértéke, ezek szerint a K+-csatornák aktivációja NO-tól független (111,241). Valverde szarvasmarha aorta-simaizomsejtekből származó K+-csatornákat szintetikus kettős-lipid rétegbe ágyazva bizonyította a 17β-ösztradiol közvetlen kötődését a csatornák β-alegységeihez, illetve a hormon K+-csatorna- aktiváló hatását (252). Úgy tűnik tehát, hogy - bár a különböző speciesekben a sejten belüli mechanizmusok eltérhetnek - koronária- és méhartériákon, illetve aortán az ösztrogén akut relaxáló hatásában a simaizomsejtek K+-csatornáinak direkt vagy indirekt aktivációja legalább részben szerepel. c) Az ösztrogén nongenom hatásmechanizmusa Az előzőeket összefoglalva, az ösztrogént akutan alkalmazva az ereken azonnali válasz észlelhető. Fiziológiás dózisban alkalmazva erősíti a különböző stimulusok által kiváltott endotélfüggő relaxációt, míg nagyobb koncentráció esetén önmagában is relaxációt okoz. A mechanizmusra vonatkozó adatok alapján úgy tűnik, hogy ezen akut válaszok több támadásponttal, mind az endotéliumsejtekben mind a simaizomsejtekben kialakuló reakciók eredményeként jönnek létre (1. ábra). E sejten belüli mechanizmusok, illetve azok dominanciája különbözhet az eltérő fajoknál és 14

értípusoknál. A simaizomsejteken hatása általában 1µM-nál nagyobb koncentrációban érvényesül, a feszültségfüggő Ca2+-csatornák gátlása és a K+-csatornák aktivációja a legvalószínűbb hatásmechanizmus. Az endotéliumsejtekben, ahol a feszültségfüggő Ca2+-csatornák hiányoznak, a hormon az intracelluláris Ca2+-szint emelkedését, ezen keresztül a NOS enzim aktivitásának fokozódását idézi elő már fiziológiás dózisban is (123). 1. ábra Az ösztrogén akut értágító hatásának eddig leírt nongenom mechanizmusai Az endotéliumsejtekben membránreceptoron keresztül a NOS-aktivitást fokozza, míg a simaizomsejtekben az ioncsatornák működését befolyásolja, ezáltal a kontrakció-relaxáció folyamatát szabályozza. NO: nitrogén-monoxid, NOS: nitrogénmonoxid szintáz, MAPK: mitogén aktivált proteinkináz, TK: tirozin-kináz, GTP: guanozin-trifoszfát, cgmp: ciklikus guanozin-monofoszfát, MLCK: miozin könnyűlánc-kináz, Miozin-Pi: foszforilált miozin Mindezen folyamatoknál a reakcióidő rövidsége kizárja a klasszikus genomhatás lehetőségét. Gyors, nongenom ösztrogénhatásokat a vaszkuláris szöveteken kívül több 15

helyen is leírtak, többnyire a Ca2+-homeosztázissal és különböző ioncsatornák működésével kapcsolatban - így endometriumsejteken, hipofízissejteken, idegsejteken, T-sejteken, pancreas β-sejteken, spermiumsejteken (22,26,93,126,136,146,159,181,203). A szteroid hormonok gyors hatásaival foglalkozó első nemzetközi találkozón 1998-ban, Mannheimban született klasszifikáció szerint a szteroidok akut, direkt hatásai két csoportra oszthatók: I. Nem specifikus hatások, ahol a hormon receptorhoz való kötődés nélkül, közvetlenül a membránnal kerül kölcsönhatásba, változtatva annak fizikokémiai tulajdonságait. II. Specifikus hatások, melyek további két csoportra oszthatók: a) membránban elhelyezkedő klasszikus szteroid-receptorokon keresztül és b) nem klasszikus receptorokon keresztül létrejövő hatások (72). Az ösztradiol vaszkuláris hatásai közül a membránban elhelyezkedő klasszikus receptorokon keresztül érvényesülő gyors hatásra (mannheimi klasszifikáció szerinti IIa csoport) példa az előbbiekben említett endoteliális NO-szintáz (enos) aktivitásának fokozása, mely fiziológiás dózisú és membrán-impermeábilis ösztradiollal is kiváltható, gátolják klasszikus ösztrogén-receptor antagonisták, ugyanakkor nem gátolják transzkripciót és transzlációt gátló szerek (45,73). Az endotéliumsejtek felszínén elhelyezkedő ösztrogén receptor egy újszerű, nongenom, Ca2+-dependens mechanizmussal - feltehetőleg a TK- vagy MAPK jelzőrendszer közvetítésével - aktiválja az enos enzimet (45,230). Ehhez a gyors (< 5 perc) hatáshoz nem szükséges a NOS gén expresziójának növekedése, csak olyan proteinek részvétele, amik kölcsönhatásba lépnek az ER-ral és aktiválni képesek a NOS enzimet (156,230). A klasszikus ösztrogénreceptorral egyező szerkezetű, de a sejtmembránban elhelyezkedő ösztrogénreceptorok létezését régóta feltételezik (33,188,203), funkcionálisan membrán-impermeábilis ösztrogén hatásosságával többféle szövetben bizonyították jelenlétüket (22,93,146, 159,181,239). Morfológiailag anti-ösztrogén antitestek, illetve jelzett ösztrogén segítségével mutatták ki e membránreceptorokat (22,26,50,171). Pappas patkány hipofízissejtek felszínén az ösztrogénreceptorok két altípusát (ERα és ERβ) is elkülönítette (199). Endotéliumsejtekben is kimutatták a sejtmembránban elhelyezkedő ösztrogénreceptorokat (127,276). Az endotéliumon érvényesülő hatásával szemben az ösztradiol közvetlen simaizom relaxáló hatása nem gátolható klasszikus receptor-antagonistákkal, és csak a 16

fiziológiásnál jóval magasabb koncentrációban váltható ki. Elképzelhető, hogy egy - a klasszikus receptoroktól eltérő farmakológiai tulajdonságú - még nem azonosított membránreceptorhoz kötődik (mannheimi klasszifikáció szerinti IIb csoport). Ilyen klasszikus receptoroktól genetikailag és farmakológiailag különböző membránreceptorok létezését feltételezik hippocampus-sejteken Moss és mtsa (174), vaszkuláris simaizomsejteken Farhat és mtsai (75). Másik lehetőség (mannheimi klasszifikáció szerinti I csoport), hogy a hormon közvetlenül a foszfolipid kettős rétegbe ékelődik, változtatva annak fizikokémiai tulajdonságait (73). A farmakológiás dózisú ösztradiol membrán-fluiditást csökkentő hatását mutatták ki emlőcarcinomából és hüvelynyálkahártyából származó epitheliális sejteken (51,209). Az ösztradiol előzőekben tárgyalt, receptor-antagonistákkal nem gátolható, csak nagy dózisban észlelhető simaizomrelaxáló hatása mellett az egyik munkacsoport a hormon fiziológiás dózisban is érvényesülő endotéliumtól független relaxáns hatásáról is beszámolt (249,251). Mások a hormon közvetlen simaizomsejteken érvényesülő, de receptor-antagonistával (tamoxiphen, ICI-182,780) gátolható, Ca2+-homeosztázist befolyásoló akut hatását bizonyították (178,206). A hormonális állapot befolyása az ösztrogén akut érhatásaira a) Nemi különbségek az ösztrogén akut érhatásaiban Egyes munkacsoportok az ösztradiol akut relaxáló hatását nagyobb mértékűnek találták nőstény állatok erein, mint hímneműekén. Ez a nemi különbség megszűnt az endotélium eltávolítása után, azt sugallva, hogy az ösztradiol elsősorban nőnemű egyedek endotéliumával lép interakcióba, de létezik ezenkívül egy endotélium független hatásmechanizmusa is, mely hímekben is aktiválható (137,155). Más munkacsoportok azonban az endotélium-független értágító hatást is nagyobbnak találták nők koronáriáin és nőstény patkány aortákon in vitro illetve nőstény sertések koronáriáin in vivo (24,47, 111,179). Ezekkel ellentétben többen hím patkányok és tengerimalacok aortáin és mesenteria artériáin észleltek nagyobb endotélium-független relaxáló hatást (60,184,232). Mindezekből megállapítható, hogy bár az ösztrogén hatásának sokféle mechanizmusa még nem tisztázott, a meglévő hormonális státusz nagymértékben befolyásolhatja az akutan alkalmazott ösztradiol érfali hatásait (mindamellett, hogy a 17

faj, az ér jellege, eredete, mérete és a vizsgálati módszerek közötti különbségek szintén okozhatnak eltéréseket az eredményekben). b) A hormonális állapot befolyása az ösztrogén akut érhatásaira nőkben Blumenthal és mtsainak intrakoronáriás Doppler vizsgálataiban a nagydózisú estradiol akut iv. alkalmazásakor csak posztmenopauzás, nem hormonpótolt nők koronáriáin volt kimutatható a relaxációs hatás, hormonpótolt nőknél nem (30). Ezzel szemben mások azt találták, hogy az akut ösztradiol endotéliumfüggő vazorelaxáns hatását a tartós ösztrogénkezelés vagy nem befolyásolja, vagy éppen növeli (21,56,85,223). A progeszteron érhatásai Kevesebb és jóval ellentmondásosabb adat áll rendelkezésünkre a progeszteron krónikus és akut érfali hatásairól. A klasszikus progeszteron-receptorok szintén jelen vannak az artériák endotélium- és simaizomsejtjeiben (114,166). Emellett extravaszkulárisan sejtmembránban elhelyezkedő progeszteron-receptorokat is leírtak, melyek a progeszteron nongenom hatásaiért felelősek (11,41,124). Sertések artériáinak simaizomsejtjeiben pedig kimutattak egy DNS-szakaszt, mely egy, a sejtmembránban elhelyezkedő nagy affinitású progeszteron-kötő fehérje szintéziséért felelős (71). a) Az ösztrogénpótló kezelés vaszkuláris hatásainak módosulása progeszteron és progeszteron-származékok jelenlétében - Genom hatások A progeszteron gátolja a klasszikus intracelluláris ösztrogéreceptorok expresszióját minden szövetben, ezáltal csökkentve annak genom hatásait (224). Így progeszteron hozzáadása a krónikus ösztrogénkezeléshez csökkenti az utóbbi kedvező hatásait a lipidprofilra is (198,263). In vitro vizsgálatokban az előzetes krónikus progeszteronkezelés bár önmagában csak minimálisan változtatta a koronáriák tónusát valamint endotéliumfüggő és - független relaxációit, kombinációban csökkentette az ösztrogén koronáriaáramlást és 18

Ach-dilatációt fokozó hatását (91,164). Az erősebb progesztogén hatással rendelkező medroxiprogeszteron-acetát (MPA) hozzáadása az ösztrogénterápiához ovariektomizált majmokban és posztmenopauzás nőkben egyértelműen gátolta az ösztrogén Achdilatációt fokozó, vazokonstrikciót- és vaszkuláris rezisztenciát csökkentő hatását (87,166,167,224,242,272). Ezzel szemben más vizsgálatok szerint a progeszteron nem változtatja az ösztrogénterápia vérnyomáscsökkentő (227) és értágító hatását (82,166,167,271). Koronáriabetegségben szenvedő posztmenopauzás nőkben a négyhetes ösztradiolterápia növeli a myocardiális ischaemia jeleinek kialakulásáig eltelt időt terheléses vizsgálat során. Ezt a klinikailag előnyös hatást erősíti természetes progeszteron és csökkenti medroxiprogeszteron-acetát hozzáadása az ösztrogénpótláshoz (215). Majmokból izolált érsimaizom sejtkultúrákon pedig azt találták, hogy a 24 órás progeszteron-, illetve ösztrogénkezelés hasonló mértékben csökkenti a simaizomsejtekben a különböző agonistákra létrejövő Ca2+-szint emelkedést, mely hatások megszüntethetők progeszteron- illetve ösztrogénreceptor-gátlókkal (165). b) A progeszteron akut érhatásai Nongenom hatások Egy posztmenopauzás nőkön strain-gauge pletizmográfiás módszerrel végzett klinikai vizsgálatban a progeszteron akutan növelte az alkar artériáinak érellenállását, és csökkentette a vazodilátor-kapacitást (157). Ezzel szemben nyúl és sertés koszorúér-, továbbá patkány aortagyűrűkön izometriás tenzióméréssel a progeszteronnak az ösztrogénhez hasonló akut, endotélium-független vazorelaxáns és Ca2+-antagonista hatását figyelték meg - szintén fiziológiás feletti dózisban (59,60,117,250). Ugyanakkor patch-clamp technikát alkalmazva Nakajima azt találta, hogy míg az ösztrogének gátolták az L-típusú Ca2+-csatornák konduktanciáját, addig a progeszteron nem (185). 19

Célkitűzések A női nemi hormonok direkt érhatásait kísérletsorozatunk előtt többnyire csak nagyobb ereken - esetleg kisebb koronáriaágakon vizsgálták, nem tanulmányozták a perifériás keringési ellenállás meghatározásában és a hipertónia kialakulásában alapvető szerepet játszó kisartériákra kifejtett hatásukat. Szükségesnek véltük a vizsgálatokat ilyen kis erekre kiterjeszteni, mert a női nemi hormonok szív-érrendszeri protektív hatásaiban a nagyerek állapotának befolyásolása mellett alapvető fontosságúnak feltételeztük a kisartériákra kifejtett esetleges kedvező érfali hatásukat. E kisartériák fontos szerepet játszanak a perifériás rezisztencia, ezáltal a vérnyomás, a szöveti perfúzió és a szív utóterhelésének meghatározásában. Első kísérletsorozatunkban az ösztradiol és a progeszteron direkt értónust szabályozó hatását tanulmányoztuk patkányok saphena artériáin, melyek viszonylag könnyen izolálható, kb. 500µm átmérőjű muszkulokután kisartériák. Az ereket izolálva a keringő vazoaktív anyagok hatása és minden indirekt neurohumorális válasz kiiktatható. A szervezet összetett változásainak elemzésekor e perifériás ér-modellek segítenek elkülöníteni az erek lokális adaptációját a szisztémás keringési válaszoktól. Videoangiográfiás kísérleti módszerünkkel egyenletes nyomás alatt tartott érszegmenseket vizsgáltunk, eltérően az estradiol akut hatásait in vitro vizsgáló legtöbb munkacsoporttól, akik érgyűrűk relaxációját mérték izometriás tenzióméréssel. Több agonistára vonatkozóan az izometriáshoz képest megnövekedett érzékenységet mutattak ki izobár körülmények között (65,74). Az ösztradiolhatás specificitásának ellenőrzése céljából a 17α-ösztradiol és egy másik szteroid, a dexametazon kisér-tónusra gyakorolt hatását, valamint az ösztrogénreceptor antagonista clomiphen ösztradiolhatást módosító képességét is tanulmányoztuk. Második kísérletsorozatunkban arra kerestük a választ, hogy az ösztradiol akut in vitro kisartéria-relaxáló hatását befolyásolja-e az azt megelőző hormonpótló kezelés. A krónikus és az akut, nongenom válaszok közötti lehetséges interakciót ovarium-intakt, kasztrált és kasztrált+ösztrogénpótolt patkányok kisartériáin létrejött akut ösztradiolhatások összehasonlításával vizsgáltuk. Hogy a krónikus ösztradiolkezelés általános relaxációs mechanizmusokra való hatását kizárhassuk, két ismert vazodilátor, 20

a papaverin (foszfodiészteráz-gátló) és a nifedipin (kalcium-csatorna gátló) értágító hatását is összehasonlítottuk a különböző csoportokban. Módszerek Az érátmérő mérésének technikája Kísérleteinkhez nőstény Sprague-Dawley patkányok saphena artériáiból (a vena saphenát kísérő kis muszkulokután artéria) 6-11 mm hosszú szakaszokat preparáltunk, az izolált érszegmenseket 37 C-os, 95%O2-t és 5%CO2-t tartalmazó gázkeverékkel átáramoltatott, normál Krebs-Ringer oldatot tartalmazó szervfürdőbe helyeztük. Az oldat összetétele: Na + : 144,9 mm, K + : 4,5 mm, Ca 2+ : 2,5 mm, Mg 2+ : 1,2 mm, H 2 PO 2-4 + H 2 PO 2-4: 1,2 mm, SO 2-4: 3,6 mm, Cl - : 125,9 mm, HCO - 3: 22,5 mm, glükóz: 5,56 mm. Az érszakaszokat mindkét végükön kanüláltuk, a kimeneti kanült lezártuk ("vak zsák" kísérleti rendszer, nincs áramlás az érlumenben). Az érszegmenseket axialisan eredeti in vivo hosszukra feszítettük ki, és az intraluminális nyomást automatikus pumpa segítségével 50 Hgmm-re állítottuk be a mérés teljes időtartamára, amely nyomást hasonló preparátumok nyomás-átmérő görbéinek előzetes elemzésekor optimálisnak találtunk. Az ér külső átmérőjét mikroangiográfia segítségével folyamatosan mértük. Átlátszó aljzatú szervfürdő-kádból, mikroszkópból, videokamerából és monitorból összeállított rendszerrel az érszakaszról videomikroszkópos képet állítottunk elő. Speciális számítógép horizontálisan elemezte a videójelet a monitoron, az érfal kontúrjait automatikusan jelezve. A jeleket digitalizálás után számítógépen 2 ciklus/s mintavételi frekvenciával rögzítettük, Labtech Notebook szoftvert alkalmazva (1. ábra). 30 perc inkubációs idő után az oldathoz noradrenalint adtunk 15,8 µm koncentrációban (maximális dózis). 10 percen belül stabil kontrakció állt be. Ezután adtuk a szervfürdő oldathoz kumulatív dózisban a szteroidokat, és mértük esetleges hatásukat az érátmérőre. 21

2. ábra Az in vitro mikroangiográfia technikája Az ösztradiol és a progeszteron akut vazorelaxáns hatásának vizsgálata Ivarérett, nullipara, nem terhes nőstény patkányok (testtömeg: 200-300 g) saphena artériáit az előbb leírt módon kanüláltuk, noradrenalinnal (NA) kontraháltuk. A stabil kontrakció beállta után a szervfürdő oldathoz 17β-ösztradiolt adtunk 1-100 µm-ig terjedő kumulatív dózisban, folyamatosan rögzítve az érátmérő-változást (n=8). Egy másik érsorozaton progeszteront adtunk az oldathoz, az ösztradiolhoz hasonló módon, 0,86-86,4 µm-ig terjedő koncentrációban (n=8). Minden koncentráció esetén 10 percet várakoztunk az esetleges hatás kialakulására. Mind az ösztradiol, mind a progeszteron oldatot frissen készítettük, a kristályos hormonok 10 mg-ját 1 ml etanolban oldva. Az 22

oldószer maximális koncentrációja a Krebs-Ringer oldatban 0,3% v/v alatt volt, amely etanol koncentráció önmagában adva nem váltott ki semmiféle hatást a preparátumok tónusára. A hatás specifikusságának ellenőrzése céljából további sorozatokban harmadik szerként dexametazont (n=7) illetve a sztereospecifitás vizsgálatára 17αösztradiolt (n=7) alkalmaztunk 1-100 µm-ig terjedő kumulatív dózisban. Végül az utolsó csoportban ismét az ösztradiol dózis-hatás görbéjét vettük fel 10 µm clomiphencitrát (ösztradiol-plazmareceptor, ER antagonista) jelenlétében (n=7). Az ösztradiolválasz reverzibilitásának vizsgálatára néhány kísérletben (n=4) az ösztradiol maximális dózisának alkalmazása után az ereket kimostuk, majd 10 perc inkubációs idő után újból 15,8 µm noradrenalint adtunk a szervfürdő oldathoz. Az endotélium ösztradiol-relaxációban való szerepének vizsgálatát 15 további nőstény SD patkányon végeztük el. Egy részükben (n=7) az endotéliumot meghagytuk, épségét NA prekontrakció után az acetilkolin (14,7 µm) okozta relaxáció mérésével ellenőriztük. A 20%-nál nagyobb relaxációt mutató ereken - a szervfürdő kamra átmosása, új Krebs-Ringer oldattal való feltöltése és 30 perc inkubációs idő után - vizsgáltuk az ösztradiol hatását az érátmérőre az előzőekben ismertetett módon. Másik részükben (n=8) az endotéliumot 10 percig tartó levegő átfújással, majd Krebs-Ringer oldattal való átmosással eltávolítottuk. 30 perc inkubációs idő után az endotélium hiányáról a noradrenalinnal összehúzott ereken az acetilkolin-relaxáció elmaradásával bizonyosodtunk meg. Ezután a szervfürdő kamra új Krebs-Ringer oldattal való feltöltése és további 30 perc inkubációs idő után mértük az ösztradiol relaxáns hatását. A krónikus ösztrogénkezelés és az akut, nongenom ösztradiolhatások közötti interakció vizsgálata Második kísérletsorozatunkban az ivarérett, nullipara, nem terhes patkányokat (kezdeti testtömeg: 220-250 gr) két csoportra osztottuk. Az O csoport (ovariektomizáltak) egyedeit sebészileg kasztráltuk. Ennek során pentoparbital narkózisban alsó median metszésből bilateralis oophorectomiát végeztünk steril körülmények között. Az állatokat penicillin profilaxisban részesítettük. Az EPK csoport (ösztrogén-pótoltak) állatait sebészi kasztrálás után ösztrogénpótló terápiában részesítettük (im. ösztradiol propionát 450 µg/ttkg/hét). A humán terápiához viszonyítva magasabb dózisban adagoltuk a hormonokat, tekintettel a patkányok 23

gyorsabb anyagcseréjére. Előzetes vizsgálatainkban ilyen dózisú ösztrogénpótló kezelés hatására ovarium intakt állatokéhoz hasonló szintű ösztradiol értékeket mértünk (2). A kezelés időtartama 5 hét volt. Az alkalmazott Sprague-Dawley patkánytörzs ösztruszciklusa 4,5 napos (a Charles-River Co. adatai alapján), így 8 ciklus alatt létrejött változást vizsgáltunk. Öthetes kezelés után megmértük az állatok tömegét, majd izoláltuk, 10% O2-t, 5% CO2-t és 85% N2-t tartalmazó gázkeverékkel átáramoltatott szervfürdőbe tettük és kanüláltuk saphena artériáikat az előzőekben leírt módon. Mind az ovariektomizált (n=8) mind az ösztrogénpótolt (n=10) állatokon vizsgáltuk a 17βösztradiol akut relaxáló hatását a már ismertetett módszerrel. Kontrollcsoportként (K) ovarium-intakt állatok (testtömeg: 210-260gr) saphena artériáin is mértük az ösztradiol akut hatását (n=9). Hogy a krónikus ösztradiolkezelés általános relaxációs mechanizmusokra való hatását kizárhassuk, további ovariektomizált (n=8) és ösztrogénpótolt (n=8) állatok prekontrahált erein 1 nm-100 µm-ig terjedő kumulatív dózisban a papaverin és 3nM- 100µM-ig terjedő koncentrációban a nifedipin dózis-hatás görbéjét vettük fel az ösztradioléhoz hasonló módon. Alkalmazott anyagok A noradrenalint (Arterenol, Hoechst) 15,8 µm végkoncntrációban alkalmaztuk a szervfürdőbe. A 17β-ösztradiol (Richter), a 17α-ösztradiol (Sigma) és a progeszteron (Richter) oldatokat frissen készítettük, a kristályos hormonok 10 mg-ját 1 ml etanolban oldva, majd ezekből az oldatokból adtunk mikropipettával a szervfürdőhöz. A kristályos acetilkolin-klorid (Sigma) 1 mg-ját 1 ml desztillált vízben oldottuk. Az eredeti gyári készítményeket higítottuk dexametazon (Oradexon, Organon) és papaverin (Papaverin HCl, Chinoin) esetében. A nifedipin törzsoldatához 10 mg kristályos nifedipint (EGIS) 1 ml etanolban oldottunk, majd ezt higítottuk tovább etanollal, illetve desztillált vízzel. Az ösztrogénpótló terápiához az ösztradiol propionátot (Richter) oleum helianthiban oldottuk, majd 450 µg/ttkg/hét dózisban im. alkalmaztuk. A clomiphen-citrátot (EGIS) frissen vízben oldottuk. Altatásra pentobarbitalt (Nembutal, Sanofi-Phylaxia) alkalmaztunk i.p. (45 mg/ttkg). A penicillint (Biogal, 100 000 IU) i.m. adtuk. 24