QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA kézikönyv 2 96 (katalógusszám: 0594-0201)

QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA kézikönyv 2 96 (katalógusszám: 0594-0201) 20 96 (katalógusszám: 0594-0501) ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) peptid antigénekre adott válaszok mérésére szolgáló teljes vér IFN-γ teszt In vitro diagnosztikai célra 0594-0201, 0594-0501 Cellestis, QIAGEN Company Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Ausztrália Tel.: (Ausztrália) +613-9840-9800 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden, Németország 1075115HU 01 ver. www.quantiferon.com www.quantiferon.com

Tartalom 1. Rendeltetés 4 2. A teszt összefoglalása és kifejtése 4 A teszt alapelve 5 A teszt elvégzéséhez szükséges idő 5 3. Összetevők és kiszerelések 6 Szükséges, de nem tartozék eszközök 7 Tárolás és kezelés 8 4. Figyelmeztetések és óvintézkedések 9 In vitro diagnosztikai célra 9 Figyelmeztetések 9 Óvintézkedések 10 5. Mintavétel és a minta kezelése 11 6. Alkalmazási útmutató 13 1. fázis A vér inkubálása és a plazma elválasztása 13 2. fázis Humán IFN-γ ELISA 14 7. Számítások és a teszt értelmezése 18 Standardgörbe létrehozása 18 A teszt minőségi felülvizsgálata 18 8. Korlátok 21 9. Teljesítményjellemzők 21 Klinikai vizsgálatok 21 10. Technikai tudnivalók 24 Határozatlan eredmények 24 Alvadt plazmaminták 24 Hibaelhárítási útmutató 25 11. Bibliográfia 27 12. Technikai ügyfélszolgálat 29 13. Rövidített teszteljárás 30 1. fázis a vér inkubálása 30 2. fázis IFN-γ ELISA 30 Jelentős módosítások 32 QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 3

1. Rendeltetés A QuantiFERON-TB Gold (QFT ) egy in vitro diagnosztikai teszt, amelyben ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) proteineket szimuláló peptidkeverék stimulálja a sejteket a heparinizált teljes vérben. Az interferon-γ (IFN-γ) enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálattal (enzyme-linked immunosorbent assay ELISA) történő észlelését használják a Mycobacterium tuberculosis fertőzéssel összefüggő peptid antigénekre adott in vitro válaszok azonosításához. A QFT az M. tuberculosis fertőzés (illetve megbetegedés) közvetett tesztje, amely rendeltetése szerint kockázatelemzésre, radiográfiára, valamint egyéb orvosi és diagnosztikai értékelésre szolgál. 2. A teszt összefoglalása és kifejtése A tuberkulózis az M. tuberculosis komplex organizmusok (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) okozta fertőző betegség, amely rendszerint cseppfertőzéssel terjed az új gazdára a légzőszervi tuberkulózis betegséggel fertőzött páciensekről. Az újonnan megfertőződött személy hetekkel vagy hónapokkal később megbetegedhet, de a legtöbben továbbra is jól érzik magukat. Egyes személyeknél lappangó tuberkulózis fertőzés (latent tuberculosis infection LTBI), egy nem fertőző, tünetmentes állapot maradhat fenn, majd hónapokkal vagy évekkel később tuberkulózis betegség alakulhat ki. Az LTBI diagnosztizálásának legfőbb célja megállapítani, szükséges-e kezelést alkalmazni a tuberkulózis betegség kialakulásának megakadályozására. A legutóbbi időkig az LTBI diagnosztizálásának egyetlen rendelkezésre álló módja a tuberkulin bőrpróba (tuberculin skin test TST) volt. A tuberkulinra való bőrérzékenység 2 10 héttel a fertőzés után alakul ki. Előfordul viszont, hogy egyes fertőzöttek, például a számos különféle immunműködést elnyomó állapot valamelyikében érintettek, sőt esetenként mások is nem reagálnak a tuberkulinra. Ugyanakkor egyes, bizonyára nem M. tuberculosis fertőzött egyének mégis érzékenységet mutatnak a tuberkulinra, és pozitív TST eredményt adnak Bacille Calmette-Guérin (BCG) oltást követően, M. tuberculosis komplextől eltérő mycobacteriumos fertőzés esetén, illetve más ismeretlen tényezők miatt. Az LTBI állapotot meg kell különböztetni a tuberkulózis betegségtől, amely egy rendszerint a tüdőt és az alsó légutakat, de esetenként más szerveket is érintő, bejelentés-köteles állapot. A tuberkulózis betegség a kórelőzményből és a fizikális, radiológiai, szövettani és mycobacteriológiai vizsgálati eredményekből diagnosztizálható. A QFT a mycobacteriális proteineket szimuláló peptid antigénekre adott sejtmediált immunválaszokat (cell-mediated immune CMI) vizsgáló teszt. Ezek a proteinek az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) az összes BCG- törzsből és a legtöbb nem tuberkulózisos mycobacteriumból hiányoznak az M. kansasii, M. szulgai és M. marinum kivételével.(1) Az M. tuberculosis komplex organizmusokkal fertőzöttek vérében rendszerint a fenti és egyéb mycobacteriális antigéneket felismerő limfociták találhatók. Az antigének felismerése IFN-γ citokin termelődésével és kiválasztásával jár. Jelen teszt alapja az IFN-γ észlelése, majd mennyiségi meghatározása. A QFT során használt antigének az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) proteineket szimuláló peptidkeverék. Számos vizsgálat kimutatta, hogy ezek a peptid antigének M. tuberculosis fertőzötteknél kiváltják a T-sejtekben az IFN-γ-válaszokat, míg a nem fertőzött, illetve a BCG oltást kapott, betegség és LTBI kockázata nélküli személyek esetében általában nem.(1 32) Az immunműködést megzavaró kezelések, illetve állapotok azonban okozhatják az IFN-γ-válaszok csökkenését. Bizonyos egyéb mycobacteriális fertőzésben szenvedő páciensek szintén reagálhatnak az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) proteinekre, mivel az ezeket kódoló gének az M. kansasii, M. szulgai és M. marinum esetén is jelen vannak.(1, 23) A QFT teszt alkalmas az LTBI kimutatására, valamint hasznos segítséget nyújt az M. tuberculosis komplex fertőzés diagnosztizálásában a beteg páciensek esetén. A pozitív eredmény alátámasztja a tuberkulózis 4 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

betegség diagnózisát, de pozitív eredményt egyéb mycobacteriumos (pl. M. kansasii) fertőzés is okozhat. A tuberkulózis betegség megerősítésére vagy kizárására további orvosi és diagnosztikai értékelést kell végezni. A teszt alapelve A QFT rendszer speciális vérvételi csöveket használ a teljes vér levételéhez. A vért a csövekben 16 24 órán keresztül inkubálják, a plazmát elválasztják, majd a peptid antigénekre válaszul létrejövő IFN-γ jelenlétére tesztelik. A QFT teszt kétfázisú. Először teljes vért kell levenni a QFT mindhárom vérvételi csövébe: a nullcsőbe, a TB-antigén csőbe és a mitogén csőbe. A mitogén cső a QFT teszt pozitív kontrolljaként szolgál. Ennek különösen akkor lehet jelentősége, ha az alany immunállapota bizonytalan. A mitogén cső továbbá a helyes vérkezelés és inkubálás kontrolljára is alkalmas. A csöveket a lehető leghamarabb, de legkésőbb a vérvételtől számított 16 órán belül inkubálni kell 37 C-on. A 16 24 órás inkubálást követően a csöveket centrifugálják, a plazmát eltávolítják, majd az IFN-γ (IU/ml) mennyiségét ELISA teszttel megmérik. A teszt olyan IFN-γ-válasz esetén számít pozitívnak, amikor a TB-antigén cső szerinti érték jelentősen meghaladja a nullcső IFN-γ IU/ml értékét. Felhasználása esetén a mitogén cső plazmamintája az IFN-γ pozitív kontrolljaként szolgálhat az egyes tesztelt minták esetén. A gyenge (0,5 IU/ml alatti) mitogén reakció akkor jelent határozatlan eredményt, ha a vérminta TB-antigénekre adott válasza is negatív. Ilyen eredményt akkor kaphatunk, ha elégtelen a limfociták száma, gyenge a limfocitatevékenység, mert helytelenül kezelték a mintát, hibásan töltötték vagy keverték a mitogén csövet, illetve ha a páciens limfocitái képtelenek IFN-γ előállítására. A nullminta a vérben jelenlévő háttérérték, a heterofil antitestek okozta hatások, illetve a nem specifikus IFN-γ érték kompenzálására szolgál. A nullcső IFN-γ-szintjét kivonják a TB-antigéncső IFN-γ-szintjéből, valamint (használata esetén) a mitogén csőéből. A teszt elvégzéséhez szükséges idő A QFT teszt elvégzéséhez szükséges becsült idő, valamint a több minta egyidejű tesztelésének időigénye: A vért tartalmazó csövek 37 C-os inkubálása: ELISA: 16 24 óra Egy ELISA-lemez esetén kb. 3 óra (28 44 személy) 1 munkaóránál kevesebb Minden további lemezre újabb 10 15 percet kell számolni QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 5

3. Összetevők és kiszerelések Blood Collection Tubes (vérvételi csövek)* 300 cső 200 cső 100 cső Katalógusszám T0590-0301 0590-0201 T0593-0201 Készítmények száma 100 100 100 QuantiFERON Nil Tube (nullcső; szürke kupak, fehér gyűrű) 100 cső 100 cső QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-antigén cső; piros kupak, fehér gyűrű) QuantiFERON Mitogen Tube (mitogén cső; lila kupak, fehér gyűrű) 100 cső 100 cső 100 cső 100 cső QFT vérvételi csövek kézikönyve 1 1 1 High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (vérvételi csövek nagy tengerszint feletti magasságra; 1020 1875 m)* 300 cső 100 cső 100 cső Katalógusszám T0590-0505 0590-0501 T0593-0501 QuantiFERON HA Nil Tube (nullcső; szürke kupak, sárga gyűrű) QuantiFERON HA TB Antigen Tube (TB-antigén cső; piros kupak, sárga gyűrű) QuantiFERON HA Mitogen Tube (mitogén cső; lila kupak, sárga gyűrű) 100 cső 100 cső 100 cső 100 cső 100 cső 100 cső QFT vérvételi csövek kézikönyve 1 1 1 * Nem minden országban kapható az összes termékkombináció. A megrendelhető termékkombinációkról a QIAGEN vevőszolgálat nyújt további tájékoztatást (elérhetőségét lásd: www.qiagen.com). 6 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

ELISA összetevők 2 lemezes ELISA készlet Referencia laborcsomag Katalógusszám 0594-0201 0594-0501 Mikrolemezcsíkok (12 8 lyukú) bevonva egér antihumán IFN-γ monoklonális antitesttel Humán IFN-γ standard, liofilizált (tartalma: rekombináns humán IFN-γ, szarvasmarha-kazein, 0,01%[m/V] thimerosal) 2 készlet 12 8 lyukú mikrolemezcsík 1 cső (8 IU/ml rehidratálva) 20 készlet 12 8 lyukú mikrolemezcsík 10 cső (8 IU/ml rehidratálva) Green Diluent (zöld hígító; tartalma: szarvasmarhakazein, normál egérszérum, 0,01%[m/V] thimerosal) Conjugate 100X Concentrate (konjugátum 100 koncentrátum, liofilizált; egér anti-humán IFN-γ HRP, 0,01%[m/V] thimerosalt tartalmaz) Wash Buffer 20X Concentrate (mosó puffer 20 koncentrátum; ph 7,2; 0,05%[V/V] ProClin 300-at tartalmaz) Enzyme Substrate Solution (enzimszubsztrátoldat; tartalma: H 2 O 2, 3,3, 5,5 tetrametil-benzidin) 1 30 ml 10 30 ml 1 0,3 ml (rehidratálva) 10 0,3 ml (rehidratálva) 1 100 ml 10 100 ml 1 30 ml 10 30 ml Enzyme Stopping Solution 1 15 ml 10 15 ml (enzimleállító oldat; tartalma: 0,5M H 2 SO 4 ) QFT ELISA kézikönyv 1 1 Kénsavat tartalmaz. (Az óvintézkedéseket lásd itt: 10. oldal) Szükséges, de nem tartozék eszközök 37 C inkubátor. CO 2 nem szükséges Kalibrált, változtatható térfogatú pipetták 10 1000 µl közti mennyiségekhez, eldobható véggel Kalibrált, többcsatornás pipetták 50 100 µl közti mennyiségekhez, eldobható véggel Mikrolemez-rázó gép Ioncserélt vagy desztillált víz, 2 liter Mikrolemez-mosó (automatikus mosó ajánlott) 450 nm-es szűrőjű mikrolemez-olvasó 620 650 nm-es referenciaszűrővel QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 7

Tárolás és kezelés Vérvételi csövek A vérvételi csöveket 4 és 25 C közt kell tárolni. Reagensek a készletben A készletben lévő reagenseket hűtve, 2 C és 8 C között kell tárolni. Az enzimszubsztrátoldatot mindig napfénytől védett helyen kell tartani. Rehidratált és maradék reagensek A reagensek rehidratálási útmutatóját a 6. fejezet tartalmazza (14. oldal) A készletben lévő standard rehidratálva 2 8 C-on tárolható maximum 3 hónapig. Jegyezze fel a készletben lévő standard rehidratálásának dátumát. A maradék rehidratált konjugátum 100 koncentrátumot vissza kell hűteni 2 8 C-os tárolási hőmérsékletre, és 3 hónapon belül fel kell használni. Jegyezze fel a konjugátum rehidratálásának dátumát. A készre hígított konjugátumot elkészítése után 6 órán belül fel kell használni. A készre hígított mosó puffer szobahőmérsékleten tárolható legfeljebb 2 hétig. 8 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

4. Figyelmeztetések és óvintézkedések In vitro diagnosztikai célra Figyelmeztetések A negatív QFT eredmény nem zárja ki teljesen az M. tuberculosis fertőzés, illetve a tuberkulózis betegség esélyét: hamis negatív eredményt okozhat az adott fertőzöttségi stádium (ha pl. a mintavétel megelőzte a sejtimmunválasz kialakulását), az immunműködésre ható komorbid állapotok, a vérvételi csövek szabálytalan kezelése a vérvételt követően, a teszt szabálytalan elvégzése, illetve egyéb immunológiai változók. A pozitív QFT eredmény nem szolgálhat az M. tuberculosis fertőzés megállapításának egyedüli vagy végleges alapjául. A teszt szabálytalan végrehajtása is okozhat hamis pozitív eredményt. A pozitív QFT eredményt további orvosi vizsgálatoknak és az aktív tuberkulózis betegség diagnosztizálásának kell követnie (például saválló baktérium kimutatása köpetvizsgálattal és tenyésztéssel, illetve mellkasröntgen). Bár az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) az összes BCG törzsből és a legtöbb ismert nem tuberkulózisos mycobacteriumból hiányzik, mégis előfordulhat, hogy a QFT eredményt M. kansasii, M. szulgai vagy M. marinum fertőzés okozza. Ha ilyen fertőzések gyanúja merül fel, akkor más vizsgálatok elvégzése szükséges. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 9

Óvintézkedések Csak in vitro diagnosztikai célra Vegyszerek használatakor mindig viseljen megfelelő laboratóriumi köpenyt, eldobható kesztyűt és védőszemüveget. A további tudnivalókat a megfelelő biztonsági (SDS) adatlapok tartalmazzák. Az egyes QUIAGEN készletek és összetevők biztonsági adatlapjai praktikus és kisméretű PDF fájl formájában megtalálhatók, megtekinthetők és kinyomtathatók a www.qiagen.com/safety oldalon. VIGYÁZAT: Az emberi vér kezelése fertőzésveszéllyel jár. A vonatkozó vérkezelési előírásokat be kell tartani. A QuantiFERON-TB Gold ELISA készlet összetevőire az alábbi R és S mondatok vonatkoznak. QuantiFERON enzimleállító oldat Xi Kénsavat tartalmaz: Maró hatású. R és S mondatok: R36/38, S26-36/37/39 A zöld hígító normál egérszérumot és kazeint tartalmaz, amelynek az allergiás reakciók veszélye miatt nem szabad bőrrel érintkeznie. Vegyi anyagokkal kapcsolatos vészhelyzetben kiömlés, szivárgás, érintkezés vagy baleset esetén éjjel-nappal hívható a CHEMTREC az USA-ban és Kanadában: 1-800-424-9300 más országban: +1-703-527-3887 (R-beszélgetés kérhető) További tájékoztatás Biztonsági adatlapok: www.qiagen.com/safety A QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv utasításaitól való eltérés hibás eredményt idézhet elő. Használat előtt figyelmesen olvassa el az útmutatót. Sérültnek tűnő vagy szivárgó reagenspalackot tartalmazó készletet nem szabad használni. Nem engedélyezett az eltérő QFT készletekbe tartozó mikrolemezcsíkok, humán IFN-γ standardok, zöld hígítók, illetve konjugátum 100 koncentrátumok vegyes felhasználása, illetve összekeverése. A többi reagens (a mosó puffer 20 koncentrátum, enzimszubsztrátoldat és enzimleállító oldat) több készletből vegyesen is használható, ha azok felhasználhatósági ideje még nem járt le, és ha a gyári számokat feljegyzik. A fel nem használt reagensek és biológiai minták hulladékkezelését a helyi, tagállami és uniós előírások szerint kell végezni. A vérvételi csöveket és az ELISA készletet lejárati időn túl nem szabad felhasználni. Gondoskodni kell a laboratóriumi berendezések, például a lemezmosók és -beolvasók kalibrálásáról, illetve hogy azok alkalmazásra hitelesítettek legyenek. R36/38: Szem- és bőrizgató hatású; S26: Ha szembe jut, bő vízzel azonnal ki kell mosni és orvoshoz kell fordulni; S36/37/39: Megfelelő védőruházatot, védőkesztyűt, szem-/arcvédőt kell viselni. 10 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

5. Mintavétel és a minta kezelése A QFT az alábbi vérvételi csöveket alkalmazza: 1. QuantiFERON nullcsövek (szürke kupak, fehér gyűrű; tengerszint és 810 m közötti alkalmazásra) 2. TB-antigén csövek (piros kupak, fehér gyűrű; tengerszint és 810 m közötti alkalmazásra) 3. QuantiFERON mitogén csövek (lila kupak, fehér gyűrű; tengerszint és 810 m közötti alkalmazásra) Csövek nagy tengerszint feletti magasságra (HA): 4. QuantiFERON HA nullcsövek (szürke kupak, sárga gyűrű; 1020 1875 m között használható) 5. HA TB-antigén csövek (piros kupak, sárga gyűrű; 1020 1875 m között használható) 6. QuantiFERON HA mitogén csövek (lila kupak, sárga gyűrű; 1020 1875 m között használható) Az antigének a vérvételi csövek belső falán, szárítva találhatók meg, ezért fontos, hogy a csövek tartalma teljesen összekeveredjen a vérrel. A csöveket a lehető leghamarabb, de legkésőbb a vérvételtől számított 16 órán belül 37 C-os inkubátorba kell helyezni. Az optimális eredmény érdekében az alábbi eljárást kell követni: 1. Vegyen le alanyonként 1 ml vénás vért közvetlenül az egyes QFT vérvételi csövekbe. Ezt az eljárást vérvételre kiképzett személynek kell végeznie. 810 méteres tengerszint feletti magasságig normál QFT vérvételi csöveket kell használni. 1020 és 1875 méter között nagy tengerszint feletti magasságra készült (HA) vérvételi csöveket kell használni. Ha ezektől eltérő tengerszint feletti magasságon történik a QFT vérvételi csövek használata, vagy ha a levett vér mennyisége túl alacsony, akkor a vér fecskendővel is levehető, majd 1-1 ml azonnal áthelyezhető mindhárom csőbe. Biztonsági okokból ennek legjobb módja a fecskendő tűjének biztonságos eltávolítása, a 3 QFT-cső kupakjának eltávolítása, majd 1-1 ml vér betöltése (a cső oldalán található fekete jelzésig). A csövek kupakját gondosan vissza kell zárni, majd az alább ismertetett módon keverést kell végezni. Mivel az 1 ml-es csövek a vért viszonylag lassan veszik fel, a cső látszólagos telítődése után még 2-3 másodpercig tartsa a csövet a tűn, hogy a megfelelő mennyiség biztosan meglegyen. Az 1 ml-es töltési mennyiséget a cső oldalán feltüntetett fekete jel mutatja. A QFT vérvételi csövek névleges térfogattartománya 0,8 1,2 ml. Ha valamely csőben a vér szintje nincs a jelzővonal közelében, ajánlatos új vérmintát venni. Ha a vérvétel pillangótűvel történik, akkor a QFT csöveinek megtöltése előtt egy üres csövet kell használni, hogy az összekötő csövek biztosan megteljenek a vérrel. A másik lehetőség, hogy vért egy általános, antikoagulánsként lítium heparint tartalmazó vérvételi csőbe veszik, és innen töltik át a QFT csövekbe. Csak lítium heparin használható a vérben antikoagulánsként, mivel más antikoagulánsok megzavarják a tesztet. Töltsön fel egy vérvételi csövet (minimum 5 ml mennyiséggel), és a cső többszöri átfordításával végezzen óvatos keverést a heparin eloszlatására. A vért szobahőmérsékleten (22±5 C-on) kell tárolni addig, amíg a QFT csövekbe nem töltik inkubálásra, amelyet feltétlenül meg kell kezdeni a vérvételt követő 16 órán belül. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 11

2. A csöveket közvetlenül a megtöltésüket követően rázza meg tíz (10) alkalommal éppen olyan erősen, hogy a cső teljes belső felszínére eljutó vér leoldja a csőfalon található antigéneket. Miközben vérrel tölti meg a csöveket, azok hőmérsékletének 17 25 C között kell lennie. A túlságosan erős rázás a gél felszakadását okozhatja, aminek köszönhetően téves eredményeket kaphatunk. Ha levételkor a vér heparinos csőbe került, akkor a mintát a QFT-csövekbe áttöltés előtt egyenletesen fel kell keverni. A vér alapos felkeverése óvatos átfordításokkal mindig közvetlenül az áttöltést megelőzően történjen. Töltsön (QFT csövenként egy-egy) pontosan 1,0 ml-es mennyiséget a megfelelő null-, TB-antigén és mitogén csőbe. Ezt legjobb aszeptikusan végezni, a megfelelő biztonsági eljárásokat betartva. Távolítsa el mindhárom QFT cső kupakját, majd töltsön mindegyikbe 1-1 ml vért (a cső oldalán található fekete jelzésig). A csövek kupakját gondosan vissza kell zárni, majd a fenti módon keverést kell végezni. 3. A csöveket megfelelően feliratozza. Gondoskodni kell arról, hogy az egyes csövek (null-, TB-antigén, mitogén) a kupakjuk eltávolítása után is azonosíthatók maradjanak a címkéjük alapján vagy más módon. 4. A feltöltést, felrázást és címkézést követően a csöveket a lehető leghamarabb, de legkésőbb a vérvételtől számított 16 órán belül 37±1 C-os inkubátorba kell helyezni. Inkubálás előtt a csöveket szobahőmérsékleten (22±5 C-on) kell tartani. A vérmintákat nem szabad hűteni vagy fagyasztani. 12 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

6. Alkalmazási útmutató 1. fázis A vér inkubálása és a plazma elválasztása Tartozék eszközök QFT vérvételi csövek (lásd: 3. fejezet). Szükséges (de nem tartozék) eszközök Lásd: 3. fejezet. Eljárás 1. Ha a vért nem azonnal a levételt követően inkubálják, akkor a csöveket közvetlenül az inkubálás előtt 10-szer átfordítva újra kell keverni. 2. A csöveket ÁLLÍTVA, 37±1 C hőmérsékleten kell inkubálni 16 24 órán keresztül. Inkubáláskor sem CO 2, sem párásítás nem szükséges. 3. A 37 C-os inkubálás után és a centrifugálás előtt a vérvételi csövek 4 27 C-on, legfeljebb 3 napig tárolhatók. 4. A 37 C-os inkubálás után a csöveket a plazma elválasztása céljából 2000 3000 g RCF fordulatszámon 15 percig kell centrifugálni. A géldugó elkülöníti a sejteket a plazmától. Ennek hiányában a csövek centrifugálását nagyobb sebességen kell megismételni. A plazma centrifugálás nélkül is elválasztható, de fokozottan ügyelni kell arra, hogy közben a vérsejtek ne keveredjenek fel. 5. A plazmamintákat csak pipettával szabad elválasztani. A centrifugálás és az elválasztás között el kell kerülni a plazma felkeverését a pipetta fel-le mozgatásával vagy bármilyen más módon. A teljes folyamat során gondosan meg kell őrizni a gélfelület sértetlenségét. A plazmaminták közvetlenül a centrifugált vérvételi csövekből tölthetők át a QFT ELISA lemezbe, automatikus ELISA munkaállomás használata esetén is. A plazmaminták 2 8 C között maximum 28 napig, illetve elválasztva 20 C alatt hosszú ideig megőrizhetők. Megfelelő tesztmintát legalább 150 µl plazma elválasztásával lehet nyerni. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 13

2. fázis Humán IFN-γ ELISA Tartozék eszközök QFT ELISA készlet (lásd: 3. fejezet). Szükséges (de nem tartozék) eszközök Lásd: 3. fejezet. Eljárás 1. Felhasználás előtt a konjugátum 100 koncentrátum kivételével minden plazmamintát és reagenst szobahőmérsékletre (22±5 C-ra) kell hozni. A hő kiegyenlítődésre legalább 60 percet kell hagyni. 2. Vegye ki a keretből a szükségtelen csíkokat, ezeket zárja vissza a fóliatasakba, majd felhasználásig helyezze vissza a hűtött tárolóba. A QFT standardoknak legalább 1 csíkot kell biztosítani, valamint a tesztelt alanyok számának megfelelő csíkot (a 3 csöves formátumot lásd a 2A ábrán, a 2 csöveset a 2B ábrán). Használat után a többi csík számára őrizze meg a keretet és a fedelet. 3. Rehidratálja a készletben lévő liofilizált standardot az standardüveg címkéjén feltüntetett mennyiségű ioncserélt vagy desztillált vízzel. Óvatosan, minimális habképződéssel keverje, amíg teljesen fel nem oldódik. A standard megadott térfogatra rehidratálása 8,0 IU/ml koncentrációjú oldatot képez. Megjegyzés: A készletben lévő standard rehidratálási térfogata tételenként eltérő. Használja rehidratálva a készletben lévő standardot az IFN-γ 1:4 arányú hígítási sorozatának elkészítéséhez zöld hígítóban (GD) (lásd: 1. ábra). Az S1 (1. standard) tartalma 4 IU/ml, az S2 (2. standard) tartalma 1 IU/ml, az S3 (3. standard) tartalma 0,25 IU/ml és az S4 (4. standard) tartalma 0 IU/ml (csak zöld hígító). A standardokat legalább duplán kell tesztelni. Ajánlott eljárás a dupla standardokhoz Ajánlott eljárás a tripla standardokhoz a. Címkézzen fel 4 csövet: S1, S2, S3, S4. a. Címkézzen fel 4 csövet: S1, S2, S3, S4. b. Töltsön 150 µl zöld hígítót az S1, S2, S3, S4 csövekbe. c. Töltsön 150 µl standardot az S1 csőbe, és alaposan keverje össze. d. Töltsön át 50 µl-t az S1-ből az S2 csőbe, és alaposan keverje össze. e. Töltsön át 50 µl-t az S2-ből az S3 csőbe, és alaposan keverje össze. f. A zöld hígító magában nullstandardként szolgál (S4). b. Töltsön 150 µl zöld hígítót az S1 csőbe. c. Töltsön 210 µl zöld hígítót az S2, S3, S4 csövekbe. d. Töltsön 150 µl standardot az S1 csőbe, és alaposan keverje össze. e. Töltsön át 70 µl-t az S1-ből az S2 csőbe, és alaposan keverje össze. f. Töltsön át 70 µl-t az S2-ből az S3 csőbe, és alaposan keverje össze. g. A zöld hígító magában nullstandardként szolgál (S4). 14 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

150 µl 50 µl 50 µl Rehidratált standard Standard 1 4,0 IU/ml Standard 2 1,0 IU/ml Standard 3 0,25 IU/ml Standard 4 0 IU/ml (zöld hígító) 1. ábra A standardgörbe elkészítése. Minden ELISA munkamenethez friss hígítást kell készíteni a készletben lévő standardból. 4. Rehidratálja a liofilizált konjugátum 100 koncentrátumot 0,3 ml ioncserélt vagy desztillált vízzel. Óvatosan, minimális habképződéssel keverje, hogy a konjugátum teljesen feloldódjon. A konjugátum készre hígításához a Konjugátumkészítés című 1. táblázat szerint hígítsa fel a kívánt mennyiségű rehidratált konjugátum 100 koncentrátumot zöld hígítóval. 1. táblázat Konjugátumkészítés Csíkok száma A konjugátum 100 koncentrátum mennyisége A zöld hígító mennyisége 2 10 µl 1,0 ml 3 15 µl 1,5 ml 4 20 µl 2,0 ml 5 25 µl 2,5 ml 6 30 µl 3,0 ml 7 35 µl 3,5 ml 8 40 µl 4,0 ml 9 45 µl 4,5 ml 10 50 µl 5,0 ml 11 55 µl 5,5 ml 12 60 µl 6,0 ml Keverje meg alaposan, de óvatosan, hogy ne habosodjon fel. Az esetleg megmaradó összes konjugátum 100 koncentrátumot azonnal vissza kell hűteni 2 8 C-ra. Csak zöld hígítót használjon. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 15

5. A vérvételi csövekből elválasztott, majd lefagyasztott vagy a tesztelés előtt 24 óránál hosszabb ideig tárolt plazmamintákat az ELISA lyukakba töltés előtt alaposan fel kell keverni. A közvetlenül a centrifugált QFT csövekből áttöltött plazmaminták esetén a plazma keverését teljesen kerülni kell. 6. Töltsön 50 µl frissen készre hígított konjugátumot a szükséges ELISA lyukakba többcsatornás pipettával. 7. A többcsatornás pipettával töltsön 50 µl teszt plazmamintákat a megfelelő lyukakba (az ajánlott lemezelrendezés a 2A és 2B ábrán látható). Végül töltsön 50 µl mennyiséget 1-től 4-ig az összes standardba. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M 2A ábra Ajánlott mintaelrendezés null-, TB-antigén és mitogén csövekhez (28 teszt lemezenként). S1 (1. standard), S2 (2. standard), S3 (3. standard), S4 (4. standard) 1N (1. minta nullplazma), 1A (1. minta TB-antigén plazma), 1M (1. minta mitogén plazma) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A 2B ábra Ajánlott mintaelrendezés null- és TB-antigén csövekhez (44 teszt lemezenként) S1 (1. standard), S2 (2. standard), S3 (3. standard), S4 (4. standard) 1N (1. minta nullplazma), 1A (1. minta TB-antigén plazma) 8. Keverje alaposan a konjugátumot és a plazmamintákat vagy standardokat mikrolemezrázóval 1 percig. 9. Helyezzen minden lemezre fedelet, és végezzen 120±5 perces inkubálást szobahőmérsékleten (22±5 C-on). A lemezeket inkubálás alatt nem érheti közvetlen napfény. 16 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

10. Az inkubálás alatt hígítson egy rész mosó puffer 20 koncentrátumot 19 rész ioncserélt vagy desztillált vízzel, és keverje meg alaposan. 2 liter készre hígított mosó puffer elkészítéséhez elegendő mosó puffer 20 koncentrátumot mellékeltünk. A lyukakat 400 µl készre hígított mosó pufferrel kell mosni legalább 6 cikluson keresztül. Automatikus lemezmosó használata ajánlott. A teszt minősége érdekében nagyon fontos az alapos mosás. Ügyeljen arra, hogy minden lyuk színültig telítődjön a mosó pufferrel minden mosási ciklusban. Ajánlott legalább 5 másodperces áztatási időt hagyni az egyes ciklusok között. A szennyvíztartályba normál laboratóriumi fertőtlenítőszert kell tölteni, és a potenciálisan fertőző anyagot a szabályos eljárások szerint ártalmatlanítani kell. 11. A lemezeket lefordítva nedvszívó, szálmentes kendőre kell ütögetni, hogy a maradék mosó puffer eltávozzon. Töltsön 100 µl enzimszubsztrátoldatot minden lyukba, és végezzen alapos keverést mikrolemez-rázóval. 12. Helyezzen minden lemezre fedelet, és végezzen 30 perces inkubálást szobahőmérsékleten (22±5 C-on). A lemezeket inkubálás alatt nem érheti közvetlen napfény. 13. A 30 perces inkubálás elteltével töltsön 50 µl enzimleállító oldatot minden lyukba, és végezzen keverést. Az enzimleállító oldatot a szubsztrátum 11. lépésben leírt adagolásakor alkalmazott sorrendben és közel hasonló sebességgel töltse ki. 14. A reakció leállítását követő 5 percen belül mérje meg az összes lyukban az optikai denzitás (OD) értékét egy 450 nm-es szűrőjű és 620 650 nm-es referenciaszűrőjű mikrolemez-olvasóval. A teszteredményeket az OD értékekből kell kiszámolni. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 17

7. Számítások és a teszt értelmezése A nyers adatok elemzése és az eredmények kiszámítása a QFT Analysis szoftverrel történik. Ez beszerezhető a www.quantiferon.com webhelyen. Ügyeljen rá, hogy mindig a szoftver legújabb verzióját használja. A szoftver az Eredmények értelmezése című fejezetben leírtak szerint elvégzi a teszt minőségi felülvizsgálatát, létrehozza a standardgörbét, és kiszámítja az egyes alanyok teszteredményét. A QFT Analysis szoftver alkalmazása helyett az eredmények az alábbi módon is megállapíthatók. Standardgörbe létrehozása (QFT Analysis szoftver nélkül) Határozza meg minden tálcán a standardok átlagos OD értékeit. Szerkesszen egy log (e) log (e) standardgörbét, amely az átlagos OD log (e) értékét ábrázolja (y tengely) a standardok IU/ml-ben mért IFN-γ-koncentrációs értékének log (e) függvényében (x tengely), a nullstandardot a számításból kihagyva. Számítsa ki regresszió-analízissel a standardgörbe legjobban illeszkedő vonalát. Állapítsa meg a standardgörbe segítségével az egyes teszt plazmaminták IFN-γ koncentrációját (IU/ml) a hozzájuk tartozó OD értékből. Ezeket a számításokat a mikrolemez-olvasóhoz tartozó szoftvercsomagokkal, valamint hagyományos táblázatkezelő vagy statisztikai szoftverekkel (például Microsoft Excel ) végezheti el. Ajánlatos ezeket a csomagokat használni a regresszióanalízis, valamint a standardokra vonatkozó ingadozási együttható (%CV) és a standardgörbe korrelációs együtthatójának (r) kiszámításához. A teszt minőségi felülvizsgálata A teszteredmények pontossága attól függ, hogy mennyire sikerült pontos standardgörbét létrehozni, ezért a minták adatainak értelmezését megelőzően felül kell vizsgálni a standardokból származó eredményeket. Az ELISA teszt érvényességének feltételei: Az 1. standardra vonatkozó OD átlagnak 0,600 értékűnek kell lennie. Az 1. és 2. standardok ismétlődő OD értékeihez tartozó %CV 15% lehet. A 3. és 4. standardok ismétlődő OD értékei nem mutathatnak 0,040 optikai denzitási egységnél nagyobb szórást az átlagértéktől. A standardok átlagos abszorpciós értékeiből számított korrelációs együtthatónak (r) 0,98 értékűnek kell lennie. A QFT Analysis szoftver kiszámolja ezeket a minőség felülvizsgálati paramétereket, és jelentést készít róluk. Ha a fenti követelmények nem teljesülnek, akkor a teszt érvénytelen, és meg kell ismételni. A nullstandardhoz (zöld hígító) tartozó átlagos OD érték 0,150 lehet. Ha az átlagos OD érték >0,150, akkor a lemezmosási munkafolyamatot kell felülvizsgálni. 18 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

Az eredmények értelmezése A QFT eredményeit az alábbi követelmények szerint kell értelmezni: Megjegyzés: A tuberkulózis betegség diagnosztizálásához, illetve kizárásához, valamint az LTBI valószínűségének megállapításához a QFT eredményeinek értelmezésénél figyelembe kell venni az epidemiológiai, kórelőzményi, orvosi és diagnosztikus eredmények összességét (2. és 3. táblázat). 2. táblázat Null-, TB-antigén és mitogén cső használata esetén Null (IU/ml) 8,0 TB-antigén mínusz null (IU/ml) Mitogén mínusz null (IU/ml)* QFT eredménye Lelet/értelmezés <0,35 0,5 Negatív M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű 0,35 és kisebb a nullérték 25%-ánál 0,35 és eléri a nullérték 25%-át 0,5 Negatív M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű Bármely Pozitív M. tuberculosis fertőzés valószínű <0,35 <0,5 Határozatlan Az eredmény nem meghatározó a TB-antigének válaszkészségére nézve 0,35 és kisebb a nullérték 25%-ánál <0,5 Határozatlan a TB-antigének válaszkészségére Az eredmény nem meghatározó nézve >8,0 Bármely Bármely Határozatlan a TB-antigének válaszkészségére nézve Az eredmény nem meghatározó * A mitogén pozitív kontrollra kapott válaszértékek gyakran (a TB-antigéneknél időnként) meghaladhatják a mikrolemez-olvasó méréshatárát. Ez a teszteredményeket nem befolyásolja. Ha az M. tuberculosis fertőzés gyanúja nem áll fenn, az először kapott pozitív eredményeket alá lehet támasztani az eredeti plazmamintáknak a QFT ELISA készülékben végzett dupla ismételt tesztelésével. A vizsgált személyt akkor lehet teszt pozitívnak minősíteni, ha az ismételt teszteléskor legalább az egyik minta pozitív. A lehetséges okokat a Hibaelhárítás című fejezet tárgyalja. A klinikai vizsgálatokban az alanyoknak kevesebb mint 0,25%-a mutatott >8,0 IU/ml IFN-γ értéket nullértékként. A mért IFN-γ-szint magnitúdója nem mutat korrelációt a fertőzés stádiumával vagy előrehaladtával, az immunválasz-készség mértékével vagy az aktív betegséggé fejlődés valószínűségével. Értelmezés Nem TB-antigén null 0,35 IU/ml Nem Igen TB-antigén null a null IU/ml értékének 25%-a Igen Validálás Igen Nem Mitogén null <0,50 IU/ml és/vagy null >8,0 IU/ml Határozatlan Null 8,0 IU/ml Nem Igen Negatív Pozitív 3. ábra Értelmezési folyamatábra null-, TB-antigén és mitogén cső használata esetén. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 19

3. táblázat Csak QuantiFERON null- és TB-antigén cső használatakor Null (IU/ml) TB-antigén mínusz null (IU/ml) QFT eredménye Lelet/értelmezés <0,35 Negatív M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű 8,0 0,35 és kisebb a nullérték 25%-ánál Negatív M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű 0,35 és eléri a nullérték 25%-át Pozitív* M. tuberculosis fertőzés valószínű >8,0 Bármely Határozatlan a TB-antigének válaszkészségére Az eredmény nem meghatározó nézve * Ha az M. tuberculosis fertőzés gyanúja nem áll fenn, az először kapott pozitív eredményeket alá lehet támasztani az eredeti plazmamintáknak a QFT ELISA készülékben végzett dupla ismételt tesztelésével. A vizsgált személyt akkor lehet teszt pozitívnak minősíteni, ha az ismételt teszteléskor legalább az egyik minta pozitív. A klinikai vizsgálatokban az alanyoknak kevesebb mint 0,25%-a mutatott >8,0 IU/ml IFN-γ-értéket nullértékként. A lehetséges okokat a Hibaelhárítás című fejezet tárgyalja. A mért IFN-γ-szint magnitúdója nem mutat korrelációt a fertőzés stádiumával vagy előrehaladtával, az immunválasz-készség mértékével vagy az aktív betegséggé fejlődés valószínűségével. Értelmezés Nem TB-antigén null 0,35 IU/ml Igen Nem TB-antigén null a null IU/ml értékének 25%-a Igen Validálás Határozatlan Nem Null 8,0 IU/ml Igen Negatív Pozitív 4. ábra Értelmezési folyamatábra null- és TB-antigén cső használatakor 20 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

8. Korlátok A QFT eredményeit az egyes személyek epidemiológiai kórtörténetével együtt, aktuális egészségi állapotával összhangban és az egyéb diagnosztikai szempontok figyelembe vételével kell értékelni. A 8 IU/ml nullértéket meghaladó eredményű személyek a határozatlan csoportba tartoznak, mert a TB-antigénekre adott 25%-nál magasabb válasz kívül eshet a vizsgálat mérési tartományán. A megbízhatatlan és határozatlan eredmények lehetséges okai: A QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv által közölt eljárástól való eltérések Túlzott mértékű keringő IFN-γ vagy heterofil antitestek jelenléte 16 óránál hosszabb idő telt el a vérvétel és a 37 C-os inkubálás között 9. Teljesítményjellemzők Klinikai vizsgálatok Mivel a lappangó tuberkulózis fertőzésre (LTBI) nincs meghatározó szabvány, a QFT érzékenységének és specifikusságának becslésére nincs gyakorlati eljárás. A QFT specifikusságát a tuberkulózis fertőzésre alacsony kockázatú betegek (azok, akiknél nem ismeretesek kockázati tényezők) hamis pozitív arányának értékelésével becsülték meg. Az érzékenység becsült értékét tenyésztéssel megerősített aktív TB megbetegedésű pácienscsoportok értékelésével határozták meg. Specifikusság Egy 866 önkéntesen végzett USA-beli vizsgálatban úgy vettek vért a QFT vizsgálathoz, hogy közben TST volt felhelyezve. A tesztelés idején szabályos felméréssel tájékozódtak a résztvevők demográfiai adatairól és TB-kockázati tényezőiről. 432 ismert M. tuberculosis fertőzési kockázati tényezővel nem rendelkező önkéntes közül 391 esetében állt rendelkezésre a QFT és a TST eredménye. Egyik résztvevő sem kapott korábban BCG oltást. Japánban elvégezték a QFT teszt egy másik vizsgálatát olyan alacsony kockázatú személyek körében, akiknek mintegy 90%-a kapott BCG oltást. A 2 különböző specifikussági vizsgálat eredményét a 4. táblázat tartalmazza. 4. táblázat QFT specifikussága: Bejelentett M. tuberculosis fertőzési kockázat nélküli személyek eredményei Vizsgálat BCG státus (beoltottak %-aránya) Vizsgáltak száma összesen QFT határozatlanok száma QFTpozitívak / érvényesen teszteltek száma QFT specifikussága (95% CI) TSTpozitívak / teszteltek száma TST* specifikussága (95% CI) USA (nem publikált) 0% 391 1 3/390 99,2% (98 100) 6/391 98,5% (97 99) Japán (15) ~90% 168 6 2/162 98,8% (95 100) Összesen 559 7/559 (1,3%) 5/552 99,1% (98 100) * 10 mm-es TST bőrpróbával BCG oltást nem kapott személyeknél. A 15 mm-es TST becsült specifikussága 99,1%. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 21

Érzékenység aktív TB-re A később tenyésztéssel M. tuberculosis fertőzöttnek bizonyuló USA-beli, ausztráliai és japán TB-gyanús személyeket vizsgáltak meg a QFT érzékenységének megállapítására. Bár a lappangó tuberkulózis fertőzés kimutatására (LTBI) nincs meghatározó szabvány vizsgálat, az M. tuberculosis mikrobiológiai tenyésztése megfelelő helyettesítő, mert a beteg páciensek magától értetődően fertőzöttek. A páciensek a QFT teszthez tartozó vérvétel előtt kevesebb mint 8 nap kezelésben részesültek. Az 5. táblázat foglalja össze a tenyésztés után M. tuberculosis pozitívnak bizonyult páciensek eredményeit. A QFT összesített érzékenysége aktív TB betegségre 89% volt (157/177). 5. táblázat QFT: Tenyésztéssel igazoltan M. tuberculosis fertőzött alanyok Vizsgálat QFT-pozitívak / érvényesen teszteltek száma QFT érzékenysége (95% CI) Japán TB-páciensek (15) 86/92 93% (86 97%) Ausztrál 24/27 89% (70 97%) USA-beli 47/58 81% (68 90%) Összesen 157/177 89% (83 93%) 22 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

Az LTBI diagnosztizálása Számos olyan vizsgálat került publikálásra, amely a QFT paramétereit mutatta be a különféle LTBI kockázatú populációkban. Egyes válogatott vizsgálatok alapvető eredményeit a 6. táblázat ismerteti. 6. táblázat A QFT tesztre vonatkozó egyes közzétett vizsgálok LTBI kockázatú populációkban Vizsgálat Healthcare workers in India (Pai, et al 2005) (26) Danish HIV+ patients (Brock, et al 2006) (5) Hospitalized children in India (Dogra, et al 2006) (10) Contact investigations in Germany (Diel, et al 2006) (9) Vizsgáltak száma összesen Kimenetel és eredmények 726 Nagyon magas TB-arány. 40% QFT-pozitív és 41% TST-pozitív 10 mm-es teszttel. Nagy konkordancia a TST teszttel, nincs BCGhatás egyik részről sem. Mindkét teszt összefüggést mutat az életkor és az egészségügyben végzett munka időtartama szerinti kockázati tényezővel. 590 Az LTBI összesített jelenléte a QFT szerint 4,6% (27/590) HIV-pozitív személyeknél. A pozitív eredmények összefüggést mutattak a TB-kockázatokkal. Két QFT-pozitív alanynál aktív TB alakult ki 1 éven belül. A határozatlan válaszok (n=20, 3,4%) jelentős összefüggést mutattak a 100/µl-nél kisebb CD4 számmal. 105 TB-gyanús, illetve korábban TB-nek kitett gyermekeket vizsgáltak QFT és TST teszttel; az eredmény 10,5% QFT-pozitív és 9,5% TST-pozitív 10 mm-es teszttel. A tesztek közti egyezés 95,2% összesítve és 100% a BCG oltást nem kapottak körében. 309 15 különféle kiinduló eset szoros kapcsolatát tesztelték: 51% BCG oltást kapott, 27% külföldön született; a BCG oltottak 70%-a és az oltást nem kapottak 18%-a volt TST-pozitív (5 mm), míg 9% és 11% volt QFT-pozitív. A QFT összefüggést mutatott a TB kockázatával. A TST csak a BCG oltással mutatott összefüggést. Számos más publikáció készült a QuantiFERON-TB Gold kevésbé érzékeny, folyadék antigénes verziójának (a QFT elődjének) paramétereiről, valamint a QFT tesztről is. Ezekben a vizsgálatokban egyaránt végeztek teszt(ek)et aktív TB megbetegedésű (9, 11, 19, 25), gyermek (6 10, 25, 28) és HIV-pozitív pácienseknél (2, 5, 20), egészségügyi dolgozóknál (13, 26, 32), immungyengített pácienseknél (3, 4, 22, 23, 27, 30, 31), valamint TB-gyanús alanyoknál (7, 8, 10, 18) és alacsony kockázatú személyeknél (15). Megismételhetőség és a TST teszt hatása a későbbi QFT teszteredményekre Az USA-beli specifikussági vizsgálat részeként az önkéntesek egy részét újratesztelték 4 5 héttel az eredeti QFT és TST teszt után. 260 önkéntes QFT eredménye állt rendelkezésre mindkét időpontban, és az egyezés 99,6% (259/260) volt. Az előzetes TST nem indukált pozitív QFT eredményeket. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 23

10. Technikai tudnivalók Határozatlan eredmények A határozatlan eredmény ritka jelenség, és a tesztalany immunállapota mellett számos technikai tényező is okozhatja: 16 óránál hosszabb idő telt el a vérvétel és a 37 C-os inkubálás között A vért az előírt tartományon (17 27 C) kívül eső hőmérsékleten tárolták Nem megfelelően történt a vérvételi csövek keverése Az ELISA lemez nem megfelelő mosása A vérminták levételekor vagy kezelésekor elkövetett technikai hibák gyanúja esetén a teljes QFT tesztet meg kell ismételni új vérmintával. Nem megfelelő mosás vagy az előírt ELISA műveletsortól való bármely eltérés gyanúja esetén a stimulált plazmák ELISA tesztelését meg kell ismételni. Az alacsony mitogén értékből vagy magas nullértékből eredő határozatlan eredmények valószínűleg a teszt megismétlésekor sem változnak meg, csak akkor, ha az ELISA teszteléskor történt hiba. A határozatlan értékeket határozatlanként kell leletezni. Az orvos belátása szerint dönthet új minta levételéről vagy más eljárás végrehajtásáról. Alvadt plazmaminták A plazmaminták hosszú idejű tároláskor kialakuló rögösödés esetén a minta centrifugálásával ülepíthetők a vérrögök, és lehetővé válik a plazma pipettázása. 24 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

Hibaelhárítási útmutató Ez a hibaelhárítási útmutató bármely felmerülő hiba esetén segíthet a megoldásban. Részletesebb útmutató található a következő honlapon lévő technikai információk között: www.quantiferon.com. Az elérthetőségek a hátsó borítón találhatók. ELISA hibaelhárítás Nem specifikus szín kialakulása Lehetséges ok a) A lemez nem megfelelő mosása b) Az ELISA lemez lyukai közötti keresztfertőzés c) A készlet vagy összetevői lejártak d) Az enzimszubsztrátoldat szennyezett e) Elválasztás előtt felkeveredik a plazma a QFT csövekben Megoldás A tálcát legalább 6 alkalommal kell átmosni lyukanként 400 µl mosó pufferrel. Az alkalmazott mosófolyadéktól függően 6-nál többszöri átmosásra is szükség lehet. Ajánlott legalább 5 másodperces áztatási időt hagyni az egyes ciklusok között. A kockázat minimalizálása érdekében ügyeljen a minták pipettázásakor és keverésekor. Ügyeljen arra, hogy a készletet a lejárati időn belül felhasználja. A rehidratált standardot és konjugátum 100 koncentrátumot a rehidratálás dátumát követő három hónapon belül fel kell használni. Kékes elszíneződés esetén a szubsztrátumot hulladékba kell helyezni. Ügyeljen a reagenstartály tisztaságára. A centrifugálás és az elválasztás között el kell kerülni a plazma felkeverését a pipetta fel-le mozgatásával vagy bármilyen más módon. A teljes folyamat során gondosan meg kell őrizni a gélfelület sértetlenségét. Alacsony leolvasott optikai denzitás a standardoknál Lehetséges ok Megoldás a) Standardhígítási hiba Ellenőrizze, hogy a QFT ELISA kézikönyvben foglaltak szerint történt-e a készletben lévő standard hígítása. b) Pipettázási hiba A pipettákat mindig a gyártói utasítások betartásával kell kalibrálni és alkalmazni. c) Túl alacsony inkubálási hőmérséklet Az ELISA inkubálását szobahőmérsékleten kell elvégezni (22±5 C). d) Túl rövid inkubálási idő A konjugátumot, a standardokat és a mintákat tartalmazó lemezt 120±5 percen át kell inkubálni. Az enzimszubsztrátoldatot 30 percen át kell a lemezen inkubálni. e) Nem megfelelő szűrő a lemezbeolvasásnál A lemezbeolvasásnak 450 nm-en kell történnie 620 650 nm-es szűrővel. f) Túl hideg reagensek A konjugátum 100 koncentrátum kivételével minden reagenst szobahőmérsékletre kell hozni a tesztelés megkezdését megelőzően. Ehhez körülbelül 1 óra szükséges. g) A készlet vagy annak összetevői lejártak Ügyeljen arra, hogy a készletet a lejárati időn belül felhasználja. A rehidratált standardot és konjugátum 100 koncentrátumot a rehidratálás dátumát követő 3 hónapon belül fel kell használni. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 25

ELISA hibaelhárítás Magas háttérszíneződés Lehetséges ok a) A lemez nem megfelelő mosása b) Túl magas inkubálási hőmérséklet c) A készlet vagy összetevői lejártak d) Az enzimszubsztrátoldat szennyezett Megoldás A tálcát legalább 6 alkalommal kell átmosni lyukanként 400 µl mosó pufferrel. Az alkalmazott mosófolyadéktól függően 6-nál többszöri átmosásra is szükség lehet. Ajánlott legalább 5 másodperces áztatási időt hagyni az egyes ciklusok között. Az ELISA inkubálását szobahőmérsékleten kell elvégezni (22±5 C). Ügyeljen arra, hogy a készletet a lejárati időn belül felhasználja. A rehidratált standardot és konjugátum 100 koncentrátumot a rehidratálás dátumát követő 3 hónapon belül fel kell használni. Kékes elszíneződés esetén a szubsztrátumot hulladékba kell helyezni. Ügyeljen a reagenstartály tisztaságára. Nem lineáris standardgörbe és kétszeres változékonyság Lehetséges ok a) A lemez nem megfelelő mosása Megoldás A tálcát legalább 6 alkalommal kell átmosni lyukanként 400 µl mosó pufferrel. Az alkalmazott mosófolyadéktól függően 6-nál többszöri átmosásra is szükség lehet. Ajánlott legalább 5 másodperces áztatási időt hagyni az egyes ciklusok között. b) Standardhígítási hiba Ellenőrizze, hogy a QFT ELISA kézikönyv utasításai szerint történt-e a standard hígítása. c) Elégtelen keverés A reagenseket a lemezre töltésük előtt alaposan fel kell keverni átfordítással vagy óvatos vortexeléssel. d) Nem egyenletes pipettázás vagy teszt előkészítésének megszakítása A minták és a standardok kitöltését folyamatosan kell végezni. Minden reagenst elő kell készíteni a teszt megkezdése előtt. A teszteljárást bemutató videót, valamint a legtöbb technikai probléma megoldását megtalálhatja a Gnowee webhelyen, ha regisztrál közvetlenül a www.gnowee.net weblapon az online eléréshez. Terméktájékoztató és technikai útmutató ingyenesen rendelkezésre áll a QIAGEN forgalmazójától, illetve ha felkeresi a www.quantiferon.com webhelyet. 26 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

11. Bibliográfia A Gnowee QuantiFERON referencia könyvtárában (reference library) megtalálható a QFT referenciák átfogó listája a www.gnowee.net webhelyen. 1. Andersen, P. et al. (2000) Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 356, 1099. 2. Balcells, M.E. et al. (2008) A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int. J. Infect. Dis. 12, 645. 3. Bartalesi, F. et al. (2009) QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur. Respir. J. 33, 586. 4. Bocchino, M. et al. (2008) Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-tnf-alpha treatment. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27,907. 5. Brock, I. et al. (2006) Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M. tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir. Res. 7, 56. 6. Chun, J.K. et al. (2008) The role of a whole blood interferon gamma assay for the detection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 62, 389. 7. Connell, T.G. et al. (2008) A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 3, e2624. doi: 10.1371/journal.pone.0002624. 8. Detjen, A.K. et al. (2007) Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 45, 322. 9. Diel, R. et al. (2009) Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB-Gold In-Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest 135, 1010. 10. Diel, R. et al. (2008) Predictive value of a whole-blood IFN-γ assay for the development of active TB disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177, 1164. 11. Diel, R. et al. (2006) Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir. Res. 7, 77. 12. Dogra, S. et al. (2007) Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J. Infect. 54, 267. 13. Drobniewski, F. et al. (2007) Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 4, e55. 14. Gerogianni, I. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology 13, 270. 15. Harada, N. et al. (2008) Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferongamma assays for M. tuberculosis infection. J. Infect. 56, 348. 16. Higuchi, K. et al. (2009) Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med. Microbiol. Immunol. 198, 33. 17. Kang, Y.A. et al. (2005) Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA 293, 2756. 18. Katiyar, S.K. et al. (2008) Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, 1146. 19. Kipfer, B. et al. (2008) Tuberculosis in a Swiss army training camp: contact investigation using an Interferon gamma release assay. Swiss. Med. Wkly. 138, 267. 20. Luetkemeyer, A. et al. (2007) Comparison of an interferon-gamma release assay with tuberculin skin testing in HIV-infected individuals. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 737. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07 27