DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Témavezető: Dr. Nádasy Miklós C. Sc. Konzulens: Dr. Szőcs Gábor C. Sc. A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG (DASINEURA GLEDITCHIAE OSTEN SACKEN) CSALOGATÓ VISELKEDÉSÉNEK MEGFIGYELÉSE, SZEXFEROMONJÁNAK KIVONÁSA ÉS SZINTETIKUS CSALOGATÓANYAG KIFEJLESZTÉSE A GYAKORLATI ELŐREJELZÉS SZÁMÁRA Készítette: MOLNÁR BÉLA PÉTER KESZTHELY 2011
A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) nőstény és hím rajza (Benedicty Zsuzsa rajza) 1. A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI, CÉLKITŰZÉSEK 1.1. Előzmények A gubacsszúnyogok (Cecidomyiidae), mint kártevők számos kultúrában jelen vannak a mérsékelt övben és a trópusi területeken is. Apró méretük ellenére érzékeny károkat tudnak okozni. Kártételük jelentőségét a generatív növényi részek károsítása adja főként, mely terméskiesés formájában jelentkezik. Kártételük különösen fontos lehet gabonanövényeken a fejlődő országokban (pl. afrikai- és ázsiai rizs-gubacsszúnyog, cirok-gubacsszúnyog). Az imágók rövid élete és a védetten fejlődő lárvák nehezítik a védekezést. A növényvédelmi kezelések pontos időzítése, ezért alapvető fontosságú lenne. A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) Észak-Amerikából behurcolt faj. Monofág. A nőstények a lepényfa (Gleditsia triacanthos L.) hajtáscsúcsaira petéznek és a kikelő lárvák az összetett levél levélkéin okoznak gubacsokat. A lárvák a gubacsban bábozódnak a tenyészidőben, majd az imágók kikelése után a gubacsok elszáradnak, lehullanak, így a hajtás felkopaszodik. A fák díszítő értéke ezáltal csökken és a hajtások fagyérzékennyé válnak (EPPO Reporting 2008). Az észak-amerikában honos lepényfa és fajtái kedvelt dísznövénnyé váltak Európaszerte is. A faj feltehetően szaporítóanyaggal került be Magyarországra és jelentős károkat is okozott lepényfa fasorokon és parkfákon (Ripka, 1996). 2
1.2. Célkitűzések A kártevő kémiai kommunikációjáról nemzetközileg sem volt irodalomi adat. A faj szexferomonja nem volt ismert, pedig növényvédelmi előrejelzéshez felhasználható lenne. Munkám során célul tűztem ki a lepényfa-gubacsszúnyog: csalogató viselkedésének megfigyelését, a párosodási viselkedésének megfigyelését, a párosodás napszaki ritmusának megfigyelését, a szexferomonjának kivonását, a szexferomon komponens(ek) keresése bioszenzoros gázkromatográffal (GC-EAD) ezek és a tömegspektroszkópiás szerkezet meghatározás és a szintézis sikeressége esetén szexferomon csapda kifejlesztését növényvédelmi előrejelzés céljára. 2. ANYAG ÉS MÓSZEREK A lepényfa-gubacsszúnyoggal kapcsolatos vizsgálataimat alapvetően az MTA Növényvédelmi Kutatóintézet, Állattani Osztályán végeztem. Néhány elektrofiziológiai kísérletre a Swedish University of Agricultural Scienses Alnarp, Svédország (SLU) laboratóriumban került sor, ezeket a megfelelő helyen említem meg. 2.1. Kísérleti rovarok kinevelése A vizsgálatokhoz kellő számú imágó kinevelését károsított tápnövényről gyűjtött lombból végeztem. A megfelelő lárvafejlettségnél begyűjtött lombot hengeres üvegpohárba (un. egérpohár, d=15 cm, magasság = 20 cm) szűrőpapírra helyeztem és fehér vászonnal, majd Petri-csészével fedtem le. Hosszúnappalos (18/6 óra, világos/sötét) megvilágítás mellett, 24 C-on tartottam azokat, 8:00-13:00-ig rásegítő világítást is alkalmaztam (500 W Hg lámpa) a nyári napsütést imitálva. A kikelő imágókat, csápmorfológia és a potroh alakulása alapján ivaruk szerint szétválogattam a további vizsgálatokhoz. 2.2. Csalogató viselkedés megfigyelése Megfigyeltem a nőstény lepényfa-gubacsszúnyogok csalogató magatartását és a csalogatás napszaki ritmusát. A szabaföldi megfigyelések mellett laboratóriumban Petri-csészékbe helyezett frissen kelt nőstényeket figyeltem, reggel 7 órától délután 16 óráig. A Petri-csészékbe lepényfa lombot, majd egy-egy nőstényt helyeztem. Minden nőstényhez öt hímet engedtem be és folyamatosan figyeltem a nőstények csalogató és a hímek udvarlási viselkedését és mértem a párosodások időtartamát is. 2.3. Szexferomon kivonat készítés A feromon összegyűjtéséhez a nőstények által kibocsájtott szexferomon légtérből történő visszafogásának módszerét alkalmaztam (un. volatile collection). Az un. closed loop stripping apparatus (CLSA) (Brechbühler, AG, Schlieren, Svájc) készülék segítségével a feromon összegyűjtését zárt rendszerben végeztem. A zárt üvegrendszerben speciális, inert teflonbevonatú pumpa keringette a levegőt és az illatanyagok megkötéséről egy 1,5 mg tömegű aktív szén adszorbens gondoskodott. Az adszorbensen megkötött szexferomon leoldásához n-hexánt használtam, majd az így nyert feromon kivonatokat leforrasztott üvegpipettában 60 C-on tároltam. Több kivonatot is készítettem, melyek, 400 illetve 600 nőstény feromonját tartalmazták, de a legigéretesebb kivonathoz 1800 nőstény szexferomonját gyűjtöttem össze. 3
2.4. Kivonatok biológiai aktívitásának ellenőrzése (EAG és GC-EAD) A kivonatok biológiai aktivitását azaz a szexferomon összegyűjtésének sikerességét elektroantennográffal (EAG, csápdetektor) ellenőriztem. A mikromanipulátorok (MP15, Syntech, Hilversum, Hollandia) 0,5 mm vastag ezüst elektrodjára hím csápot preparáltam fel egy vékonyra húzott (1,17 mm belső átmérő) és Ringer oldattal (Beadle és Ephrussi, 1936) töltött üvegkapilláris közbeiktatásával. A Ringer oldat segítségével életben tartott csápot ingereltem a leoldott feromon kivonatokból készített ingerforrásokkal un. stimulusokkal. Az ingerlés hatására a csápon keletkező ingerület elektromos impulzusként elvezethető az ezüst elektródon keresztül, majd digitalizálva, felerősítve megjeleníthető szoftver segítségével. A stimulusokat 1x1 cm-es szűrőpapír hordozóra mértem rá majd Pastuer-pipettában csúsztattam. Oldószeres (n-hexán) és üres stimulust is tartalmazó stimulus sorozattal ingereltem a felpreparált hím gubacsszúnyog csápokat, kiküszöbölve az esetleges műtermékek, szennyezések zavaró hatását. Az elkészített stimulusokat szűrt, nedvesített légáramba (660 ml/perc) illesztettem, mely a csáp irányába szállította az adott illatanyagot, miután 1 ml levegőt pumpáltam át a Pasteur-pipettán. A kivonatokban a feromon retenciós idejét bioszenzoros gázkromatográf (GC-EAG) segítségével állapítottam meg (Agilent 6890 N GC és Syntech EAG készülék). A gázkromatográfot DB-WAX kapilláris oszloppal (30m x 0,32mm x 0,25µm) splitless injektor módban (220 C) és az alábbi hőmérsékleti programmal üzemeltettem: 60 C 1 percig, 10 C/perccel 220 C-ig, 20 percig 220 C-on tartás). A vivőgáz hélium volt. Belső standardként decenil-acetátot (S10:Ac) alkalmaztam. A műszer csápdetektor része megegyezett a kivonatok biológiai aktívitás vizsgálatánál már ismertetett elektroantennográffal. 2.5. A feromon tömegspekroszkópiás szerkezetmeghatározása (GC-MS) (Natural Resourses Insitute, University of Greenwich, Chatham Maritime, Egyesült Királyság) A kivonatban csápválaszt kiváltó anyag (a feltételezett szexferomon) szerkezetmeghatározását (GC-MS) a retenciós idő és retenciós index ismeretében és a sztereoszelektív szintézisét Prof. David R. Hall végezte el (Natural Resourses Institute, University of Greenwich, NRI). A sztereoszelektív szintézis eredménye nyomán a feromont 99,1%-os, míg az antipódját 99,0% enantiomerikus tisztaságban (enantiomeric excess) sikerült előállítani. 2.6. Szabadföldi csapdázás szintetikus feromonnal A meghatározott szexferomon optikailag aktív, egy királis központtal rendelkezik. A feromonnal és antipódjával illetve a racém eleggyel végeztem csapdázást, amelyeket 20-20 µl hexánnal vittem fel a kibocsátóra. A vizsgálatokhoz átlátszó falú (Csalomon RAG csapda, MTA NKI) 10x16 cm-es cserélhető ragacslapos (Tangle Trap, Tanglefoot Co., Grand Rapids, MI, USA) delta csapdát használtam, gumigyűrű diszpenzerrel (MSZ 9691/6, TAURUS, Budapest). A csapdázások Budapesten, két helyszínen a Várban a Palota sétányon és a Lágymányosi-híd pesti hídfőjénél, lepényfa fasorokban zajlottak. A csapdák 2 méter magasban, a fák lombkoronájában voltak elhelyezve, véletlen blokk elrendezésben, egymástól 10 méterre. Az első csapdázási kísérletben az (R)-, az (S)-enantiomer (10-10 µg) és a racém keverék (20 µg) összehasolítását végeztem. A csapdázást 2007. július 1-3. között végeztem. Egy további csapdázási kísérletben a feltételezett optimális enantiomer arányt a 95:5 R:S vizsgáltam három dózisban (0,3; 1; 3 µg) szemben a tiszta (R)-enantiomerrel. A napi fogási eredményeket log(x+1) szerint transzformáltam és varianciaanalízissel értékeltem, majd Games- Howell post hoc teszttel vizsgáltam (SuperANOVA, Abacus Concepts Inc., CA, USA). 2.7. Y-olfaktométeres kétválasztásos vizsgálatok szintetikus szexferomonnal (SLU) A kétválasztásos Y-olfaktométeres vizsgálatokban, laboratóriumban először összehasonlítottam a tiszta enantiomerek vonzóképességét párosával egymással és n-hexánnal 4
szemben. Minden összehasonlításnál 50-50 hímet vizsgáltam. A hímeket a választásig vagy pedig 3 percig vizsgáltam. Amennyiben ez idő alatt sem választottak az Y-olfaktométer két ága között, akkor azokat nem vettem figyelembe. Következő méréssorozatban a 9:1 enantiomer arányt, a racém keveréket és az (R)-enantiomert vetettem össze páronként. A második mérés során összehasonlításonként 30 hímet vizsgáltam. A kísérleteket reggel 9 órától délig végeztem, 70 % páratartalom és 25 C mellett. Az Y-olfaktométert megvilágítottam, a gubacsszúnyog napszaki ritmusának megfelelően. Statisztikai kiértékeléshez khi-négyzet tesztet használtam. 2.8. A lepényfa-gubacsszúnyog csápjának morfológiai vizsgálata elektronmikroszkóppal (Swedish University of Agricultural Scienses, Department of Chemical Ecology, Alnarp, Svédország) (SLU) Az elektronmikroszkópiás vizsgálatok jó kiindulási alapot jelentettek a későbbi ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről vizsgálatokhoz (SSR), a csáp morfológiai megismerésével. A csápok felpreparálásához az imágókat (három hím és három nőstény) 96%-os etanolban, majd pedig a dehidratáláshoz acetonban tároltam és 1 cm-es alumínium platformra ragasztottam fel. A minták arany:paládiummal (80:20) kerültek bevonásra. A vizsgálatokat JOEL 6500LV pásztázó elektronmikroszkóppal végeztük. A figyelem központjában a sensillum trichodeum és a gubacsszúnyogoknál egyedi sensillum circumfilum kemoszenzillumok állnak mindkét ivarnál. 2.9. Ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről (single sensillum recording, SSR) vizsgálatok (SLU) Ezen vizsgálatokat az SLU Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp, Svédország, Chemical Ecology laboratóriumában végeztem. Az SSR vizsgálatokkal a csáp egyetlen kemoszenzillumáról tudunk információt gyűjteni. Az ingerelt szenzillum akciós potenciál mintázata (tüske mintázat, un. spike) megváltozik a nyugalmi állapothoz képest, ha a szenzillumban receptorral rendelkező illatanyaggal (feromon, növényi illatanyag) stimuláljuk. A mérésekhez a gubacsszúnyogot tárgylemezre rögzítettem. A vizsgálatokat penetrációs SSR módszerrel végeztem. Elektródként wolfram szálat (0,125 mm) használtam, melyet elektrolitikusan, telített KNO 2 oldattal kihegyeztem. Egyik elektródot földelésként a torba szúrtam mikromanipulátorok segítségével. A felvételező elektródot piezoelektromos mikromanipulátor (DC-3K, Märzhäuser, Németország) segítségével 200x-os nagyítás alatt (Olympus BX51W1) a csáp egy kiválasztott szenzillumának alapi részébe szúrtam. A csáp első négy csápszegmensén található s. trichodeum és s. circumfilum kemoszenzillákat vizsgáltam. Sikeres kapcsolat esetén a szenzillumot a feromon és antipódja 0,1; 1; 10 µg-os dózisával töltött stimulusokkal ingereltem. A kiváltott akciós potenciált, mint elektromos impulzust az elektródok segítségével elvezettem és IDAC-4 interface segítségével digitalizáltam, felerősítettem és az Autospike32 (Syntech, Hilversum, Hollandia) szoftver segítségével, számítógépen elemeztem. 2.10. Szabadföldi felvételezések és feromoncsapdás vizsgálatok Svédországban (SLU) Dél-Svédországban, Skåne tartományban parkokban, fasorokban vizuálisan felvételeztem a lepényfa állományokat, lepényfa-gubacsszúnyogot kártételét keresve. A fejlesztés alatt álló feromoncsapdával szabadföldi csapdázást is végeztem megerősítendő a vizuális megfigyeléseket (2008. június-november). 3. EREDMÉNYEK 3.1. Csalogató viselkedés és annak napszaki ritmusa Mind a szabadföldi, mind a laboratóriumi megfigyelések azt mutatták, hogy a lepényfagubacsszúnyog nőstények előszeretettel helyezkednek el a lepényfa hajtáscsúcsokon és itt veszik fel a csalogató testtartást a reggeli óráktól. Megfigyeléseim szerint, a tojócsővüket kitolva 5
mozdulatlanul, reggel 8 órától a déli órákig csalogatják a hímeket. A délután folyamán csalogató viselkedést már nem tapasztaltam. Egy nősténynek egy időben több hím is udvarolt. A laboratóriumi Petri-csészés vizsgálatok alapján a párzás átlagosan 19,6 ± 1,7 másodpercig tartott (N = 25). 3.2. A feromonkivonatok elektroantennográfiás vizsgálata (EAG és GC-EAD) Az elkészített feromonkivonatok biológiailag aktívnak bizonyultak az elektroantennográfiás (EAG) vizsgálatok során. A kivonatok szignifikánsan nagyobb válaszokat váltottak ki a preparált hím lepényfa-gubacsszúnyog csápján, mint az oldószeres és a levegő stimulus. Az 1800 szűz nőstényből készült 10 nőstény-egyenértékű (female equivalent, FE) kivonatára a csáp, átlagosan 0,250 mv ± 0,016 mv, míg a hexánra mindössze 0,043 mv ± 0,004 mv-os választ adott (P<0,05). A levegő kontroll az alapvonaltól alig különbözött (0,003 mv ± 0,011 mv). A bioszenzoros gázkromatográfiás vizsgálatok (GC-EAD) során több ismétlésben a kivonat egy anyaga bizonyult elektroantennográfiásan aktívnak a hím csáp számára. A feltételezett szexferomon retenciós ideje RT: 14,84 min volt (1. ábra). A szintetikus referencia vegyületek injektálásával, azok retenciós ideje alapján (S10:Ac 8,80 min, S14:Ac 12,99 min, Z11-14:Ac 14,87 min) az elektroantennográfiásan aktív anyag retenciós indexe RI: 1597-nek adódott. A kivonat GC-EAD-vel vizsgált mennyiségében a feltételezett feromon mennyisége 2,8 ng volt. 1. ábra. A hím lepényfa-gubacsszúnyog EAG válasza fajtárs nőstény feromon kivonatára, bioszenzoros gázkromatográffal. A csáp a 10 nőstény-egyenértékű (female equivalent, FE) kivonat aktív komponensére, a feltételezett feromon 2,8 ng-nyi mennyiségére válaszol 14,84 percnél. 3.3. Kémiai szerkezetmeghatározás (GC-MS) A kémiai szerkezetmeghatározást és szintézist David R. Hall professzor végezte (Natural Resources Insitute, University of Greenwich). A szerkezetmeghatározás alapján a feltételezett szexferomon a (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén (Z8-17:2Ac) volt. A vegyületnek van egy királis központja, azaz két egymásnak tükörképi (optikai) izomerje, un. enantiomerje létezik. Professzor David R. Hall enantiomerszelektív módon szintetikusan előállította az (R)-enantiomert 99,1%-os tisztaságban, míg az (S)-enantiomert 99,0%-os tisztaságban. 6
3.4. A szintetikus szexferomon és antipódjának elektroantennográfiás vizsgálata Az enatiomerek biológiai aktívitását vizsgálva azt találtam, hogy az (R)-enatiomer mind a három dózisban (0,3; 1; 3; 10 ng) szignifikánssan nagyobb elektroantennográfiás választ váltott ki hím lepényfa-gubacsszúnyog csápján, mint a hexán (P < 0,05). Az (S)-enantiomer ezzel szemben csak a 3 ng-os dózisban mutatott különbséget a hexántól (P < 0,05). A racém keverék 3 és 10 ng-os dózisban nagyobb választ váltott ki, mint az (S)-enantiomer (P < 0,05). A vizsgálatok tehát azt mutatták, hogy a hímek csápja az (R)-enantimerrel ingerelhető. 3.5. Szabadföldi csapdázás a sztereoszelektíven előállított szexferomonnal és antipódjával Az első szabadföldi csapdázási kísérlet során a racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecénnel illetve az (R)- és (S)-enantiomerekkel csalétkezett csapdák eltérő számban csalogatták a lepényfagubacsszúnyog hímeket (F 3,24 = 101,2; P= 0,001). Az (R)-enantiomerrel csalétkezett csapdák sokkal több hím lepényfa-gubacsszúnyogot csalogatott, mint a racém csapdák (P < 0,05). Az antipód (S)- enantiomerrel csalétkezett csapdák csak elenyészően kis számban fogtak hímeket. Számszerűleg 34-szer kevesebb hímet csalogattak, mint a racém csapdák, viszont szignifikánsan többet a kontroll csapdáknál (P < 0,05). Az első szabadföldi vizsgálatok alkalmával bebizonyosodott, hogy az (R)- enantiomer a keresett feromon, amely rendkívűl erős vonzóképességel rendelkezik a faj hímjei számára (1. táblázat). 1. táblázat: Átlagos napi csapdafogási adatok hím lepényfa-gubacsszúnyoggal, (R)- az (S)- enantiomer és a racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecénnel csalétkezett csapdákból (7 ismétlés, Budapest, Lágymányosi-híd pesti hídfő, 2007. július 1-3). Feromon komponens Dózis (µg) Átlagos napi fogás (db) ± standard hiba (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén 10 223,0 ± 44,2 a (2S,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén 10 2,4 ± 0,9 c Racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén 20 81,0 ± 17,4 b Kontroll - 0,7 ± 0,5 c Fogott hímek száma összesen: 2147 db A következő csapdázási kísérlet mindhárom dózisában (0,3; 1; 3 µg) a racém keverékkel csalétkezett csapdák vonzották a legkisebb számban a lepényfa-gubacsszúnyog hímeket. 7
2. ábra. Szabadföldi csapdázás: A tiszta (R)-enantiomer, a racém keverék és a 95:5 R:S enantiomer arányú elegy vonzóképességének összehasonlítása, három dózisban (0,3; 1; 3 µg) 7 ismétlésben (Budapest, Lágymányosi-híd, pesti hídfő, 2008. július 3-13). Mindhárom dózisban a 95:5 R:S enantiomer arányú csalétkek vonzották számszerűen a legtöbb hímet (68,8; 90,7; 126,8 db/nap/csapda). A fogásokat összehasonlítva az (R)-enantiomeres csapdákkal, a fogások közel kétszeresek voltak, de az adatok nagy szórása miatt egyik dózisban sem különböztek szignifikánsan (37,4; 50,4; 68,7 db/nap/csapda). Mind a három kezelésnél megfigyelhető a dózishatás, a növekvő dózisok, növekvő számú fogásokkal párosulnak (2. ábra). 3.6. Y-olfaktométeres vizsgálatok A hexán-hexán összehasonlítás során nem mutatkozott szignifikáns különbség (χ 2 =0,6; p<0,5) az olfaktométer két ágát választó hímek száma között, azaz a kísérlet módszertani hibát nem hordozott magában. A (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén enantiomerjei és a hexán összehasonlításában a vizsgált dózisok mindegyikében azonos tendencia mutatkozott. Az (R)-enantiomer szignifikánsan több hímet vonzott, szemben az (S)-enantiomerrel, amely utóbbi nem különbözött szignifikánsan a hexántól. A két enantiomer vonatkozásában mind a három dózisban az (R)-enantiomer bizonyult szignifikánsan vonzóbbnak az (S)-enantiomerrel szemben. A következő kísérletben 9:1 R:S enantiomer arány szignifikánssan több hímet vonzott, mint a racém keverék sőt még az (R)-enantiomernél is többet (2. táblázat). 8
2. táblázat: A kétválasztásos Y-olfaktométeres vizsgálatok eredményei. Összehasonlítva az (R)- és (S)-enantiomert egymással és az oldószeres kontrollal három dózisban (1, 10, 100 ng). Dózis (ng) 1 10 100 Kezelés 1 / Kezelés 2 Khinégyzet (vonzott hímek száma) Szig. R 34 hex 11 χ 2 =0,068 szig. (5%) S 24 hex 21 χ 2 =0,178 n. s. R 31 S 15 χ 2 =9,78 szig. (0,01%) R 34 hex 10 χ 2 =24,04 szig. (0,01%) S 23 hex 21 χ 2 =0,045 n. s. R 23 S 11 χ 2 =7,12 szig. (0,01%) R 31 hex 9 χ 2 =22,05 szig. (0,01%) S 20 hex 20 χ 2 =0 n. s. R 35 S 12 χ 2 =20,59 szig. (0,01%) 3.7. Elektronmikroszkópos vizsgálatok Mind a hím, mind pedig a nőstény csápja 12-12 csápízből, szubszegmensből épül fel, melyek két alapi csápízzel a csáptőízzel (scapus) és csápcsuklóízzel (pedicellus) kapcsolódnak a fejhez. A hímek csápjai hosszabbak körülbelül 0,7 mm ± 0,03 mm, a nőstények csápjához képest 0,51 mm ± 0,04 mm (n=5). A csápízek mindkét nemnél kerekdedek, a hímeknél a csápízek egy karcsúbb, hengeres szubszegmens résszel csatlakoznak egymáshoz, így mintegy nyelet alkotva minden kerekded szubszegmens között. Ez az oka, hogy a hím szúnyogok csápja hosszabb a nőstényekénél. A hímek csápízei hozzávetőlegesen 71 µm ± 1,4 µm (n=10) hosszúak, ennek körülbelül az egyharmadát teszi ki a nyeles csápíz rész. A nőstények csápízei átlagosan 50,4 µm ± 1,02 µm (n=10) hosszúak. A csápízeken sikerült megfigyelni három kemoszenzilla típust, a sensillum circumfillum-ot, a sensillum trichodeum-ot, és a sensillum coeloconicum-ot. A s.circumfillum morfológiai megjelenésében ivari dimorfizmus figyelhető meg. továbbá két mechanoreceptor érzékszőrt a sensillum cheaticum-ot és a terminális érző csapot (terminal sensory peg). 3.8. Ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről (SSR) vizsgálatok A sensillum trichoideum szaglószőrnél először megfigyeltem a spontán aktívitás mintázatát. Két eltérő amplitudójú tüske (spike) mintázat arra utal, hogy a szenzillumot legalább kettő szagló receptor neuronról idegzi be. Az s. trichoideum-ot ingerelve az (R)-enantiomer emelkedő dózisával (0,1; 1; 10 µg), dózisfüggő tüskemintázat választ figyeletem meg. Az (R)-enantiomert összehasonlítva az oldószeres kontrollal, szignifikánsan nagyobb választ váltott ki az ingerelt szenzillumból minden dózisban. Azonban az (S)-enantiomer és az oldószer vonatkozásában egyik dózisban sem tapasztaltam szignifikáns különbséget. 3.9. A lepényfa-gubacsszúnyog új európai előfordulása és egy új természetes ellensége A lepényfa-gubacsszúnyogot és a kártételét is sikerült megtalálnom 2007-ben vizuális felvételezés alapján Alnarpban az SLU Swedish University of Agricultural Sciences arborétumában G. triacanthos Shademaster és Sunburst fajtákon, illetve a G. triacanthos tövises alapfajon. 2008-ban további két városban Malmöben és Lundban is találtam kártételt. Az ekkor még fejlesztés alatt álló feromoncsapdával nyomon is követtem a lepényfa-gubacsszúnyog rajzásmenetét az alnarpi arborétumban. A lepényfa-gubacsszúnyogot korábban Svédországban még nem találták meg, így a faj a svéd faunára nézve új fajként került elő. A vizuális megfigyelések során figyeltem 9
meg továbbá egy fitofág poloskafajt (Pinalithus cervinus Herrich-Schäffer), melynek imágói a lepényfa-gubacsszúnyog lárvák által indukált gubacsokat szívogatták. A szívogatás következtében a gubacsok elszáradtak és bennük a lárvák elpusztultak. 4. Az eredmények gyakorlati felhasználása 4.1. Feromoncsapda Növényvédelmi előrejzésre alkalmas, racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecénnel csalétkezett feromoncsapdát fejlesztettem ki, mely a 2010-es évtől szolgálja a kártevő előrejelzését a Csalomon csapdacsalád új tagjaként. 4.2. Egy új természetes ellenség Alnarpban, Svédországban tövises lepényfán (G. triacanthos L.) és a Sunburst fajtán találtam egy polifág poloskafajt (Pinalithus cervinus), melynek imágói a lepényfa-gubacsszúnyog gubacsokat szívogatták. Ennek következtében a gubacsok elszáradtak és bennük a lárvák elpusztultak. Ily módon a fitofág poloska közvetve, csökkentette táplálkozásával a kártevő gubacsszúnyog nyári nemzedékeinek egyedszámát. Annak ellenére, hogy ezt a poloskafajt Magyarországon még nem találták meg, biológiai védekezési ágensként történő esetleges felhasználását érdemes lenne vizsgálni. 10
4. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1) Leírtam a lepényfa-gubacsszúnyog csalogató viselkedését és annak napszaki ritmusát. Az imágók csak a reggeli és a kora délelőtti órákban aktívak, ekkor párosodnak. A párosodás időtartama átlagosan 19,6 ± 1,7 mp (N = 25) volt. 2) Zárt rendszerű légtérből történő visszafogás módszerével (CLSA) sikeresen összegyűjtöttem a nőstények feromonját. A legnagyobb készített kivonat 1800 frissen kelt, szűz nőstény lepényfagubacsszúnyog által kibocsájtott feromont tartalmazott. 3) Elektroantennográffal (EAG) kimutattam a feromonkivonat biológiai aktivitását. 4) Bioszenzoros gázkromatográfiával (GC-EAD) rámutattam a kivonat egyetlen elektrofiziológiailag aktív anyagára és megállapítottam annak retenciós idejét (RT: 14,84 min). Ezen vizsgálatok alapján tömegspektroszkópiás szerkezetmeghatározással a feromon kémiai szerkezete azonosításra került. A meghatározott szexferomon a (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén (a Z8-17:2Ac (R)-enantiomerje). 5) Elektroantennográffal ellenőriztem a szintetikus feromon a Z8-17:2Ac (R)-enantiomerje, és annak antipódja (2S,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén (a Z8-17:2Ac (S)-enantiomerje) és a racém keverék biológiai aktivitását. Megállapítottam hím lepényfa-gubacsszúnyog csápokon, hogy a kiváltott EAD válasz az (S)-enantiomer esetében gyakorlatilag nem különbözött a hexántól, míg az (R)-enantiomer 3 és 10 ng-os dózisban szignifikánsan nagyobb válaszokat váltott ki. 6) Csapdázással igazoltam, hogy a Z8-17:2Ac (R)-enantiomerje szabadföldön is aktív és szignifikánsan több hímet fog, mint a racém keverék. Antipódja az (S)-enantiomer önmagában gyakorlatilag hatástalan bizonyult. A 95:5 R:S enantiomer aránnyal csapdázva, a fogások számszerűen kétszeresen felülmúlták az (R)-enantiomer fogásait, de a különbségek nem bizonyultak szignifikánsnak. Gyakorlati felhasználás szempontjából a szintetikus úton könnyebben előállítható racém keverék megfelelő biztonsággal használható a lepényfa-gubacsszúnyog előrejelzéséhez. 7) Y-olfaktométeres, kétválasztásos vizsgálatokkal kimutattam, hogy a 9:1 R:S enantiomer arány vonzóképességében felülmúlja a racémkeverék, de még a tiszta (R)-enantiomer vonzóképességét is. Az (S)-enantiomer önmagában viszont gyakorlatilag hatástalannak mutatkozott. 8) Az ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről (SSR) vizsgálatokkal kimutattam, hogy a sensillum trichodeum szaglószőrök tarlamazzák a hím csápon az (R)-enantiomer receptorait, az (S)- enantiomer a vizsgált dózisokban nem mutatott szignifikáns különbséget az oldószertől. 9) Elsőként találtam meg a lepényfa-gubacsszúnyogot Dél-Svédországban. A kártevő a svéd faunára nézve új faj. 10) Svédországban, Alnarpban, a tövises lepényfán (G. triacanthos L.) és a Sunburst fajtán megtaláltam egy polifág poloskafaj (Pinalithus cervinus) imágóit, melyek a lepényfagubacsszúnyog lárvák által indukált gubacsokat szívogatták. A gubacsok így elszáradtak és lárvák bennük elpusztultak. A fitofág poloska közvetve csökkentette táplálkozásával, a kártevő nyári nemzedékeinek egyedszámát. Az idézett irodalmak listáját lásd a doktori értekezésben. 11
5. MEGJELENT TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK 5.1. Az értekezés témakörében megjelent angol nyelvű cikkek Molnár, B., Zs. Kárpáti, G. Szőcs, D.R. Hall (2009): Identification of female-produced sex pheromone of the honey locust gall midge, Dasineura gleditchiae. Journal of Chemical Ecology 35:706-714. IP: 2.411 Molnár, B., T. Boddum, G. Szőcs, Y. Hillbur (2008): Occurrence of two ornamental pest gall midges, Obolodiplosis robiniae (Heldman) and Dasineura gleditchiae (Osten Sacken) (Diptera: Cecidomyiidae) in Sweden. Entomologisk Tidskrift 130:113-120. 5.2. Az értekezés témakörében megjelent magyar nyelvű cikkek Molnár, B.P., Szőcs G., David R. Hall (2010): A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) (Diptera: Cecidomyiidae) szexferomonja: izolálás, kémiai meghatározás és szabadföldi csapdázás. Növényvédelem 46(3): 101-108. 5.3. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó előadások, poszterek angol nyelven (abstract) Molnár, B., T. Boddum, G. Szőcs, Y. Hillbur (2010): New faunistic records of the honey locust gall midge, by newly developed pheromone traps. IXth European Congress of Entomology 22-27. Aug. 2010. Budapest, Hungary p. 234. Molnár, B., Hillbur, Y., Hall, D.R., Szőcs, G. (2009): New perspectives in monitoring gall midges in urban areas: Development of an optimized trap bait for the honey locust gall midge, based on the chiral sex pheromone components. Semio-chemicals without borders Joint conference of the pheromone group of IOBC WPRS/EPRS 15-20. Nov. 2009. Budapest, Hungary p. 54-55. Molnár, B.P., Kárpáti, Zs., Szőcs, G., Hall, D.R. (2007): Identification of the Female Sex Pheromone of the Locust Bean Midge, Dasineura gleditchiae (Dipera: Cecidomyiidae). 23rd International Society of Chemical Ecology, Jena, Germany, Book of Abstract p. 241. 5.4. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó előadások, poszterek magyar nyelven (abstract) Molnár B.P., Y. Hillbur, Szőcs G., David R. Hall (2009): Enantiomer-specifikus receptorok és - viselkedési válasz: Mi a szerepe a lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae) feromon komponenseinek? 55. Növényvédelmi Tudományos Napok, Agrozoológiai Szekció, Budapest 55:4. Molnár B.P., Y. Hillbur, Szőcs G., David R. Hall (2009): Faunára új gubacsszúnyogok Svédországban: Adaptálható lesz-e a feromoncsapdás előrejzés? XIX. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely, 19:117-118. Molnár B.P., Szőcs G., David R. Hall (2008): A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae) párosodási viselkedésének megfigyelése és szexferomonjának meghatározása. 54. Növényvédelmi Tudományos Napok, Agrozoológiai Szekció, Budapest, 54:10. 12
5.5. Egyéb tudományos cikkek angol nyelven Z. Kárpáti, B. Molnár, G. Szőcs (2007): Pheromone titer and mating frequency of E- and Z-strains of the european corn borer Ostrinia nubilalis: Fluctuation during scotophase and age dependence. Acta Phytopathol. et Entomol. Hung. 42(1): 331-341. 5.6. Egyéb tudományos területhez kapcsolódó előadások poszterek angol nyelven (abstract) Kamata, N., Tuda, M., Naka, H., Mori, K., Molnár, B.P., Szőcs, G. 2007. Leucoma candida males attracted to the same stereoisomer of leucomalure in Japan, as L. salicis males in Hungary. 23rd Interantional Society of Chemical Ecology, Jena, Germany, Book of Abstract p. 237. Zs. Kárpáti, B. Molnár, G. Szőcs (2006): Pheromone titer and mating frequency of E- and Z-strains of the European corn borer, Ostrinia nubilais: Fluctuation during scotophase, and age dependence 8th. European Conference of Entomology 17-22. Sept. 2006, Izmir, Turkey. 5.7. Egyéb tudományos területhez kapcsolódó előadások poszterek magyar nyelven (abstract) Molnár, B.P., Sallai P., Balázs K., Pintér E., Fekete Z., Mihályi K., Szentesi Á., Szőcs G., E. Hummel (2007): Egy botanikai peszticid a NeemAzal T/S hatása alma és meggy kártevőire: Laboratóriumi- és szabadföldi kísérletek három rovarrend képviselőivel. 53. Növényvédelmi Tudományos Napok, Agrozoológiai Szekció, Budapest, 53:11. Molnár, B.P., Sallai P., Balázs K., Pintér E., Fekete Z., Mihályi K., Szőcs G., E. Hummel (2006): Egy botanikai peszticid, a NeemAzal T/s szabadföldi alkalmazása Lombosfa-fehérmoly (Leucoptera malifoliella) ellen, bio-alma ültetvényben, 52. Növényvédelmi Tudományos Napok, Agrozoológiai Szekció, Budapest, 52:16. Kárpáti Zs., Szőcs, G., Molnár B. (2006): Egy elfelejtett tápnövény, a vadkomló (Humulus lupulus L.) illatanyagainak elektrofiziológiás és viselkedési hatása a kukoricamoly (Ostrinia nubilalis Hbn.) nőstényeire. 52. Növényvédelmi Tudományos Napok, Agrozoológiai Szekció, Budapest, 52:22. Szőcs G., Molnár B.P., Balázs K., Jenser G., Sallai P., Fekete Z., Hummel, E. (2006): Egyes gyümölcskártevők elleni biológiai védekezés hatékony eszköze a NeemAzal-T/S. Kutatási nap Újfehértón c. rendezvény, Újfehértó. Molnár B.P., Sallai, P., Balázs, K., Pintér, E., Fekete, Z., Mihályi, K., Szőcs, G., Kerényiné Nemestóthy K., E. Hummel (2005): Díszfáktól az ültetvényekig: Újabb eredmények egy botanikai peszticid, a NeemAzal T/S szabadföldi alkalmazására, 13. Fővárosi Közterületek Növény- és Talajvédelme c. konferencia, Budapest. 5.8. Ismeretterjesztő cikkek, előadások Molnár B.P., Szőcs G. (2011): Csapdában a lepényfa-gubacsszúnyog. Kertészet és Szőlészet 60(17):22-23. Molnár B.P., Szőcs G. (2010): Miért kellene feromoncsapda a szemzésrontó-gubacsszúnyog előrejelzéséhez? Kocsis Kertészet II. Szakmai Nap, Szeged-Szőreg. Molnár B. P., Sallai P., Balázs K., Pintér E., Fekete Z., Mihályi K., Szőcs G., E. Hummel (2006): Egyes gyümölcskártevők elleni biológiai védekezés hatékony eszköze a NeemAzal T/S készítmény, 13
Magyar Gyümölcsfaiskolások Országos Egyesülete szakmai továbbképzése, Gyula. Molnár B.P., Szentesi Á., Szőcs G., Kerényiné dr. Nemestóthy K., Demeter T., Dobrádi L. (2006): A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae) életmódja: melyik mozzanat nyújt alkalmat a növényvédelmi beavatkozásra? 14. Főváros Közterületek Növény-és Talajvédelme c. konferencia, Budapest. Szőcs G. Molnár B. P., Balázs K., Jenser G., Sallai P. Fekete Z. és Hummel, E. (2006): Kutatási nap Újfehértón c. rendezvény, Egyes gyümölcskártevők elleni biológiai védekezés hatékony eszköze a NeemAzal-T/S; Újfehértó. Molnár, B.P., Sallai, P., Balázs, K., Pintér, E., Fekete, Z.,Mihályi, K., Szőcs, G., Kerényiné Nemestóthy K., E. Hummel (2005): Díszfáktól az ültetvényekig: Újabb eredmények egy botanikai peszticid, a NeemAzal T/S szabadföldi alkalmazására, 13. Fővárosi Közterületek Növény- és Talajvédelme c. konferencia Budapest. Szőcs G., Molnár B.P., Kenji Mori (2005): Tükröm-tükröm, melyik az én feromonom? Tükörszimmetria és a nyárfa-gyapjaslepke, Leucoma salicis feromon-molekulája Magyar Rovartani Társaság 739. ülése, Budapest. 14