A TÁPSZER HOSSZÚ SZÉNLÁNCÚ TÖBBSZÖRÖSEN TELÍTETLEN ZSÍRSAVAKKAL VALÓ KIEGÉSZÍTÉSÉNEK HATÁSA AZ ESSZENCIÁLIS ZSÍRSAVAK ANYAGCSERÉJÉRE ÉRETT ÉS KORASZÜLÖTT FŐEMLŐSMODELLBEN Doktori értekezés tézisei Sarkadi Nagy Eszter Témavezető: Dr. Szollár Lajos Pd.D. vizsgabizottság: Dr. János Fehér Dr. Erika Tomsits Dr. Gyula Pados Opponensek: Dr. József Pucsok Dr. Erika Tomsits Semmelweis Egyetem, Kórélettani Intézet Patológiai Tudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Doktori Iskola 2003
A kutatás előzményei és céljai A dokozahexaénsav (DHA, 22:6n-3) és arachidonsav (ARA, 20:4n-6) az agy és retina fejlődéséban fontos szerepet játszó, hosszú szénláncú zsírsavak (LCP). Az emlős szervezet képes DHA-t szintetizálni linolénsavból (LNA) és ARA-t szintetizálni linolsavból (LA) elongációs és deszaturációs lépésekkel. A linolénsav és linolsav esszenciális zsírsavak mivel a szintézisükre az ember szervezete képtelen. Az emberi agy fejlődésének legintenzívebb időszaka a terhesség 28. hetétől egy és fél éves korig tart, ezen időszak alatt DHA halmozódik fel az agyban és más szövetekben is (máj, zsírszövet). A koraszülötteknek a terhesség 28. hetétől esélyük van a túlélésre, de kevés a zsírszöveti raktáruk az időre született társaikhoz képest és a placenta helyett a csecsemőtápszer kell hogy biztosítsa számukra a szükséges zsírsavakat. Izotópos nyomkövetéses vizsgálatok bebizonyították, hogy a koraszülöttek és érett újszülöttek képesek ARA-t és DHA-t szintetizálni, de kevéssé ismert mi befolyásolja e szintézist. I. A kísérleteink célja, a koraszülöttség és a tápszer hosszú szénláncú zsírsavakkal történő kiegészítésének vizsgálata az össz-zsírsav összetételre, valamint a DHA és ARA szintézisére az agyban, retinában, a retina pigment epitéliumában (RPE), a májban, a vörösvértest membránjában (vvt. mb.) és a plazmában újszülött majmokban. A hosszú szénláncú zsírsavak szöveti mennyiségének meghatározására nincs lehetőség emberben, mert szöveti mintavétel lenne szükséges. Emberben a hozzáférhető szövetek legtöbbször a vvt. membránja vagy a plazma és ebből következtetnek a szöveti zsírsavmennyiségre, bár a kettő közötti összefüggés nem kellően tisztázott. Állatkísérletek szükségesek a 2
szöveti mintavételhez, és az emberi agy kivételes mérete és felépítése a legjobban majomaggyal modellezhető. II. A plazma és vörösvértest ARA és DHA koncentrációinak összefüggését vizsgáltuk a fejlődő szövetek ARA és DHA koncentrációival, hogy ezzel elősegítsük azon humán vizsgálatok értelmezését, ahol csak plazma vagy vörösvértest áll rendelkezésre. 1. Módszerek A pávián gyakori modellje a koraszülöttségnek és szabadon mindenevő állat, ezáltal a koraszülöttek zsírsavanyagcseréjének vizsgálatára alkalmas modell. Huszonkettő darab terhes majom, illetve újszülöttjeik véletlenszerű elosztással kerültek a következő csoportokba: érett, anyatejjel táplált (B; n=5); érett, tápszeres (T-; n=7); koraszülött, tápszeres (P-; n=5); koraszülött, ARA/DHA kiegészített tápszeres (P+; n=5). Az izotópos anyagcserevizsgálatban ugyanezen állatok szerepeltek, kivétel kettő az érett tápszeres újszülött csoportból és egy az érett anyatejes csoportból. Az érett újszülöttek természetes úton születtek meg körülbelül 182 napig tartó terhesség után. A tápszeres állatokat az életük első 12 órájában elválasztottuk anyjuktól és mesterséges körülmények között, humán csecsemők táplálására használt, hosszú szénláncú zsírsavak nélküli tápszerrel (Enfacare, Mead-Johnson, Evansville, IN) etettük őket négy hétig. A koraszülöttek császármetszéssel jöttek világra, 153±4 napra. Öt koraszülött az érett újszülöttek tápszerét kapta, míg egy másik öt koraszülöttet tartalmazó csoport ARA/DHA kiegészítetten kapta ugyanezen tápszert (0.6 energia% ARA, 0.3 energia% DHA). Az állatok a születésüket követő, illetve a koraszülöttek a 182 napos terhességhez 3
számított 14. napon 20.9±1.5 mg 13 C izotóppal jelölt linolénsavat (LNA*) és 21.0±2.3 mg 13 C izotóppal jelölt linolsavat (LA*) kaptak orálisan, egy dózisban. Minden állat 4 hetes koráig élt, illetve a koraszülöttek a 182 napos terhességhez számítva 4 hétig, amikor megtörtént a mintavétel. A szövetekből, tápszerből, anyatejből a zsírokat Bligh és Dyer módszere szerint vontuk ki metanol, kloroform, víz 2:1:0.8 arányú elegyével. Lúgos hidrolízissel és bór-trifluoridos metanolos észterezés után zsírsav metilésztert nyertünk. Gázkromatográfiásan, poláros kapilláris oszlopon (HP 5890 GC láng ionizációs detektorral; BPX-70 kapilláris oszlop: 60 m 0.32 mm ID 0.25 µm filmvastagság, H 2 vívőgázzal) a zsírsavakat szétválasztottuk szénatomszám és telítettség szerint. Az egyes zsírsavak mennyiségét az össz-zsírsav tömeg%-ban adtuk meg. Az izotóp arány méréseket gázkromatográfiás izotóp arány tömegspektrométer rendszerrel végeztük (GCC-IRMS; Finnigan 252). A mintaelőkészítés az össz-zsírsav összetétel meghatározásánál leírt módon történt. A gázkromatográfiás szétválasztás után a minta az izotóp arány tömegspektrométerbe került, ahol az egyes zsírsavcsúcsokhoz tartozó 13 C/ 12 C arányt mértük. Ennek ismeretében kiszámoltuk az agyban levő jelzett LNA*-ból keletkező jelzett DHA* mennyiségét, valamint a jelzett LA*-ból keletkező jelzett ARA* mennyiségét az agy teljes nedves tömegére vonatkoztatva (ugyanezt a számolást végeztük el az egyéb vizsgált szövetekre is). Ezt a mennyiséget normalizálva az orálisan bevitt jelzett LNA*, illetve LA* mennyiségére megkaptuk a dózis% értékét, ami azt mutatja meg, hogy a jelzett LNA*-nak, illetve LA* nak hány százaléka alakul át és épül be a vizsgált szövetekbe, mint jelzett DHA*, illetve ARA*. 4
Az adatokat átlag ± szórás (SD) formájában közöljük. A négy csoport közötti különbséget egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) vizsgáltuk és akkor tekintettük különbözőnek ha p< 0.05. Post-hoc tesztként az izotópos vizsgálathoz Tukey tesztet használtunk, az össz-zsírsav meghatározásánál az elemszám különbözősége miatt, a Tukey tesztnek egy erre az esetre módosított változatát. A plazma és vörösvértest DHA és szöveti DHA közötti korreláció vizsgálatára az SPSS statisztikai programcsomagban az általános lineáris modellt használtunk. 2. Eredmények I. A tápszerkiegészítés és koraszülöttség hatásai 1. A DHA /ARA tápszerkiegészítés hatására a szöveti DHA koncentráció növekedett a koraszülöttekben. A kiegészítés mértéke nem volt elegendő ahhoz, hogy a koraszülöttekben az agy, vörösvértest és plazma DHA szintjei elérjék a referencia csoportként használt anyatejes csoport DHA koncentrációit (1. Ábra). Az arachidonsav szintje nem változott az egyes szövetekben a tápszerkiegészítés után. 2. A koraszülöttség hatására az agy DHA koncentrációja kisebb volt, mint az érett újszülöttekben és a DPA/DHA index, az n-3 zsírsavhiány mutatója, magasabb volt a retinában és retina pigment epitheliumában. A koraszülött állatok agyszövetében magasabb ARA koncentrációt találtunk, mint az időre született állatoknál. 3. A tápszerrel etetett csoportokban fokozódott a DHA/ARA bioszintézis az anyatejjel etetett állatok szintéziséhez képest. A tápszer kiegészítésének hatására az előanyagból történő ARA/DHA szintézis némileg csökkent, közelítve ezzel az anyatejes csoportban mérhető értékhez, de a csökkenés csak a vörösvértest esetében volt szignifikáns. 5
4. A koraszülöttek ARA/DHA szintézise a tápszert fogyasztó érett újszülöttekéhez hasonló volt (2. Ábra). A [22:6n-3] (%wt) 30 25 20 15 10 a b c d * * * B T- P- P+ a b b c a b b c 5 0 Brain Retina Liver RPE RBC Plasma 1. Ábra. Az agy, retina, máj, retina pigment epithelium (RPE), vörösvértest (RBC), plazma DHA koncentrációi. Ha az oszlopok feletti betűk különbözőek, akkor a két csoport statisztikailag különböző (p<0.05). A * -al jelölt csoportoknál az anyatejes (B)/koraszülött, kiegészített tápszeres (P+) kezelési csoport és az érett, tápszeres (T-)/ koraszülött, tápszeres (P-) kezelési csoportok egymástól különböznek, de a kezelési csoporton belül nincs különbség. n=5 B, P-, P+ és n=7 T-. FA* equiv. (% Dose) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 Brain a b B T- P- P+ ab ab A B B B 0.2 0.0 AA ARA* DHA* 2. Ábra. Az agyban mért ARA* és DHA* a jelzett LA* and LNA* adása után 2 héttel. A dózis% érték a jelzett zsírsav termékké alakulását mutatja, ami beépült az agyba. n=5 T-, P-, P+, és n=4 B. Az értékek különböznek (p<0.05), ha nem azonos betűvel vannak jelölve. A kisbetűk az ARA* ra a nagybetűk a DHA* ra vonatkoznak. II. Korrelációk 1. A plazma és vörösvértest membrán ARA nem jó előrejelzéje a szöveti ARA szinteknek. 6
2. A plazma és vörösvértest membrán DHA jó előrejelzője a szöveti DHA koncentrációnak. 3. Plazma és vvt. mb. DHA* ( * jelzettet jelent) és ARA* jó összefüggést mutat a szöveti DHA* and ARA* szintekkel és a szöveti DHA* és a véralkotókban mért DHA* között szorosabb az összefüggés, mint az ARA* esetében. 3. Összefoglalás Eredményeink azt mutatják, hogy a hosszú szénláncú zsírsavak nélküli tápszeres etetés jelentős csökkenést eredményezett az agy és egyéb szövetek DHA koncentrációjában, valamint a kiegészített tápszer (0.3 energia% DHA and 0.6 energia% ARA) megakadályozta ezt a csökkenést a retinában, retina pigment epitheliumában és a májban. A retina és az agy DHA mennyisége ellenállóbb a n-3 zsírsavak hiányának mint a máj vagy a plazma DHA. A szöveti arachidonsav koncentráció kevéssé változik a tápszerkiegészítés és a koraszülöttség hatására. A szövetek ARA szintje nem változik a vörösvértest membránjának és a plazmának az ARA szintjével, így nem lehet használni a szövetek ARA koncentrációjának becslésére. Ugyanakkor a vvt. membrán és a plazma DHA koncentráció értékei jó előrejelzői a szöveti értékeknek. Továbbá adataink azt mutatják, hogy a hosszú szénláncú zsírsavat nem tartalmazó tápszeres etetés, mind érett, mind koraszülött állatokban fokozza az előanyagból történő ARA/DHA szintézist, az anyatejes csoporthoz viszonyítva. Koraszülöttekben ezt a hatást a 0.3 energia % DHA-t és 0.6 energia % ARA-t tartalmazó tápszer csak részlegesen tudja visszaállítani az anyatejes referenciacsoport (alacsony) szintjére. A tápszeres csoportok között azonban nincs különbség az ARA szintézisében a vizsgált szövetekben. A vvt. membránjában mért jelzett ARA* és DHA* 7
szoros összefüggést mutatott az agy és retina ugyanezen értékeivel. Az eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a koraszülöttek tápszerkiegészítésére a manapság használt és javasolt mennyiségű DHAnál nagyobb mennyiség lehet szükséges. A DHA sejtszintű folyamatokra való hatásának és szerepének megismerése tovább folytatódik. Az elmúlt évek kutatásai választ adtak számos kérdésre, például sokat tanulmányozott és ismert a DHA szerepe a retina pálcika fotoreceptor sejtjeinek működésében, ugyanakkor a csapokban betöltött szerepe nem kellően ismert. További kutatás szükséges a DHA érzékelésben és kognitív folyamatokban betöltött szerepének tisztázására. Ezeknek a megértése egyben segítséget jelentene abban, hogy még specifikusabb, DHA hatásait vizsgáló funkcionális teszteket lehessen használni a n-3 zsírsavak hiányának kimutatására. Az érett, illetve koraszülött csecsemők hosszú szénláncú zsírsav szükséglete ma is intenzív kutatási terület. Ezekben a vizsgálatokban a különböző diéták hatására bekövetkező biokémiai paraméterek változását mérik, vagy valamely élettani funkció változását vizsgáljak. Ahhoz, hogy elérjük végső célként a koraszülött és érett csecsemők hosszú szénláncú zsírsav szükségletének meghatározását, ezen vizsgálatoknak a kombinációja lenne szükséges, ahol egy vizsgálaton belül a zsírsav-státus összefüggését tanulmányozzák a látás és egyéb funkcionális teszteken elért eredményekkel. 8
4. Publikációk A disszertáció témájában megjelent közlemények 1. Sarkadi-Nagy, E., Wijendran, V., Diau, G.Y., Chueh Chao, A., Hsieh, A. T., Turpeinen, A., Nathanielsz, W. P., Brenna, J.T. Effect of polyunsaturates and prematurity on brain and related tissue fatty acid composition. [in press] Pediatric Research 2. Sarkadi-Nagy, E., Wijendran, V., Diau, G.Y., Chueh Chao, A., Hsieh, A.T., Turpeinen, A., Lawrence, P., Nathanielsz, W.P., Brenna, J.T. Formula feeding potentiates docosahexaenoic acid and arachidonic acid biosynthesis in term or preterm four-week adjusted age baboons. [submitted in February, 2003] Journal of Lipid Research 3. Diau, G.Y., Loew, E.R., Wijendran, V., Sarkadi-Nagy, E., Nathanielsz, P.W., Brenna, J.T. Docosahexaenoic acid and arachidonic acid influence on preterm baboon retinal composition and function. [Submitted in April, 2002] Investigative Ophthalmology and Visual Science Egyéb publikációk hosszú szénláncú zsírsavak témájában: 1. Sarkadi-Nagy, E., Huang, M.C., Kirwan, R., Chueh Chao, A., Tschanz, C., Brenna, J. T. Effect of increasing dietary long chain polyunsaturates with high vitamin E on lipid peroxidation and susceptibility to oxidation of piglet erythrocytes, plasma, and liver. [in press] European Journal of Nutrition 2. Diau, G.Y., Sarkadi-Nagy, E., Wijendran, V, Nathanielsz, P. W. and Brenna, J. T. Baboon Neonate Basal Ganglia are Rich in Docosahexaenoic Acid [submitted in September 2002] J Neurochem 3. Chueh Chao, A., Diau, G.Y., Wijendran, V., Sarkadi-Nagy, E., Hsieh, A. T., Nathanielsz, W. P., Brenna, J.T. Influence of Dietary Long Chain 9
Polyunsaturated Fatty Acids on Premature Baboon Lung Fatty Acid Composition. [Submitted in October 2002] Lipids Egyéb publikációk: Ungvari, Z., Sarkadi-Nagy, E., Bagi, Z., Szollar, L., Koller, A. (2000). Simultaneously increased TXA 2 activity in isolated arterioles and platelets of rats with hyperhomocysteinemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20(5): 1203-8. Kongresszusi absztraktok Eszter Sarkadi-Nagy, Vasuki Wijendran, Guan Yeu Diau, Andrea Hsieh, Angela Chao, Anu Turpeinen, Peter W. Nathanielsz, J. Thomas Brenna. Formula-feeding potentiates docosahexaenoic and arachidonic acid biosynthesis in term and preterm four-week adjusted age baboons. XXXII. Membrán Transzport Konferencia, Sumeg, 2002. Eszter Sarkadi-Nagy, Vasuki Wijendran, Guan Yeu Diau, Andrea Hsieh, Angela Chao, Anu Turpeinen, Peter W. Nathanielsz, J. Thomas Brenna. Correspondence between long chain polyunsaturate (LCP) concentrations in plasma and red blood cell (RBC) versus neural and related tissues. Experimental Biology Meeting, New Orleans, 2002. Eszter Sarkadi-Nagy, Vasuki Wijendran, Guan Yeu Diau, Andrea Hsieh, Angela Chao, Anu Turpeinen, Peter W. Nathanielsz, J. Thomas Brenna. Formula-feeding potentiates docosahexaenoic and arachidonic acid biosynthesis in term and preterm four-week adjusted age baboons. Experimental Biology Meeting, New Orleans, 2002. Guan-Yeu Diau, Eszter Sarkadi Nagy, Andrea Hseih, Angela Chueh Chao, Vasuki Wijendran, Peter W. Nathanielsz, J. Thomas Brenna. Central 10
nervous system (CNS) docosahexaenoic acid (DHA) concentrations are highly correlated with energy consumption. Experimental Biology Meeting, New Orleans, 2002. Guan-Yeu Diau, Ellis R. Loew, Vasuki Wijendran, Eszter Sarkadi Nagy, Andrea Hseih, Angela Chueh Chao, Carolyn Tschanz, Darlene Campbell, Peter W. Nathanielsz, J. Thomas Brenna. Functional consequences of prematurity and long chain polyunsaturate (LCP) supplementation on baboon neonate electroretinograms (ERGs) related to retina fatty acid composition. Experimental Biology Meeting, New Orleans, 2002. G.-Y. Diau, V. Wijendran, E. Sarkadi-Nagy, A. Hseih, A. Turpeinen, P. W. Nathanielsz, J. T. Brenna. Quantitative Fatty Acid Mapping Of Four Week Old Term And Preterm Baboon Central Nervous System. American Oil Chemists Society Meeting, Minneapolis, 2001. E. Sarkadi-Nagy, M. C. Huang, R. Kirwan, A. Chao, C. Tschanz, J. T. Brenna. Effect of increasing dietary long chain polyunsaturates with high vitamin E on lipid peroxidation and susceptibility to oxidation of piglet erythrocytes, plasma, and liver. PUFA in Maternal and Child Health Meeting, Kansas City, MO, 2000. Ungvari, Z., Sarkadi-Nagy, E., Bagi, Z., Szollar, L., Koller, A. Increased PGH 2 /TXA 2 synthesis in isolated arterioles and platelets of rats with hyperhomocysteinemia. Magyar Élettani Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 1998. 11