XXVIII. OTDK, Biológia Szekció AZ AKUSZTIKUS INGEREK HATÁSA A LASSÚ ALVÁSI OSZCILLÁCIÓRA Szerző: Boldizsár Edit, V. évf. Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Témavezetők: Dr. Hajós Ferenc SZIE-Állatorvos-tudományi Kar, Anatómiai és Szövettani Tanszék Dr. Ulbert István MTA Pszichológiai Kutatóintézet Készült: MTA Pszichológiai Kutatóintézet, 2006
TARTALOMJEGYZÉK BEVEZETÉS... 3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 4 A természetes alvás jellemzői... 4 A lassú alvási oszcilláció (slow sleep oscillation, SO)... 6 A szenzoros rendszer és a lassú hullámú alvás kapcsolata... 8 A hallópálya felépítése... 9 A majom hallókérgének funkcionális sajátosságai... 11 A macska hallókérgének funkcionális sajátosságai... 12 Az agykéreg szerkezete... 13 A kérgi területek (mezők, areák) felépítése... 16 A kérgi modul... 16 Az EEG jelek keletkezésének mechanizmusa... 17 Az akusztikus eseményhez-kötött potenciál... 19 Az EKP komponensei... 20 KUTATÁSI CÉLJAINK... 22 MÓDSZEREK... 24 Műtéti technika, akut majom implantáció... 24 Macska implantáció, krónikus kísérletek... 24 Elektródok... 26 Rétegelektróda:... 26 Drót elektróda:... 26 Elektrofiziológiai regisztráció... 27 Jelanalízis... 28 CSD, MUA analízis... 28 Frekvencia, és idő-frekvencia tartománybeli analízis... 29 Up- és down-state fázis meghatározás, Hilbert- transzformáció... 29 Oszcillációs teljesítmény alapú up- és down-state meghatározás... 30 Esemény körüli idő-hisztogram elemzés... 31 Akusztikus ingerlés... 32 EREDMÉNYEK... 33 Majom kísérletek... 33 Macska kísérletek... 38 Spontán elvezetések... 38 Akusztikus ingerléses kísérletek... 40 KÖVETKEZTETÉSEK... 43 Az epilepszia és az alvás kapcsolata... 44 ÖSSZEFOGLALÓ... 46 IRODALOMJEGYZÉK... 48 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 51 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 53 2
BEVEZETÉS Alvásban mélyre ható fiziológiai változások zajlanak le az emlősök szervezetében. Ezek a változások érintik mind a környéki, mind a központi idegrendszert. Dolgozatomban a központi idegrendszer, azon belül is a szenzoros kéreg lassú hullámú alvás alatti működését vizsgáltam majmon és macskán. Kísérleteinkben ketamin-xylazin narkózist használtunk, az irodalmi adatok szerint ez az altatás modellezi legjobban a természetes alvás lassú hullámú szakaszát. A természetes alvás dinamikus folyamat, különböző fázisokból áll, egyik fontos szakasza a lassú hullámú fázis. Ebben a fázisban történik a memória nyomok megerősödése, nagy szerepe van az agyi homeosztázis fenntartásában, valamint egyes epilepszia-formák ebben az alvási fázisban jelennek meg. Alvás, és különösen a lassú hullámú alvás alatt az agy jóval kevésbé tart kapcsolatot a külvilággal (disszociáció), mint éber állapotban, bár bizonyos szenzoros ingerek ilyenkor is ébredéshez vezetnek. A klasszikus elmélet szerint lassú hullámú alvásban a thalamikus átkapcsoló (relé) sejtek hiperpolarizáltabb állapotban vannak, mint ébrenlétben, ezért jóval kevésbé továbbítják a perifériáról beérkező szenzoros ingereket az agykéreg felé. A klasszikus elmélet további tétele szerint a kéreg a lassú alvási oszcilláció elsődleges generátora, ez a kérgi eredetű oszcilláció hajtja a thalamikus sejteket. Az utóbbi években több tanulmány vitatta a klasszikus elméletet. Kiemelhető ezek közül Bower és munkatársainak vizsgálata, melyben patkány szaglókérgében vizsgálták a lassú alvási oszcilláció tulajdonságait. Eredményeik szerint a szabad lélegzés szinkronizálta a pyriform kéreg lassú oszcillációját, míg tracheotomizált preparátumban ez a hatás nem jelentkezett. Kimutatták, hogy az orrüreg szenzoros apparátusa felelős a légzési ritmus és a lassú kérgi oszcilláció közötti szinkronizáció kialakulásáért. Elsődleges kérdésfeltevésünk az volt, létezik-e magasabb rendű emlősökben is - mint a majom és a macska - hasonló kapcsolat - mint patkányban - a ritmikusan bemutatott szenzoros ingerek és a kérgi lassú oszcilláció között. További kérdéseink a szinkronizáció tulajdonságainak idő és térbeli leírására vonatkoztak. 3
IRODALMI ÁTTEKINTÉS A természetes alvás jellemzői Az alvás természetének ismertetésekor az emberre jellemző adatokat veszem alapul (Kandel 2000). Ennek oka a nagyfokú hasonlóság az emberi és állati alvásmechanizmusok között. Az alvási ciklus ismétlődő stádiumokból épül föl (Bódizs 2000). Az elalvástól a természetes ébredésig tartó időszak alatt az alvás mélysége nem egyenletes, hanem folyamatosan ingadozik. Az elalvást követően előbb folyamatosan mélyül, majd ismét felületesebbé válik, és ezek a ciklusok ismétlődnek. Az alvást közvetlenül megelőző rövid időszakban az alfa-ritmus dominál. Az elalvási időszakban az alfa-hullámok rövid ideig tartó csoportokba szedődnek. Az alvás progresszív mélyülésének négy szintjét és a REM fázist (rapid eye movements, REM) különíthetjük el egy alváscikluson belül. A REM alvásfázisok közötti alvást non-rem alvásnak (nem REM), vagy lassú hullámú alvásnak (slow wave sleep, SWS) nevezzük (1. ábra). Elalváskor először a non-rem 1. stádiuma jelentkezik, ami gyakorlatilag pár percig tartó szendergést jelent. Ilyenkor a 8-12 Hz-es alfa hullámok eltűnnek az EEG regisztrátumból, azaz a hullámok amplitúdójának csökkenése dominál, helyüket alacsony feszültségű háttértevékenység és szórványosan jelentkező 80-100 msec időtartamú, nagyfeszültségű (20-100 mikrov) theta-sorozatok veszik át. A szendergés stádiumában sok más élettani változás is bekövetkezik, amelyek közül a legismertebbek az izomtónus globális csökkenése, a szívritmus és a légzésritmus csökkenése és szabályosabbá válása, a belégzés mélyülése, valamint a vérnyomásnak és a bőr elektromos vezetőképességének csökkenése. Az éber, pásztázó szemmozgások helyett lassú szemmozgások láthatók. A non-rem alvás 2. stádiuma a szendergést követő felületes alvás. EEG-n az alvási orsók és az időnként spontán hangingerekre válaszként megjelenő K-komplexek jellemzik. Az alvási orsók 12-14 Hz-es, 1-3 sec-ig tartó és 3-10 sec-onként jelentkező, szinuszoid hullámsorozatok, amelyekben a hullámok amplitúdója progresszíven nő, majd fokozatosan csökken. Eredetüket tekintve a thalamokortikális rendszer oszcilláló működésének termékei, amely a non-rem alvás idegélettanának egyik fontos jellemzője. A háttértevékenység 4
általában lassúbb, mint a szendergés stádiumában, és többnyire a theta (4-7.5 Hz), valamint a delta (0.5-3.5 Hz) sávba esik. A szendergésben leírt élettani változások ebben a stádiumban jobban kihangsúlyozódnak, a lassú szemmozgások viszont megszűnnek. A non-rem-alvás 3. stádiuma a középmély alvás. A háttértevékenység lassul, a deltatartomány irányába tolódik el, és nagyobb feszültségűvé válik. K-komplexek és alvási orsók továbbra is jelentkezhetnek, de gyakoriságuk az előző stádiumhoz képest csökken. Az EEG 20-50%-át ilyen lassú delta-hullámok teszik ki. Az izomtónus tovább csökken, a szemmozgások hiányoznak. A non-rem alvás 4. stádiumát a nagy amplitúdójú delta-aktivitás jellemzi. A 3. és 4. stádium felel meg a mély alvásnak, amelyből az alvó személy csak nehezen, erős külső ingerekkel ébreszthető. Ebben a fázisban van mód a leglassúbb potenciálváltozások megfigyelésére, ezek frekvenciája 0.2-1 Hz közé esik (slow oscillation, SO). Az 1.-4.-ig tartó stádiumokban az izomtónus ugyan csökken, de nem szűnik meg. 1. ábra: Alvás. EEG felvételek emberből, ébrenlét és alvás során. Az EEG deszinkronizált az ébrenlét, és REM fázisokban, míg erősen szinkronizált non- REM alvásban. A hypnogram mutatja az alvás egymást követő fázisait. Az egyre mélyülő alvás az elalvást követően kb. 45 perc múlva az előbbivel fordított sorrendben alakul, és végül a 3. és 2. stádiumokon keresztül visszatér az 1. szakaszba. Ekkor az alvás új fázisba megy át: az EEG deszinkronizálódik, az izomtónus megszűnik (kivételt képeznek a külső szemizmok, a középfül izmai és a légzőizmok), és fázisos, gyors szemmozgások, rángások jelentkeznek a szemhéjon, végtagokon. Ez utóbbiról kapta ez a szakasz a gyors szemmozgások periódusa (rapid eye movements, REM) elnevezést. A REM 5
szakasz általában a felületes alvási stádiumból alakul ki. Időnkét ebben a szakaszban is megjelennek a theta sorozatok. A theta aktivitás különösen jellemző a hippokampuszra. Ez a fázis tekinthető az álmodási periódusnak. A lassú alvási oszcilláció (slow sleep oscillation, SO) A lassú alvási oszcillációt (0.1-1 Hz) Steriade (Steriade, Nunez et al. 1993) és kollégái eredetileg szomato-motoros agykérgi szinten figyelték meg urethan és ketamin-xylazin altatásban (Dossi, Nunez et al. 1992). Később bebizonyították, hogy természetes lassú hullámú non-rem alvásban is hasonló aktivitás látható macska agykérgén (Steriade, Timofeev et al. 2001). A lassú oszcillációt extra- és intracelluláris elvezetésekkel vizsgálták kérgi és thalamikus szinteken. Az SO kettő fázisra bontható: az aktív (depolarizációs), illetve az inaktív (hiperpolarizációs) fázisra (Steriade, Nunez et al. 1993). Ezen fázisok ritmikus ismétlődése alkotja a lassú oszcillációt narkózisban, és a természetes alvás non-rem stádiumában (Steriade, Amzica 1998). Wilson és Kawaguchi is hasonló mintázatot talált a neostriatum neuronjait vizsgálva, amelyre bevezette a ma széles körben elterjedt terminológiát: up-state - nek nevezte el a SO depolarizációs fázisát, down-state -nek a hiperpolarizációs fázist (Wilson, Kawaguchi 1996). Az angol elnevezés szemléletesen mutatja, hogy az agy a lassú oszcillációban ciklikusan alacsony (down-state), illetve magas (up-state) aktivitást mutat. A hiperpolarizációs fázisban mind a kortikális, mind a thalamikus sejtek membránja hiperpolarizált (Steriade, Contreras et al. 1993), nem mutat oszcillációt, nem generál akciós potenciált, a membránáramok nagy részben K + -áramok. Down-state-ben sem a principális sejtek, sem az interneuronok nem mutatnak akciós potenciál aktivitást, tehát a kialakult hiperpolarizáció valószínűleg nem GABAerg. A szinaptikus bemenetet vizsgálva gyakorlatilag nullára esett a posztszinaptikus események száma. Éber állat esetén minden sejten megfigyelhető nagyszámú posztszinaptikus esemény, ez a szinaptikus facilitáció. Mivel a hiperpolarizációs fázisban ez nincsen jelen, ezt a fázist diszfacilitációs szakasznak is nevezik (Timofeev, Grenier et al. 2001). Extracelluláris elvezetésekben a hiperpolarizációs fázisra az agykéreg mélységében (1-1.5 mm) nagy pozitív, illetve annak felszínén nagy negatív hullám a jellemző. Szimultán extra- és intracelluláris vizsgálatokban kimutatták, hogy a mély pozitív komponens időben egybeesik a sejtek hiperpolarizációjával. 6
A klasszikus thalamikus kapuzási elmélet szerint a kéregről a thalamuszba terjedő hiperpolarizáció a thalamusz szintjén gátolja az ingerület átvitelt, így alvásban nem jut feljebb az információ a kérgi szintre, ez lenne az oka az alvás alatti disszociált állapotnak (Steriade 1997). 2. ábra: A lassú oszcilláció. Egyidejű intracelluláris (IC) és mélységi EEG elvezetés mutatja a lassú oszcillációt ketamin-xylazinnal altatott macskán. A sejt tüzelési mintázata erős korrelációt mutat az EEG regisztrátummal. Up-state, vagy depolarizációs fázis során a sejtek tüzelnek, ekkor a mélységi EEG-ben negativitást látunk, downstate-ek alatt (csillaggal jelölve) a sejtek hiperpolarizáltak, amely a mélységi EEG-n látható nagy pozitivitással esik egybe. A depolarizációs fázisban mind a kortikális, mind a thalamikus sejtek membránja depolarizált, oszcillációt mutat, akciós potenciált generál, a membrán áramok kevertek. Ez az állapot nagyban hasonlít az ébrenléthez. Mind a principális, mind az interneuronok tüzelnek, a kialakuló posztszinaptikus facilitációra mind az excitátoros, mind az inhibítoros áramok jellemzőek. A szinaptikus bemenetek száma igen nagy, hasonló, mint éber állapotban. Extracelluláris elvezetésekben a depolarizációs fázisra a mélységi negativitás, felszíni pozitivitás jellemző. Szimultán extra- és intracelluláris vizsgálatokban kimutatták, hogy a mély negatív komponens időben egybeesik a sejtek depolarizációjával. A komplett lassú oszcilláció alatt a membránpotenciál tehát bimodális eloszlást mutat. (2. ábra) A klasszikus hipotézis szerint a lassú oszcilláció a kéregben generálódik, majd később a thalamusz is bevonódik a folyamatba (Steriade 2006). Az így kialakuló thalamokortikális interakció formálja a lassú oszcillációt. Up-state alatt alakulnak ki az egyes agyi oszcillációkra jellemző mintázatok a kéreg, a primer thalamusz- és a retikuláris thalamuszmagvak (nucl. reticularis thalami, nrt) kölcsönhatása következtében. A lassú oszcillációnak fontos és szerteágazó funkciókat tulajdonítanak. Kimutatták, hogy szerepe van az agyi metabolikus homeosztázis fenntartásában, a memória bevésődésében (Steriade 1999), az epilepszia keletkezésében (Steriade, Amzica 1998). 7
A szenzoros rendszer és a lassú hullámú alvás kapcsolata Mindenki által ismert tény, hogy alvásban a tudat és a külvilág viszonya nagymértékben eltér az ébrenlétben tapasztaltaktól. Alvás alatt az információ nagy része nem tudatosul, bár bizonyos ingerekkel ki lehet váltani az ébredést. Különösen fontos szerepe van az ébredési reakciókban az akusztikus modalitásnak, mivel ellentétben például a látással, a fülünket nem tudjuk elzárni a környezeti ingerektől. A klasszikus thalamikus kapuzási elmélet szerint non-rem alvásban a thalamikus relé sejtek relatíve hiperpolarizáltak az éber szinthez képest, így nem tudják közvetíteni a perifériás impulzusokat az agykéreg felé (Steriade, Timofeev et al. 2001). Mivel nincsen kérgi akusztikus bemenet, ezért nincs mit feldolgozni, tehát a kéreg thalamikus szinten el van zárva a külvilágtól. A klasszikus thalamikus kapuzási elmélet jól egybevág a lassú oszcilláció kérgi genezisének klasszikus elméletével, mindkettő azt mondja ki, hogy non-rem alvásban belső világunk nagymértékben disszociált a külvilágtól (Steriade 2006). Ebben az állapotban szenzoros információ nem érkezik a kéregbe, a kéreg saját maga alakítja ki a lassú oszcillációt, ami a homeosztatikus és memória konszolidációs működések fenntartásához szükséges. Napjainkban egyre több, a klasszikus elmélettel nem magyarázható jelenséget mutatnak ki. Castro-Alamancos patkányokon vizsgálta az ébrenléti szint hatását az eseményhez kötött potenciálokra egy speciális modellben (Castro-Alamancos, Rigas 2002). Azt találta, hogy alvási állapotban a szomatoszenzoros kérgi kiváltott potenciál nagysága, térbeli kiterjedése és a sejtkisülési aktivitás mértéke sokkal nagyobb, mint éberhez hasonló állapotban (Castro-Alamancos, Oldford 2002). Bower szintén patkányokon vizsgálta altatásban a szaglórendszert (Fontanini, Spano et al. 2003), és azt találta, hogy a pyriform kéreg lassú oszcillációja szinkronitást mutat az orrban áramló levegő mozgásával. Normál légzés alatt a légzéssel volt szinkron a kérgi SO (Fontanini, Bower 2005). Tracheális kanülön át, mesterséges lélegeztetés hatására, mikor az áramlás megkerülte az orrnyálkahártya receptorait, ez a szinkronitás megszűnt (Fontanini, Bower 2006). Mindkét kísérlet arra enged következtetni, hogy a klasszikus elméletek nem helytállóak patkány esetében. 8
A hallópálya felépítése Kísérleteinkben a hallópálya ingerlésének hatását vizsgáltuk, ezért ebben a fejezetben összefoglalom a hangingerek feldolgozásának összes állomását, hogy képet adjak a hallás útján beérkező információ sorsáról, amíg a fülből az elsődleges hallóközpontba (Brodmann 41., 42.) megérkezik (Fonyó 1999; Kandel 2000). Az alapvető anatómiai és funkcionális kapcsolatok macskában, majomban és emberben nagyon hasonlóak, itt az emberi anatómiát írom le (3. ábra). A nervus vestibulocohlearis pars cohlearis-ának az elsődleges érző neuronokat tartalmazó dúcából (ganglion spirale) futnak ki a ggl. spirale neuronjainak centrális nyúlványai. Ezek képezik a n. vestibulocochlearis pars cochlearis-át. Az axonok a canalis longitudinalis modioli-n keresztülfutva lépnek a meatus acusticus internus-ba, ahol összetapadva a pars vestibularis-sal alkotják a VII. agyideget. A meatus-t elhagyva a rostok belépnek az agytörzsbe, ahol a medulla oblongata és a pons határán található nucleus cochlearis ventralis- és dorsalis-ban végződnek. Az organum spirale-nak a csiga bázisához közeli területeiről induló rostok, melyek a hang magas frekvenciás komponenseit közvetítik, a magvak medialis, a csiga csúcsához közeli részeiről induló rostok, melyek a hang alacsony frekvenciás komponenseit közvetítik, a magvak lateralis részében érnek véget. Így a csiga tonotópiás (a frekvencia és a térbeli reprezentáció szoros kapcsolata) elrendeződése tükröződik a magvakban is. A nucleus cochlearis ventralis-ból eredő rostok az azonos- és ellenoldali oliva superior-hoz futnak. Az ellenoldali maghoz futó rostkötegek, az ellenoldalról jövő hasonló rostokkal együtt, alkotják a corpus trapezoideum kereszteződő rostrendszerét. Az azonos és ellenoldalról jövő hallórostok az oliva superior-ban ugyanazon tonotópiás elrendeződést követve végződnek, mégpedig úgy, hogy az alacsony frekvenciájú (mély) hangok által a csiga csúcsi részében keltett ingerületeket közvetítő rostok az oliva superior dorsalis, a nagy frekvenciájú (magas) hangok által a csiga bázisában keltett ingerületeket közvetítő rostok az oliva superior ventralis részéhez futnak. Az oliva superior tonotópiás elrendeződése a hallórendszer első olyan állomása, ahol lehetőség nyílik a két fülből jövő ingerületek integrálására. Itt veszi kezdetét a hangforrás térbeli lokalizálásának folyamata. 9
3. ábra: A hallópálya felépítése. A belső fülből érkező információ a nucleus cochlearis-on, illetve az oliva superior-on keresztül érkezik a nucleus lemniscus lateralis-ba, ahol átkapcsolódva továbbjut a nucleus colliculus inferiorba, majd a corpus geniculatum mediale-ba, és onnan átkapcsolódva éri el a hallókérget. Az oliva superior-ból eredő projekciós rostok az azonos oldali colliculus inferior-hoz futnak. Ehhez a felszálló rostköteghez, amit lemniscus lateralis-nak nevezünk, csatlakoznak az ellenoldali nucleus cochlearis dorsalis-ból eredő, és szintén a colliculus inferior-ban végződő rostok is. A lemniscus lateralis, lefutása közben a középagy oldalsó felszínén, a trigonum lemnisci területén egészen felületessé válik. Itt van egy közbeiktatott magva is, a nucleus lemnisci lateralis. A colliculus inferior-ból eredő axonok a corpus geniculatum mediale-ba (akusztikus thalamusz, utolsó relé állomás) vezetnek, majd a gyrus temporalis superior-nak, a fissura lateralis felé fordított felszínéhez (emberben Heschl gyrus, Brodmann 41., 42.), az elsődleges kérgi mezőhöz futnak be. Az akusztikus ingerületek tonotópiás elrendeződése jellemzi a hallópálya minden állomását. Ez egészen az elsődleges hallókéregig megőrződik, méghozzá úgy, hogy a magas hangok által a csiga bázisában keltett ingerületek az elsődleges hallókéreg mediális, a mély hangok által a csiga csúcsi részében keltett ingerületek pedig a primer hallókéreg laterális területeihez jutnak. 10
A majom hallókérgének funkcionális sajátosságai A rhesus majom (Macaca mulatta) hallókérge a sulcus lateralis ventrális falát alkotja, dorzálisan a szomatoszenzoros kéreg fekszik rá (4. ábra). Tehát a rhesus majom hallókérge nehezen elérhető, mivel az agy mélyén helyezkedik el. Emberben is hasonló az elrendezés. A primáták hallókérgét egy belső, ún. core (mag), egy vékony, határoló, ún. belt (öv), illetve a parabelt (öv körüli) régiók alkotják (Hackett, Karmos et al. 2005). A belt area laterális része kinyúlik a gyrus temporalis superior (STG) irányába, ahol a parabelt régióval határos. A központi rész (core) a tulajdonképpeni hallókéreg, amely csak hangingerekre ad választ. 4. ábra: Majom hallókérge. A majom hallókérge az insula felett található sulcus lateralis ventrális falát alkotja. Közvetlenül felette, a sulcus lateralis dorzális falában található az SII szomatoszenzoros kéreg. Az (A) ábra a majom agyának oldalsó nézetét mutatja, benne fekete színnel jelölve az insulát. A (B) ábra a szaggatott vonal mentén elmetszve mutatja a kérgi régiókat. A (C) ábra egy térbeli képet ad a majom hallókérgének különböző részeiről. A1: AI elsődleges hallókéreg CM: caudalis-medialis hallókéreg CL: caudalis-lateralis hallókéreg S2: SII szomatoszenzoros area RPB: rostralis parabelt area CPB: caudalis parabelt area A core area neuronjai tonotópiásan és nagyon szelektíven válaszolnak adott frekvenciás ingerekre, hangolási görbéjük keskeny. A core area két régióra oszlik, a primer, elsődleges (AI), és a szekunder, másodlagos (AII) régióra. A két régiót a tonotópia irányultsága, az auditoros bemenet időzítése és finom anatómiai jelek különítik el egymástól. A belt area a core régiót keskeny sávban övező, multiszenzoros, asszociációs, tehát több beérkező ingermodalitásra reagáló, integráló agyterület. A bejövő szomatoszenzoros ingerekre itt ugyanúgy látunk válaszreakciót, mint az auditoros ingerekre. A belt és parabelt neuronok is mutatnak tonotópiát, de a primer és szekunder területekhez képest kevésbé szelektíven válaszolnak az ingerlési frekvenciára, hangolási görbéjük az AI-hez képest széles (Hackett, Karmos et al. 2005). 11
A macska hallókérgének funkcionális sajátosságai A macska hallókérge az agy konvexitásán található, ezért könnyen vizsgálható, műtét alatt is rögtön szembetűnik (Karmos 2002). A primer hallókéreg (AI area) az agy laterális felszínén, a gyrus ectosylvius dorzális részén helyezkedik el (5A,B. ábra). A macskák AI areája megfelel a majmokban leírt AI areának. Akárcsak majmokban, tonotópiás szerveződést mutat a macskák AI areája is. A magas frekvenciák az AI elülső részén, míg az alacsony frekvenciák a hátulsó területen reprezentálódnak. 5. ábra: A macska elsődleges hallókérge (AI) és asszociációs szomatoszenzoros kérge (area 7). A) Sematikus ábra mutatja a macska agyát oldalról. AI: elsődleges hallókéreg, AII: másodlagos hallókéreg, 7a: anterior area 7, 7p: posterior area 7. B) Az általunk vizsgált macska agya fixált állapotban, nyilak mutatják az elektródok bemeneti nyílásait. C) NeuN neuronális markerre festett metszet ugyanezen agyból, az area 7-be bemenő elektróda nyoma jól látható. Nagy nagyítású képek mutatják az elektródák elhelyezkedését. A római számok az agykéreg rétegeit jelzik. 12
A macska hallókérgén az AI area szomszédságában több hallókérgi területet (5A. ábra) különítettek el, amelyek egy része szintén tonotópiásan szervezett, de mind anatómiailag, mind funkcionálisan különböznek az AI területtől. A másodlagos (AII) areát citoarchitektóniai különbségek alapján lehet elkülöníteni az AI-től: az AII kérgének III. rétegében megnő a piramissejtek száma, az V. rétegben pedig nagy piramissejtek jelennek meg. Ezen terület tonotópiás szervezettsége vitatott, de egyre többen találnak frekvenciafüggő reprezentációt. A terület valószínűleg az ingerek feldolgozásának egy, az AI után következő állomása. Megkülönböztetünk emellett elülső (anterior auditory field, AAF), valamint hátulsó hallókérgi mezőket is (posterior auditory field, PAF), melyek szerepe szintén vitatott, de a legtöbb szerző multiszenzoros, asszociációs területként említi őket (Clarey, Irvine 1990; Rouiller, Simm et al. 1991). Ezen areák szintén tonotópiás szerveződést mutatnak, de a mikroelektróddal elvezetett kezdeti sejtaktivitás látenciája hosszabb és időben kevésbé kötött az ingeradás időpontjához, a sejtek hangolási görbéje pedig szélesebb, mint az AI neuronoké. Egyes vizsgálatok arra utalnak, hogy e területek az akusztikus információfeldolgozás későbbi kognitív jellegű szakaszában vesznek részt és talán részben megfeleltethetőek a majmokban talált belt (AAF) ill. parabelt (PAF) régióknak. A különböző területek afferens és efferens kapcsolatait vizsgálva, az AI-ből AII-be futó rostok topográfiás elrendeződést mutatnak. Az AI rosztrális részéből a rostok az AII kaudális, míg kaudális részéből az AII rosztrális részébe futnak. A ventrális AI a ventrális AII-vel, míg a dorzális AI az AII dorzális részével áll kapcsolatban. Az AAF area az AII-ből kapja afferentációjának nagy részét, tonotópiás szervezettségben. A projekciók az AII-ből a PAF-ba ugyancsak tonotópiásan szervezettek. Az AII mellett az AAF is vetít a PAF régióba, mégpedig az AII-ből jövő rostokkal konvergálva tonotópiásan szervezetten, ami e terület integratív szerepére utalhat (Rouiller, Simm et al. 1991). Az agykéreg szerkezete Az agykéreg (neokortex) legnagyobb részét kitevő, ún. isocortex, közönséges sejtfestésű mikroszkópi készítményben is jól felismerhető hat sejtrétegre oszlik (Szentágothai, Réthelyi 1994). A hat réteg felülettől számítva a következő: 13
I. (stratum moleculare): többnyire a piramissejtek csúcsdendritjeit, a II. réteg sejtjeinek dendritjeit, továbbá az ide beérkező afferensek rostjait tartalmazza, sejtekben szegény réteg. II. (stratum granulosum externum): piramissejtek kis számban, interneuronok (kis kosárseltek, csillársejtek) nagy számban találhatók itt. III. (stratum pyramidale externum): nagyszámú piramissejt sejttestét magába foglaló réteg. IV. (stratum granulosum internum): csillagsejtek (stellate) találhatók itt nagy számban, ők fogadják a specifikus thalamusz magvakból befutó afferens rostokat, továbbá nagy kosársejteket találunk itt. V. (stratum gangliosum): tartalmazza a jellegzetes nagyméretű óriás piramissejteket. VI. (stratum multiforme): sokféle idegsejtet tartalmaz, ezek zömében az I. rétegbe vetítő másodlagos kapcsoló interneuronok. A 6. ábra - leegyszerűsített formában - az agykéreg általános neuron hálózatát mutatja be (Szentágothai, Réthelyi 1994). A kérgi idegsejtek csupán 60%-a piramissejt (principális sejt), a fennmaradó 40% más típusú (kb. 50 fajta), jobbára helyi kapcsolatokkal rendelkező idegsejtből (interneuron) áll. Az ábrán piros színnel feltűntetett sejtek a piramissejtek. A piramissejtek, jellegzetes háromszög alakjuknak és egyes kéregterületeken belül feltűnően nagy méretüknek köszönhetően jól felismerhetőek a szövettani metszeteken. Ezek a principális sejtek megtalálhatók a II. és III., illetve V. és VI. rétegekben. Glutamáterg, serkentő neuronokról van szó, melyek a beérkező információt vetítik a környező kéregterületekre, illetve kéreg alatti rendszerekbe. Szintén glutamáterg, serkentő neuronok a csillagsejtek, amelyeket a régebbi szakirodalom még az interneuronok közé sorol. A csillagsejtek a kéreg IV. rétegében találhatók, és nagyon fontos állomásai az adott területre beérkező információknak. A thalamusz felől érkező bemenetek tulajdonképpen csak a csillagsejteken keresztül jutnak el a piramissejtekhez. Ezek a sejtek, a piramissejtekkel ellentétben, csupán lokális információ átadására alkalmasak. Interneuronok alatt ma elsősorban a GABA-erg (gamma-amino-vajsav), gátló neuronokat értjük. A gátló kérgi sejtek számos típusát tudták eddig meghatározni (a 6. ábrán tömör fekete szín). A kéreg minden rétegében jelen vannak, multipoláris sejtek, sűrű hálózatot képeznek a principális idegsejtek körül. Ezek közül már régebben ismertek voltak az ún. kosársejtek (basket sejtek), amelyek a végződéseikkel kosárszerűen fonják körül a 14
piramissejtek testeit, axo-szomatikus kapcsolatot kiépítve. Innen származik az elnevezés. Jellegzetes gátló idegsejt az axo-axonikus, vagy más néven csillársejt. Ez utóbbi név onnan ered, hogy a sejtek idegnyúlványának végei - sejtenként 150-200 végág - a régi mennyezeti csillárok gyertyájához hasonlóan egy pontból kanyarodnak vissza. Végágaik hozzákapcsolódnak egy-egy piramissejt axonjának kezdeti szakaszához, és ott sorozatos gátló szinapszisokat képeznek. Ez a gátlásnak igen hatásos mechanizmusa, ezért fontos megemlíteni, hogy a kéreg minden piramissejtje bőségesen el van látva ilyen végződésekkel. Ezek a sejtek a principális sejtek kimenetének szabályozásában játszanak fontos szerepet. A dendritikus gátlósejtek a piramissejtek dendritjeit idegzik be, így a piramissejtek bemenetét szabályozzák. Interneuron-specifikus interneuronok (gátlás gátlását okozó interneuronok, GGS) kizárólag interneuronokat idegeznek be, így szabályozva az interneuron hálózat működését. 6. ábra: A kérgi modul szerkezete. Sematikus ábra mutatja a neokortex szerkezetét. A zölddel jelzett nem specifikus kérgi afferensek jelölik ki a mintegy 200-300 m átmérőjű, a kéreg egész mélységén áthatoló, henger alakú szövetteret, amely a kéreg alapvető szerkezeti modulja. Kék színűek a IV. rétegbe érkező specifikus thalamikus afferensek, amelyek a csillagsejtekre (stellate=tüskés közti neuron=tkn), valamint a piros színnel jelzett piramissejtekre adnak szinapszist. A gátló interneuronok feketével vannak jelölve. Ezek közül ki vannak emelve a kosársejtek, az axo-axonikus sejtek, illetve a gátlás gátlását okozó interneuronok (GGS). 15
A kérgi területek (mezők, areák) felépítése Az agykéreg egyes területei feltűnően eltérő szerkezetűek (Szentágothai, Réthelyi 1994). A motoros kéregterületek (emberben Brodmann 4.) szinte kizárólag piramis- és óriás piramissejtekből állnak, (agranuláris kéreg). Hasonló szerkezetű az előtte lévő, lefelé keskenyedő háromszög alakú Brodmann 6. mező, mely ugyancsak agranuláris, de óriás piramissejtek nélkül. Épp ellentétes irányban térnek el a szokványos motoros kéregre jellemző felépítéstől az elsődleges érző projekciók kérgi területei. Ezekre éppen fordítva, a nagyobb piramissejtek csaknem teljes hiánya és az apró sejtek óriási számbeli túlsúlya jellemző. E kéregtípust ezért granulárisnak, vagy koniokortexnek nevezik. Ilyen típusú a gyrus postcentralis-t elfoglaló testérző (szomatoszenzoros) area, amely három, egymással nagyjából párhuzamos, némileg eltérő szerkezetű mezőből (Brodmann 3., 1., 2.) áll. Hasonló szerkezetű a nyakszirti lebeny fissura calcarina-jának felső és alsó ajkát elfoglaló elsődleges (Brodmann 17.), másodlagos (Brodmann 18.) és harmadlagos látómező (Brodmann 19.) és a temporális lebenynek az insula felé tekintő harántgyrusaiban helyet foglaló hallómező (Brodmann 41., 42.). A kérgi modul A neokortex nemcsak horizontálisan szerveződik rétegekbe, hanem vertikálisan is működési egységekbe, modulokba rendeződnek a sejtek. Ez a 0,2-0,3 mm átmérőjű, függőleges és a kéreg egész mélységén áthatoló, henger alakú szövettér a kéreg alapvető szerkezeti egysége, modulja (6. ábra). Egy-egy ilyen kérgi modul mintegy 5000-10000 idegsejtet tartalmaz. Az agykérget tehát úgy kell elképzelnünk, mint vertikálisan szerveződő működési egységek, modulok mozaikját, amelyek mindegyike aktívan kommunikál egymással (Szentágothai, Réthelyi 1994). Hozzávetőlegesen 50-100, az agykéreg más részében (mind az azonos, mind az ellenoldali agyféltekében) elhelyezkedő másik, hasonló modullal létesít összeköttetést, vezérli azokat, effektor, vagyis efferens (piramissejt axonokból álló) kapcsolatokat tart fenn. Körülbelül ugyanennyi kérgi modulból kap odavezető érzékelő, affektor, vagyis afferens rostkapcsolatot. Ezek azonban a kérget csak működésében 16
szabdalják szét, az idegnyúlványaikkal és dendritekkel összefonódó idegsejtek szövete csak nagyon kivételesen mutat megszakításokat, tehát az agykéreg a szövettani képében eléggé feltűnő hatrétegű elrendezésen kívül egyneműnek látszik. Csupán a kérgi mezők határán vehetők észre a rétegződés finomabb részleteiben megbúvó, jellegzetes változások. A működési egység, a modul gondolata onnan ered, hogy az agykéreg meghatározott részeinek kísérleti állatban való műtéti eltávolítása után az agykéreg aránylag távoli részében az elpusztított piramissejtek nyúlványainak szövettanilag kimutatható elfajulása függőleges oszlopokban, foltszerűen mutatkozik, jelezvén, hogy a kéreg távoli részei közötti összeköttetések nem szétszórtan, hanem néhány meghatározott oszlopszerű modulban végződnek. Újabban ezt ma már úgy mutatják ki, hogy olyan jelzőanyagokat fecskendeznek be a kéreg alig 0.1-0.15 mm átmérőjű gócaiba, amelyeket a piramissejtek felvesznek, és idegnyúlványaikkal pár nap alatt elszállítják végződési helyükre. Itt a jelzőanyagokat vagy biokémiai, vagy autoradiográfiai módszerekkel lehet szövettanilag kimutatni. Az interneuronok viselkedésének behatóbb tanulmányozása is közelebb vitt a kérgi modulok működésének megismeréséhez. Megfigyelések szerint bizonyos kérgi területeken, a thalamusz felől érkező inputok a piramissejtek egy csoportját serkentik, majd a tüzelő piramissejtek a körülöttük lévő régió gátlósejtjeit hozzák izgalomba az axon-kollaterálisok segítségével, melyek lezárják az információ útját a környező piramissejtek felé. Ezzel tulajdonképpen lokalizálják az információ áramlását és feldolgozását. Miért van szükség ilyen összetett mechanizmusra? Mi történne, ha nem így működne a rendszer? A thalamokortikális afferenseken érkező ingerület szétterjedne a megcélzott sejtek mellett a környező kéregrész nagy területén, így a benne rejlő információ, illetve az arra adott specifikus válasz elveszne a káoszban. Az EEG jelek keletkezésének mechanizmusa Az electroencephalogram (EEG) jelek keletkezésének mechanizmusa a mai napig pontosan nem ismert (Kandel 2000). Valószínű, hogy több ezer neuron összesített elektromos aktivitását tükrözi, melyek az agykéreg felszínének közelében helyezkednek el. A mélyebb struktúrák aktivitása a szignál gyengülése miatt nem idézhet elő a fejbőrről elvezethető mikrovoltos nagyságú jelet. Tekintettel az EEG fokozatos jellegű változásaira, inkább a piramissejtek dendritnyúlványain lejátszódó küszöb alatti posztszinaptikus 17
potenciálváltozások felelősek keletkezéséért, semmint a gyors, minden vagy semmi jellegű akciós potenciálok. A klasszikus elképzelés szerint az EEG-jel generálásában számos neuron kiterjedt dendritfáinak szinkronizált, összesített aktivitása játszik szerepet. Ezeket a több neuronhoz tartozó, de együttműködő kapcsolatokat nevezték szinaptikus funkcionális egységeknek. Az agy spontán ritmusának megfelelő, és az adott ingerek függvényében számos átfedést mutató funkcionális egység közül más és más csoportok mutathatnak szinkronizált aktivitást. Ez a mintázat időben dinamikusan változik. A szinaptikus funkcionális egységek koordinációjában fontos szerepet tölthetnek be a kéreg alatti struktúrák, elsősorban a thalamusz. 7. ábra: Az EEG jelek keletkezése. A nagyagykéregben a piramissejtek párhuzamosan, ún. openfield elrendeződésben helyezkednek el, aktivitásukkal egy elektromos dipólust hoznak létre. Az agytörzsben a sejtek véletlenszerű orientációt mutatnak, így az extracelluláris áramok kioltják egymást. A szinkronizált elektromos aktivitáson felül fontos az agyi struktúrák geometriai konfigurációja is. Az EEG-jel kialakulásának feltétele ugyanis, hogy a sok kis lokális elektromos változás felerősítse egymást. Az egymással párhuzamosan elhelyezkedő kérgi piramissejtek transzmembrán áramai ideálisan képesek összeadódni, ezt nevezzük nyitott, vagy open-field elrendeződésnek. A neuronok véletlenszerű orientációja esetén az áramok kioltják, vagy nagyon lecsökkentik a jel erősségét. Ezt zárt, vagy closed-field elrendeződésnek nevezzük. Míg az agykéreg szerveződésére az open-field, addig az egyes mélyebben elhelyezkedő agytörzsi struktúrákra a closed-field organizáció a jellemző (7. ábra). Az EEG jelet frekvencia és amplitúdóbeli különbségek alapján spektrális tartományokra osztjuk fel (1. táblázat). A klasszikus nevezéktan szerint, ha a nagyobb amplitúdójú és kisebb frekvenciájú hullámot egy kisebb amplitúdójú és nagyobb frekvenciájú váltja fel, deszinkronizációról beszélünk. Ennek a folyamatnak az ellenkezője a szinkronizáció. 18
1. táblázat: Az EEG jelek speciális tartományai. Spektrum Frekvencia Amplitúdó Jelentőség (Hz) (mikrov) Delta 0,5-3,5 100-200 - mély alvás - 1-2 éves korban fiziológiás - tumor, ér eredetű károsodás - frontális lebenyhez köthető kognitív feladatok Theta 4-7,5 <30 - REM alvás - 1-6 éves korban fiziológiás - hipnózis és meditáció - frontális lebenyhez köthető kognitív feladatok - hippocampuszhoz kapcsolódó memória folyamatok Alfa 8-12 30-50 - az agy alapritmusa - stimuláció hatására nagyfrekvenciájú ritmus váltja fel (alfablokk) - az információfeldolgozás általános időbeli koordinációja - thalamokortikális kapcsolatok mutatója Béta 13-30 <20 - szenzoros és emócionális behatások - akaratlagosan blokkolható Gamma 30-50 <10 - neuronális elemek koaktivációja (szinkronizációja), amely a tudatos információfeldolgozás alapja lehet - ingerek alkomponenseinek (pl. forma és mozgás) összekapcsolása (binding) Az akusztikus eseményhez-kötött potenciál Az eseményhez-kötött potenciálok (EKP) olyan agyi potenciálváltozásokat tükröznek, amelyek valamely esemény (pl. mozgás indítása), vagy különböző természetű szenzoros ingerek (pl. hang, fény, tapintás) hatására az eseménynek, vagy ingernek megfelelő agyi struktúrákban keletkeznek (8. ábra). A szenzoros EKP kategóriában az inger modalitásának megfelelően beszélünk akusztikus, vizuális, szomatoszenzoros, olfaktórikus, gusztatórikus, vesztibuláris és fájdalom kiváltotta eseményhez-kötött potenciálokról. A klasszikus értelmezés szerint az EKP-k fő jellemzője, hogy a hátterükben álló neuronális aktivitás a kiváltó ingerrel szigorú időkapcsolatban áll. Ez tulajdonképpen abból adódik, hogy az EKP-k EEG-ből való kinyeréséhez átlagolást használunk, ezért azon komponensek, melyek időben nem szigorúan kötöttek a kiváltó inger adásának időpontjához, véletlenszerűek, ezért kiátlagolódnak a válaszból (Karmos, Molnar et al. 1986). Az EKP-k egymást követő pozitív és negatív polaritású kitérésekből, hullámokból állnak (8. ábra). Az EKP-k hullámai, akárcsak a spontán EEG-hullámok, idegsejt populációkon létrejövő excitátoros (serkentő) és inhibitoros (gátló) posztszinaptikus potenciálok (EPSP, IPSP) szummációjaként jönnek létre, és a keletkezés helyéről volumen 19
vezetéssel terjednek a környező szövetekre (Molnar, Karmos et al. 1986). A konkrét generátorfolyamathoz köthető hullámokat komponensnek nevezzük. Az EKP-k különböző komponenseit funkcionális jellemzőik alapján exogén és endogén komponensekre oszthatjuk. Az exogén komponensek amplitúdója és látenciája főleg az inger fizikai paramétereitől függ, míg az endogén komponensek inkább kognitív folyamatokkal mutatnak összefüggést. A komponensek fenti felosztása részben látenciában elkülönülő csoportokra bontja az akusztikus EKP hullámait. Az egymást követő EKP komponensek látenciái hűen tükrözik az agyi információ feldolgozás időbeli viszonyait. Egy EKP komponenst háromféle módon lehet jellemezni: a komponens amplitúdója, látenciája és formája (konfigurációja), a komponens funkcionális jellemzése (kapcsolata különböző fizikai, illetve kognitív faktorokkal), valamint a komponens topográfiája, keletkezési helye szerint. 8. ábra: Az akusztikus eseményhez kötött potenciál (EKP) főbb korai komponensei macskában. P1a és P1b pozitív (itt lefelé) komponensek ~12 illetve 25ms után jelentkeznek, amelyeket egy nagy negatív N1 (50ms, itt felfelé), majd ismét egy pozitív P2 (~85ms) komponens követ. Az EKP komponensei A legkorábbi EKP komponens a humán hallókéregben körülbelül 20ms latenciával jelentkezik kis amplitúdóval, melyet nagyobb amplitúdójú, középlatenciájú (20-40ms) komponensek (auditory middle latency responses) követnek. Az emberben végzett nem invazív vizsgálatok (skalp potenciál-eloszlás térképezés, dipól lokalizáció) arra utalnak, hogy ezek a komponensek tonotópiás szervezettséget mutatnak, és specifikus szenzoros területeken keletkeznek (AI, AII). Az N1 és P2 hullámokat (melyek látenciája általában 100 ill. 200ms), ugyancsak az exogén komponensek közé sorolják, bár úgy tűnik nem-specifikus endogén (nem az inger fizikai tulajdonságaitól függő) tényezők is befolyásolják e komponensek látenciáját és amplitúdóját. Részletesebben az N1 hullámot vizsgálták. A hanginger amplitúdójának kellőképpen rövid növekedési ill. csökkenési ideje esetén az N1 mindig 20
kiváltódik az inger kezdetére és az inger végére, vagy egy folyamatos ingerben bekövetkező változás hatására is. Az N1 hullám egyik fontos jellemzője, hogy kifejezetten érzékeny az ingerlés gyakoriságára: az ingerek közti időintervallum (interstimulus interval, ISI) csökkentésével e hullám amplitúdója szisztematikusan csökken. Az N1 hullám az inger intenzitására szintén érzékeny: az ingerintenzitás csökkentésével csökken az amplitúdója és növekszik a latenciája. Generátorát illetően nincs egyetértés a szerzők közt, legfeljebb abban, hogy valószínűleg több generátor vesz részt a komponens létrehozásában. A kérgen belüli invazív vizsgálatokkal igazolható, hogy a macska (Karmos, Molnar et al. 1986) és a majom hallókérgében (Shah, Bressler et al. 2004) hanginger adását követően legkorábban az AI areában mutatható ki sejtaktivitás (sejttüzelés) 8-12 ms látenciával. Ezután az aktivitás átterjed az AII-re, ahol legkorábban 4-8 ms késéssel, 16 ms körül mutatható ki sejttüzelés. Ezt a 16 ms-os sejtkisülési csúcsot egy harmadik követi a 16-32 ms-os időtartományban, mely akárcsak a 16 ms látenciájú mindkét területen detektálható (Karmos, Molnar et al. 1986). Ennek a három időben és térben is elkülönülő sejtaktivitásnak a mezőpotenciál korrelátuma három pozitív hullám, melyek átlagosan 12, 17 és 23ms-os csúccsal, a humán korai és középlatenciájú komponenseknek felelhetnek meg. Ezek a komponensek a hallókéreg primer AI és szekunder AII areája felett regisztrálhatók maximális amplitúdóval, és tonotópiás eloszlást mutatnak. A kísérleti állatokon 50 ms körüli amplitúdó maximummal jelentkező hullám valószínűleg a humán N1-nek felelhet meg. A kísérleti állatokon 100 ms körül regisztrálható hullám valószínűleg ugyanúgy vegyes komponens, mint a humán N1 és P2 komponensek. Ezek látenciáját és amplitúdóját mind az inger fizikai jellemzői, mind kognitív tényezők mint például a figyelem, alvási állapot befolyásolják. 21
KUTATÁSI CÉLJAINK Napjainkban kimutatták, hogy a lassú oszcilláció kérgi eredetének elmélete, valamint a thalamikus kapuzási hipotézis patkányokon nem helytálló. Laboratóriumunkban macskán és majmon folynak akusztikus-szenzoros ingerlési tanulmányok, melyek célja, hogy közelebb kerüljünk az emberi ingerfeldolgozás pontosabb megértéséhez. Mind a macska, mind a majom akusztikus rendszere bizonyos modellekben jól reprodukálja az emberi hallókéreg viselkedését. Ezt a kísérletes hátteret kihasználva vizsgáltam majmon és macskán az akusztikus ingerek hatását a lassú kérgi oszcillációra. Majmon elsődlegesen az akusztikus kérget, mellette a szekunder szomatoszenzoros és szomatoszenzoros asszociációs kérget céloztuk meg, macskán pedig szintén az akusztikus kérget, mellette a suprasylvian asszociációs területet. Feltételezéseink szerint evolúciósan nem kifizetődő, ha az akusztikus ingerek már thalamikus szinten kapuzás alá kerülnek. A túléléshez fontos akusztikus diszkriminációkat (vízcsepp koppanása az avaron, összevetve a ragadozó lába alatt megroppant faág hangjával) az agy nem tudja thalamikus szinten megtenni. Így vagy állandóan felébred az állat, és súlyos alvásmegvonási szindrómában elpusztul, vagy zsákmánnyá válik. Hipotéziseink szerint léteznie kell egy árnyaltabb inger feldolgozási stratégiának, mely lassú hullámú alvásban is beengedi kérgi szintre az akusztikus információt, hogy ott a túléléshez minimálisan szükséges feldolgozás lehetővé váljon. Ennek a feltételezett stratégiának illeszkednie kell a mély alvás alatti fiziológiai körülményekhez, vagyis a lassú oszcilláció fázisaihoz. Biztosítania kell továbbá a megfelelő alvásmennyiséget (alvásvédő hatás), másrészt meg kell teremtenie az ébredéshez a megfelelő inger feldolgozási feltételeket (ébresztő hatás). Mint az előzőekben írtam, mély alvásban az agy aktív és inaktív állapotok között oszcillál. A down-state alatt megfigyelt kérgi hiperpolarizáció nem teremt különösen jó feltételeket a kérgi inger feldolgozáshoz, mivel a neuronok kevéssé ingerelhető állapotban vannak. Ennek ellenkezője igaz az up-statre. Hipotézisünk szerint az ébresztő és alvásvédő hatásokat a lassú oszcilláció aktív, illetve inaktív állapota közvetítheti. Az aktív fázisában, mely hasonló az ébrenléthez, van ingerfeldolgozás, ez lehet felelős az ébresztő hatásokért. Az inaktív fázis, melyben az ingerfeldolgozás gátolt, lehet felelős az alvásvédő hatásokért. A hallás fontos ébresztő modalitás, ellentétben a látással és a tapintással. Alvásban az állatok aktív tapintása és látása a fizikai immobilizáció, illetve a zárt szemhéjak miatt nem 22
működik. Az akusztikus kéreg kapcsolatban áll több asszociációs, multiszenzoros területtel. Ezek az asszociációs területek felelősek a speciális modalitások jeleinek integrációjáért. Feltételezéseink szerint az alvás alatt beérkezett akusztikus bemenet feldolgozása hatásosabb lehet, ha mind az akusztikus kéreg, mind az asszociációs területek az aktív fázisban vannak. Ebben az esetben nagyobb eséllyel és árnyaltabban dolgozható fel az információ. Dolgozatomban az akusztikus ingerlés hatására, a lassú alvási oszcillációban bekövetkező változásokat vizsgáltam rétegelektródos elvezetésekben majom és macska hallókérgén, valamint szomatoszenzoros, szomatoszenzoros asszociációs és multiszenzoros kéregterületén. A ketamin-xylazin narkózis jó modellje a lassú hullámú alvásnak, ezért választottuk ezt az altatószert, továbbá azért, mert a kísérleteket sztereotaxiás keretben végeztük, ahol a nem altatott kísérleti állatok fokozott diszkomfortnak vannak kitéve, és nagyon nehezen alszanak el. 23
MÓDSZEREK Műtéti technika, akut majom implantáció Az akut (egyszeri implantációs) kísérletekhez használt rhesus majmokat (M. mulatta) erre a célra tenyészti az MTA Pszichológiai Kutatóintézete. A kísérletek a Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszerellenőrző Állomás jóváhagyásával történtek. A műtét steril körülmények között zajlott. Az altatás bevezető szakaszában az állatok 10 mg/kg ketamint kaptak im., az altatás megfelelő mélységének fenntartására 25 mg/kg ketamin, 5 mg/kg xylazin iv. adagolása szolgált. A műtét alatt melegítőpárna tartotta 37-38 ºC-on az állat hőmérsékletét. A keringés, légzés, testhőmérséklet monitorozása folyamatos volt az altatás alatt. Az állatok feje a külső hallójárat elülső szakaszába vezetett fém sztereotaxiás készülék segítségével lett rögzítve. A kraniotómiát követően, a dura mater eltávolítása után előtűnt a sulcus intraparietalis és a gyrus temporalis dorsalis superior. A szabaddá vált agyfelszínt meg kellett védeni a kiszáradástól, e célból egy vékony szilikonolaj réteggel fedtük be a műtéti területet. Az agyfelszínről készített fotót összevetve a rhesus majom sztereotaxiás agyi atlaszával, meghatároztuk az elektródák penetrációjának pontos koordinátáit az érhálózat segítségével. Az elektródák behelyezése közben próbafelvételeket készítettünk, melynek célja a megcélzott agyi struktúra minél pontosabb eltalálása volt. Az adott területre jellemző agyi aktivitás segítségével állapítottuk meg a beszúrás pontosságát. A kísérletek végeztével az állatot szíven keresztül paraformaldehiddel perfundáltuk, az agyat kiemeltük, lemetszettük, festettük és az elektróda szúrt csatornáját rekonstruáltuk (Hackett, Karmos et al. 2005). Macska implantáció, krónikus kísérletek A kísérletekhez használt macskák a Szegedi Egyetemtől kifejezetten erre a célra tenyésztett állatok közül származtak, a kísérletek a Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszerellenőrző Állomás jóváhagyásával történtek. A kísérleti macskáknál krónikusan beültethető (1-12 hónap) implantátumokat használtunk (9. ábra). Az altatáshoz Nembutalt (40mg/kg ip.) használtunk. Az állatok a műtétet követően posztoperatív antibiotikumos 24
kezelésben (Cobactan), és fájdalomcsillapításban részesültek. Az operáció ideje alatt a testhőmérsékletet melegítőpárna segítségével tartottuk 37-38 ºC-on. 9. ábra: Macska krónikus implantátuma. A kísérlet közben készült felvételen fehér nyíl mutatja az egycsatornás drótelektródák csatlakozóját, a rétegelektróda vezetőcsövét és előerősítőjét, valamint az állat homlokának középvonalában elhelyezett, kalibrált csontvezetőt. A csatlakozó, előerősítő és a csontvezető csak a kísérletek idejére van felhelyezve az implantátumra. Légzésmonitorral követtük nyomon a respirációt. A macska sztereotaxiás agyi atlasza (Snieder, Niemer, 1961) segítségével meghatároztuk az elektródák kívánt pozícióját, majd sztereotaxiás készülék segítségével krónikusan implantáltuk azokat az állat agyszövetébe. Az agyba kerülő elektródákon kívül a szemmozgás (EOG), illetve az izomtónus (EMG) monitorozására alkalmas makroelektródákat is behelyeztünk. (Karmos, Molnar et al. 1982) Az elektródák megfelelő agyi struktúrába való behelyezéséhez a műtét alatt monitoroztuk az adott agyi terület aktivitását. Az elvezetett jeleket kiértékeltük, majd meghatároztuk, hogy a keresett agyi területre jellemző sejttevékenységet látjuk-e. Az elektródák elhelyezése után, azokat akriláttal rögzítettük a koponyacsonthoz. A műtétet követően két hetet lábadozott az állat, ezután kezdhettük meg a kísérleteket. Az altatásos kísérletek során egy állaton összesen 3-4 alkalommal végeztünk ketaminxylazin (25 mg/kg ketamin, 5 mg/kg xylazin iv.) narkózist. A kísérletek végeztével az állatot szíven keresztül paraformaldehiddel perfundáltuk, az agyat kiemeltük, lemetszettük, festettük és az elektróda szúrt csatornáját rekonstruáltuk. 25
Elektródok Az MTA Pszichológiai Kutatóintézetében folytatott kísérletek során két típusú szövetbarát elektródát használtunk fel: Rétegelektróda: 24 elevezetési kontaktus található rajta, az egyes kontaktusok között 0.1 mm távolság van. Az elektróda vastagsága 0.35 mm, benne 24 polyimid szigetelt platina-irídium drót fut, amelyek egyenként 0.025 mm vastagságúak, ezek átmetszett része adja az elvezetési kontaktust. A rétegelektróda a 10. ábrán látható. Az 11. ábrán a térbeli elhelyezkedését mutatjuk be (Ulbert, Halgren et al. 2001). 10. ábra: A rétegelektróda. Drót elektróda: 0.23 mm átmérőjű szigetelt acélszálból készült nagyobb átmérőjű makroelektródok, melyekkel a kéreg epidurális felszínéről, valamint a hippocampuszból vezetjük el az aktivitást. Az acélszálról 1 mm távolságban lekapart szigetelés adja az elvezető kontaktust. 26
11. ábra: A rétegelektróda térbeli elhelyezkedésének sematikus rajza. Elektrofiziológiai regisztráció Az akut majom kísérletekben csak rétegelektródokat használtunk, míg a krónikus macska kísérletekben mindkét típust alkalmaztuk. Az elektródához csatlakozó előerősítőt a macska fején helyeztük el, illetve a majmok agyába implantált rétegelektródhoz közvetlenül csatlakoztattuk. Az előerősítő illeszti az elektróda magas impedanciáját a további erősítők alacsony impedanciájához, valamint javítja a jel-zaj arányt. Az egység erősítése 10 khz, sávszélessége 0-100 khz, így mind a mezőpotenciálokat, mind az akciós potenciálokat jól detektálhatjuk. Az előerősítő jeleit 2 aktív szűrő (1000-szeres erősítéssel) osztja EEG (0.1 Hz- 500 Hz) és akciós potenciál/soksejt aktivitás (100 Hz - 5 khz, AP/MUA) tartományra. Az erősítő jeleit két szinkronizált AD kártya digitalizálja, az EEG tartományban 16 bites, 2-4 khz mintavétellel, a MUA tartományban 12 bites, 20-40 khz mintavétellel. Egyszerre 48 csatornás mintavételre van lehetőség. Nagy kapacitású és gyors PC-t használunk az adatgyűjtésre és a feldolgozásra (Ulbert, Halgren et al. 2001). 27