Fermentációs biotechnológia Dr. Kutasi, József

Fermentációs biotechnológia Dr. Kutasi, József

Fermentációs biotechnológia Dr. Kutasi, József

Tartalom Előszó... vi 1. Fermentációs technológiák általában... 1 1. Bevezetés... 1 2. Törzsek izolálása, screening... 1 3. A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás... 10 3.1. Törzsfenntartás... 11 4. Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások... 18 4.1. Fermentációs eljárások... 18 4.2. Nyersanyagok... 22 4.3. Fermentációs fokozatok (Scale-up)... 25 2. Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek... 38 1. Aminosavak... 38 1.1. Nátrium-glutamát... 38 1.2. L-Lizin... 39 1.3. L-triptofán... 41 2. Enzimek... 41 2.1. Fehérjebontó enzimek, proteázok, peptidázok... 41 2.2. Keményítőbontó poliszacharidázok és oligoszacharidázok... 45 2.2.1. Izocukor előállítás... 48 2.3. Pektinázok és lipázok... 48 2.4. NSP (nem keményítő típusú) enzimek... 49 2.5. Enzimek a takarmányozásban... 50 3. Vitaminok... 52 3.1. B 12 vitamin (ciano-kobalamin)... 52 3.1.1. Előállítása... 55 3.2. B 2 vitamin (Riboflavin)... 56 3.3. Karotinoidok... 58 3.4. A C-vitamin (L-aszkorbinsav) és az E-vitamin (alfa-tokoferol) bioszintetikus előállítása 60 3.5. Az új szuper E-vitamin: az astaxanthin... 61 3.5.1. Felhasználása a takarmányozásban... 63 3.5.2. Humán felhasználása... 63 4. Antibiotikumok... 64 4.1. Béta-laktám antibiotikumok... 64 4.2. Penicillinek... 64 4.3. Cefalosporinok... 67 4.4. A klavulánsav... 69 4.5. Aminosav és peptid antibiotikumok... 69 4.6. Glükozidok, amino-glükozidok, cukorszármazékok... 70 4.7. Makrociklusos-lakton-antibiotikumok... 73 4.8. Tetraciklinek és antraciklinek... 74 4.9. Aromás antibiotikumok... 74 4.10. Antibiotikus citosztatikumok... 75 4.10.1. Kromopeptid antibiotikumok... 75 4.10.2. Antraciklinek... 76 4.10.3. Immunomodulátorok... 76 4.11. Takarmány és növényvédelmi antibiotikumok... 76 5. Anyarozs alkaloidok... 77 5.1. Előfordulásuk, jelentőségük... 77 5.2. Szaprofita Claviceps törzsek fermentációs tenyésztése... 78 6. Szerves savak... 78 6.1. Almasav... 79 6.1.1. Citrát kör-alapú termeltetés... 79 6.1.2. Reduktív citrát kör-alapú termeltetés... 81 6.1.3. Immobilizált élesztősejtek fermentációja... 82 6.2. Citromsav... 83 iii

Fermentációs biotechnológia 6.2.1. Eljárások... 84 6.3. Itakonsav... 87 6.4. Ecetsav... 87 6.5. Tejsav... 88 6.5.1. Élelmiszeripari fermentációval előállított tejsavas erjesztésű termékek... 90 3. Speciális fermentációs termékek és eljárások... 91 1. Egysejt fehérjék(scp)... 91 1.1. Gombák és baktériumok SCP-i... 91 1.1.1. A Saccharomyces cerevisiae élesztők, mint takarmány- és élelmiszer-kiegészítők 93 2. Egysejt olajok... 96 2.1. Az esszenciális SCO olajok élettani hatásai a humán szervezetre és jelentőségük. 96 2.2. Az esszenciális olajok előfordulása... 97 2.3. A politelítetlen zsírsavak (PUFA egysejtolajok) bioszintézise mikroszervezetekben. 100 2.4. EPS és DHS forrás egysejtolaj termelő algák fejlesztése... 103 2.5. A politelítetlen esszenciális ω-3 zsírsavak nagy tömegű felhasználása takarmányadalékként... 104 3. Rekombináns génmódosított termékek... 105 3.1. Gyógyászati célú termékek rekombinációs előállítása... 109 4. Immunológiai termékek... 112 4.1. Az emlőssejtek speciális tenyésztése... 112 4.1.1. A monoklonális ellenanyag termelés... 113 5. Koleszterinszint csökkentő mevinin savak... 116 6. Növényi és emlős növekedési hormonok... 116 7. Biológiailag lebomló poliszacharid műanyagok... 116 8. Élelmiszeripari termékek rekombinációja (pl. Almasav előállítás)... 117 9. Bioenergia előállítás rekombináns módszerekkel... 117 4. Bioenergia források... 118 1. Biogáz termelés... 118 1.1. Biogáz alapanyagok... 118 1.2. Metántermelés... 121 2. Bioetanol előállítás... 121 2.1. Az etanoltermelés bioszintézise... 122 2.2. Bioetanol gyártás gabonából vagy melaszból... 122 2.3. Bioetanol gyártás növényi rostokból és faipari hulladékokból... 122 5. Galéria... 125 6. Videótár... 165 7. Szószedet... 168 iv

A táblázatok listája 2.1. A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994)... 50 2.2. A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994)... 51 3.1. Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998)... 97 3.2. Mikroalgák zsírsav- és EPA összetétele rázott lombikos kultúrában néhány halfajjal összehasonlítva (KYLE és GLADUE 1989)... 99 3.3. Jól szaporodó algák biomasszája és lipidtartalma (YANGMANITCHAI és WARD 1989)... 100 3.4. Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998)... 116 7.1. Szószedet... 168 v

Előszó A biotechnológia forradalmát az utóbbi négy évtizedben emlegetik és valóban, azóta tömegméretűvé vált alkalmazása a laboratóriumokban és az iparban. A mikroorganizmusokkal való fermentációs munka az élelmiszeripar számos ágában, a gyógyszeripar egyes igen fontos területein és a vegyipar bizonyos ágaiban is alapvető technológiai folyamattá vált. Ugyanakkor az iskolai tankönyvek még mindig mostohán kezelik, sőt nem is tárgyalják e tudományt, pedig ma már megállapítható, hogy az alapvető kémiai, fizikai, biológiai ismeretek mellett a 21. század új önálló tudományágának tekinthetjük. Mindezek miatt a hétköznapi ember egyre értetlenebbül áll a különböző biotechnológiai folyamatok és termékek előtt. Pedig a biotechnológia nem új, az alkoholos erjesztést (sör és borgyártás), a kenyér kelesztését, az aludttej előállítását, a pálinkaerjesztést, a szalámi vagy sajtok penészedését már ősidők óta alkalmazzák és ismerik. A fermentációs biotechnológia tudományos hátterét először az antibiotikumok termelése teremtette meg. Létrejött a fermentációs ipar, és kb. az 1960-as évektől magas színvonalúvá fejlődve már géntechnológiai termékeket is előállít. A géntechnológia természetesen nem azonos a biotechnológiával - ez előzőekből jól látható -, csak annak egy fontos ága, szelete. A biotechnológia a mikrobiológia, genetika, növénytermesztés, élelmiszeripar és biokémia integrálása annak céljából, hogy a mikroszervezeteket ipari célra hasznosítsák. Ennek a könyvnek az a célja, hogy példákkal illusztrálva megismertesse, miként lehet fermentálni és így előállítani biotechnológiai termékeket, valamint mind a középiskolások mind az egyetemeken tanulók számára hasznos biotechnológiai ismereteket nyújtson. Igaz, nincs benne minden, ami a diákok általános tudásához szükséges, ugyanakkor tanulni lehet belőle, ezért tankönyvnek nevezhető. Jó olvasást! vi

1. fejezet - Fermentációs technológiák általában 1. Bevezetés A fermentáció olyan technológiai folyamat, amelynek során a jelen levő élő mikroorganizmusok szaporodásának, életfolyamataik és enzimjeik hatására bonyolult biokémiai változások mennek végbe az alapanyagokban. E folyamatot jellemzően baktériumok és/vagy gombák kivételes esetekben algák, növényi eukarióta sejtek esetleg emlőssejtek - használatával végzik, és szénhidrátok lebontása során primer, illetve szekunder metabolitokat (anyagcseretermékeket) állítanak elő, vagy biokonverzióval értékes anyagokat alakítanak át. Tipikus fermentációs termékek az aminosavak, enzimek, vitaminok, antibiotikumok(pl. penicillinek, sztreptomicinek, tetraciklinek, stb.), konvertált szteroidok (biotranszformáció) és rekombináns fehérjék (pl. r-inzulin, r-kalcitonin, stb.). Természetesen termékek lehetnek önmagukban is a baktériumok és gombák (biomassza), vagy általuk előállított fehérjék és olajok (pl. probiotikumok, egysejt-fehérjék és olajok). A mikrobákkal való gyártás alapvető művelete tehát a mikrobák elszaporítása. A technológia fő szempontjai a következők: a kívánt anyagot (fehérjét, molekulát, enzimet stb.) termelő mikrobafajt megtaláljuk (felfedezés), izoláljuk és azonosítjuk, majd ezekből a megfelelően termelő mikrobatörzset kiválasztjuk (screening). A kiválasztott törzsek tenyésztési körülményeit megállapítjuk, végül üzemi körülmények között (scale-up) a fejlesztett mikroorganizmus adott pl. metabolit előállítását optimalizáljuk és a fermentációs léből (fermentlé) vagy magából a mikrobasejtekből ezt az anyagot kinyerjük. 2. Törzsek izolálása, screening A tulajdonképpeni biotechnológiának, mint önálló tudománynak a megjelenésérol a penicillin előállításának, mint az első antibiotikummal kapcsolatban kidolgozott steril technikának és az izolált törzsek nemesítésének és kezelésének kidolgozásától beszélhetünk. Sir Alexander Fleming még a laboratóriumába véletlenül bejutott penészgombából izolálta és fedezte fel a kórokozókat pusztító penicillint. Amerikai kollégái már feltételezve, hogy más penésztörzsek nagyobb mennyiségben is képesek lehetnek penicillin előállításra klasszikus értelemben biotechnológiai szűrést végezve választották ki a világ első ipari gyártásba vont nagy koncentrációban penicillint előállító Penicillium chrysogenium gombatörzset. 1

Fermentációs technológiák általában Tisztatenyészet előállítása és az izolátum azonosítása Steril mikroszkópos minta(natív) készítés steril boxban. Ezek a vizsgálatok minimálisan a mikrobák százaira vagy akár ezreire is kiterjed egy egy program esetén. Ezért steril oltószoba, lamináris boksz (oltófülke) 2

Fermentációs technológiák általában Függőleges levegőáramlású oltóhely. A készülék a felül elhelyezett HEPA szűrőlamellákon keresztül steril csíramentes levegőt fúj a munkaasztalra, így a levegőben előforduló fertőző csírák nem veszélyeztetik a mikrobiológiai munkát. UV germicid lámpákkal, autoklávok, certoklávok (speciális kuktafazekak), 3

Fermentációs technológiák általában A certokláv felfűtés alatt. A nyomásmérő 0,5 bar túlnyomáson van. A certoklávon nyomásmérő, hőmérő, biztonsági szelep, gőzkiengedő nyílás(fekete) és reteszes zár található.nagybetűs többnyelvű felirat figyelmeztet a forró felületre. 4

Fermentációs technológiák általában Nagyobb edények, fermentorok sterilzésre a vízköpenyes autoklávok alkalmasak. Működésük elve azonos a certoklávokkal, a különbség hogy a telített nagynyomású gőz a készülék köpenyében képződik. Az óriás autokláv felső részén találhatók a nyomás és hőmérők, párosával, külön-külön mérve a belső tér és a köpeny hőmérséklete és nyomása. 5

Fermentációs technológiák általában Az újabb típusu autoklávok reteszes-karos (kék színű borítás)zárószerkezettel vannak ellátva a nehézkes 10-15 óriás csavar helyett.a biztos működést a készülék oldalán nyomásmérő automata biztosítja, amely 1,2 atm túlnyomáson tartja a steilezési idő alatt belső tér nyomását. 6

Fermentációs technológiák általában A hőlégsterilező ajtaján felül az analóg hőmérő, az ajtó mellett az fél automatika időzítő szerkezet látható. inkubátorok (aerob, anaerob és szén-dioxid termosztátok), homogenizátor, steril üveg és műanyag eszközök (Petri-csészék, pipetták), 7

Fermentációs technológiák általában A gamma sugárzással sterilezett műanyag petricsészék ma már széles körben elterjedtek. Leforrasztott zacskókban forgalmazzák, speciális már kiöntött agar táptalajjal együtt is. Képünkön a laboraratóriumban steril boxban már kiöntött és megdermett agar táptalajt tartalmazó steril petriszészéket látunk. A gamma sugárzással sterilezett 1, 5, 10, 25 ml-es pipetták már széles körben elterjedtek. Hátrányuk, előnyük is:egyszer használatosak, ugyanakkor garantáltan sterilek.leforrasztott zacskókban egyenként vagy tízesével húszasával csomagolják. mérlegek, ph mérő, 8

Fermentációs technológiák általában Üvegpipettákat bádogdobozban vagy nátronpapírban (sterilezési hőt elviseli, illetve a nedvességre nem foszlik) sterilezhetünk. Vortex kémcsőkeverő, kémcsőforgató, körkörös kitérésű malomszita- vagy síkrázógép és mikroszkóp, 9

Fermentációs technológiák általában A biotechnológiai munkákhoz elengedhetetlen a nagy nagyítású fáziskontraszt feltétű mikroszkóp (400x, 650, 800x, 1000x-os), így könnyen megkülönböztethetők és vizsgálhatók a baktériumok, mivel testük átlátszatlan és fekete, Továbbá az életképességi és pl. spórafestési vizsgálatokhoz fluoreszcens festékkel jelölve a mikroorganizmusokat, különböző hullámhossszúságú gerjesztő fénnyel megvilágítva fluoreszcencia alapján jellemzhetők. A fáziskontraszt feltét tárcsája (középen )biztosítja a megfelelő élességet a különböző naygításokhoz, alul a baktériumokat átvilágító lámpa kimenő nyílása látható. valamint megfelelő mikrobiológiai és analitikai vegyszerek szükségesek a munkák kivitelezéséhez. Természetesen csak steril eszközökkel és steril környezetben lehetséges a mikroorganizmusokkal való munka! (Az 1.- 15. kép, mozgó bemutatja ezeket az eszközöket pl. lamináris boksz működését). A mikroba izolálás lehetséges közvetlenül vagy dúsítással a környezeti elemből (pl. talaj, víz, növénybelső). A talajból közvetlenül készítünk szuszpenziót, homogenizáljuk és agarlemezen szélesztéssel vizsgáljuk, vagy több lépés után a mintából több nap után feldúsuló mikroorganizmusokat szélesztjük. A szélesztés során különböző agar tartalmú táptalajokat kell alkalmazni a minta jellegétől és a kívánt organizmus fajtájától függően. A célvegyület termelési képességén túl, fontos, hogy fermentációra kiválasztott törzs ne legyen patogén, ne termeljen toxikus anyagokat, és a törzs legyen élettanilag állandó, azaz a változékonysága minimális. 3. A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás 10

Fermentációs technológiák általában Mikroorganizmusok izolálása talajból, screening és kinyerés sematikus ábrája. A vadtípusú törzsek sohasem szintetizálnak nagy mennyiségben a kérdéses vegyületből, ezért célzottan nemesíteni szükséges őket. A fermentációs folyamatokban munkára fogott mikroorganizmusok szülőegyede, a vad törzs (wild-type strain) mindig a természetbol izolált. Ezeket a törzseket tovább vizsgálva szelekcióval, esetleg mutánsnyeréssel választják ki, meghatározott vizsgálati szűrő módszerekkel (screening) a keresett metabolitot, enzimet, stb. termelő mikroorganizmusokat Ez lehetséges tisztán szelekcióval csak a legjobban termelő altörzsek kiválasztásával vagy mutációs, illetve ha máshogy nem lehetséges, rekombinációs technikával. A mikroorganizmusok genetikailag könnyen manipulálható szervezetek. A mikrobiológiai gyakorlatban jól ismert klasszikus mutációs technikákkal (pl. nitrozo-guanidinnel, etil-metil-szulfonáttal mint mutagén anyaggal való kezelés vagy UV besugárzás) a DNS bázissorrendjének véletlenszerű átalakításával mutáns sejtvonalak állíthatók elő. Enzimatikusan emésztve a baktérium sejtfalat (pl. lizozimmal), olyan protoplaszt tenyészetet hozhatunk létre, amely érzékenyebb a mutációs kezelésekre, másrészt egymással vagy más tenyészet protoplasztsejtjeivel fuzionálva új un. hibrid sejtvonal állítható elő. Sőt, közvetlenül a genetikai állományba beavatkozva - vektorokkal géneket a sejtekbe juttatva, olyan transzformánsokat hozhatunk létre, amelyekben többszörös mennyiségben halmozódnak fel a keresett vegyületek. Továbbá ahhoz, hogy a fermentációs módszer gazdaságos legyen, sokszor olyan nemesített törzsek szükségesek, melyek tenyészthetőségi tulajdonságai jobbak, mint a vad típusú törzsé. A nemesített törzseket, sejtvonalakat legáltalánosabban liofilizálással (fagyasztva szárító), ahol ez nem lehetséges folyékony nitrogénben tartósítják. 3.1. Törzsfenntartás Mikroorganizmusok élő és tiszta tenyészetek formájában történő fenntartására valamennyi mikrobiológusnak szüksége van. Mint ahogy a kémia vagy biokémia is megszünne vegyszerutánpótlás nélkül, úgy a mikrobiológia is erősen függ a tiszta és stabil tenyészetek elérhetőségétől. Legtöbb vegyszerrel ellentétben, melyek könnyen tárolhatók, a mikroba tenyészetek eléggé érzékenyek és fertőződhetnek, változhatnak vagy elpusztulhatnak kellő szakértelem hiányában. A megfelelő törzsfenntartási módszereknek így igen nagy jelentőségük van. A kutatók egy része már a múlt század végén javasolta olyan helyek létrehozását, ahol mikroorganizmusokat tárolnának 11

Fermentációs technológiák általában nagy számban tudományos és egyéb célra. Az 1904- ben alapított Centraalbureau voor Schimmelcultures ( CBS, Baarn, Hollandia) lett az első kisebb centrum, amely élesztő- és fonalasgombákat élő állapotban megőrzött, fenntartott és mások számára is szolgáltatott. A korai gyűjtemények a mezőgazdaság, az erjesztési iparok és a gyógyászat kisebb igényeit elégítették ki. A penicillin felfedezése és iparosítása 1928-1945 között rendkívüli módon megnövelte az ilyen jellegű gyűjtemények jelentőségét. Az ezt követő évtizedekben a gyógyszeripar a biológiailag aktív vegyületek gazdag tárházát találta meg a mikroorganizmusokban. Ezzel párhuzamosan az orvostudomány, a mezőgazdaság, az élelmiszeripar, a környezetvédelem és más területek fejlődése is egyre nagyobb mikroba választékot igényelt. Az 1980-as években a törzsgyűjtemények fejlődésének újabb lökést adott a biotechnológia bázisú fermentációs iparágak azóta is tartó fellendülése. A gyűjteményekben tárolt mikroorganizmusok ugyanis gyakran képezik új termékek vagy új technológiák még ki nem aknázott erőforrásait. Az elterjedtebb törzsfenntartási és konzerválási módszerek az alábbiak: Időszakos átoltás tenyésztő tápközegekre (ferde agaros tenyészet kémcsőben aerob mikrobák esetében ill. szúrt kultúra anaeroboknál). Az átoltott tenyészeteket megfelelő hőmérsékleten inkubáljuk kellő ideig, majd a kifejlett tenyészeteket felhasználásig hűtőszekrényben tároljuk + 4 C-on. Az átoltások gyakorisága az adott mikrobától függ, ez a periódus néhány héttől (baktériumok zöme) 1/2-1 évig (fonalas- és élesztogombák) terjedhet. 12

Fermentációs technológiák általában A Bacillus licheniformis tenyészete 24 óra 30 C-os inkubáció után nő ki ilyen szépen agarferdén. 13

Fermentációs technológiák általában A Thermomyces lanuginosus xilanáz enzimet termelő gombák 10 nap 50 C-os inkubáció után nőnek ki az agar ferdéken és termelnek vörösesbarna színanyagot. A Saccharomyces cerevisiae élesztő tenyészet 48 óra után tejszerű felületet ad az agaron. 14

Fermentációs technológiák általában A ferdéken szépen kinőtt Streptomyces albus tenyészetek jellegzetes grízes felületűek. Ásványolaj alatti tárolás: a ferde agaros tenyészet egészét vagy egy darabját steril ásványolaj alatt tartjuk. A ráöntött olaj gátolja a táptalaj kiszáradását, a beoldódó csekély mennyiségű levegő életben tartja az aerob mikrobákat relatíve hosszabb ideig (max. néhány évig). Fenntartás steril homokban vagy talajban. Elsősorban spórás baktériumok (pl. Bacillus) és sugárgombák (pl. Streptomyces) fenntartásához előnyös. A talaj a mikroba természetes környezetét jelenti. Az alkalmazott talajnak vagy homoknak kellően száraznak kell lennie. Vízmentes szilikagélen történo konzerválás. A kiszárításnak kíméletesnek kell lennie. Liofilezés (fagyasztva-szárítás). A mikroorganizmusban és környezetében lévő víz eltávolítása kíméletes módon történik, alacsony hőmérsékleten (-30-40 C), nagy vákuum mellett. A jégkristályok szublimálásán alapszik tulajdonképpen a módszer. Vivőanyagok (pl. szérum-fehérje) csökkentik a mikrobapusztulást a folyamat alatt. Az ampullában lévő vákuum erősen redukálja a kíméletesen megszárított tenyészet raktározás (tárolás) alatti hőpusztulását. Az eltarthatósági (visszanöveszthetőségi) idő - mikrobától függően - az 5-50 év tartományban van. 15

Fermentációs technológiák általában A fáziskontraszt feltét tárcsája (középen )biztosítja a megfelelő élességet a különböző naygításokhoz, alul a baktériumokat átvilágító lámpa kimenő nyílása látható. 16

Fermentációs technológiák általában Egyszerre sok kópiában, sok ampullában érdemes törzseket liofilizálni, így akár 100 évre is elegendő tenyészet tartósítható. Fagyasztás -50 C-on vákuumban A tenyészetek liózása Mélyhűtéses fagyasztás a -30 - -80 Chőmérséklet tartományban, védőfolyadékok (pl. glicerin, dimetilszulfoxid, cukoralkoholok, fehérjék, stb.) jelenlétében. Jelenleg mechanikus működésű 17

Fermentációs technológiák általában hűtőszekrényekkel már -80 C is biztosítható. Minél alacsonyabb a tárolási hőmérséklet, annál kisebb a mikrobák hőpusztulása. Évekig tárolhatók így a mikrobák. A módszer sebezhetősége: hosszabb áramszünet Tárolás folyékony nitrogénben (-196 C). Évtizedekig-évszázadokig tárolható így a mikroorganizmusok zöme. A párolgási veszteségek pótlásáról gondoskodni kell. Védőfolyadékok u.a. mint fentebb. Relatíve drága módszer. A tartós tárolási módszerek közül napjainkban leginkább a liofilezést és a folyékony nitrogénben történő tárolást alkalmazzák (sok esetben, biztonsági megfontolásból, ugyanazon törzsek esetében mindkét módszert is, ha a törzsek fenntartásának fontossága ezt megkívánja). Replika gyűjtemény szükséges a legnagyobb, legfontosabb gyűjtemények esetében: ugyanazon gyűjtemény kisebb kópia (lió ampulla, folyékony nitrogénes kapszula) formájában egy másik helyszínen (50-100 km-re) is el van helyezve a föld alatt. Erre azért van szükség, hogy elemi csapás esetén (földrengés, tűzvész) az igen nagyértéket képviselő eredeti gyűjtemény újra visszaállítható legyen. Szállításra, postázásra (ügyfelek kiszolgálására) elsősorban a liofilezett tenyészet (üvegampullában) vagy a friss leoltás (pl. ferde agaros tenyészet kémcsőben) alkalmazható. Némely esetben száraz jéggel hűtött formában történik az érzékeny tenyészetek postázása. A folyékony nitrogénben történő tárolással konzervált tenyészetek nem alkalmasak szállításra. Tözsek tartósítása folyékony nitrogénben. A világon fellelhető mikrobiológiai törzsgyűjtemények száma 1000 körüli lehet. Ma már nem ritkák a több tízezer mikroorganizmust számláló gyűjtemények. Ezek az iparilag fejlett országokban találhatók. A világ talán legnagyobb, sokszor NRRL-nek rövidített gyűjteményében (US Department of Agriculture, Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois) mintegy 80.000 mikrobát tartanak fenn. Valamivel kisebb, de talán ismertebb gyűjtemény az American Type Culture Collection (ATCC), ahol a tárolt mikrobák száma megközelíti a 60.000- et. A nagy európai és japán gyűjtemények 10-30.000 közötti mikrobalétszámmal rendelkeznek. Magyarországon a három legjelentősebb törzsgyűjteménynek az Országos Közegészségügyi Intézet (OKI) Bakteriológia Osztálya, a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem (KÉE) Mikrobiológia Tanszéke, valamint a Budapesti Műszaki Egyetem (BME) Mezőgazdasági Kémia Technológia Tanszéke ad otthont. Az OKI-ban a humán egészségügyet szolgáló Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteménye található. A fenntartott mikroorganizmusok (döntően baktériumok) száma mintegy 3500. A Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen működik a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye. Itt a szabadalmi letéti mikroorganizmusok tárolásán túlmenően elkezdték a mezőgazdasági és ipari felhasználású mikroszervezetek gyűjtését és raktározását is. Jelenleg mintegy 1600 törzset tartanak fenn, kétféle módszerrel: liofilezéssel (fagyasztva szárítással) és folyékony nitrogénben történő tárolással. Magyarországon ez az egyetlen hely ahol szabadalmi védelem alá (szabadalmi letét) helyezhetünk bármilyen a biotechnológiai iparban hasznosítható mikrobát. A BME-n (Budapesti Műszaki Egyetem) mintegy 2000 mikroorganizmust tárolnak, liofilezett tenyészetek formájában. A TUB rövidítéssel (Technical University of Budapest) jelölt gyűjtemény a mezőgazdasági, ipari és környezetvédelmi célú kutatásokat, valamint az oktatást szolgálja. 4. Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások 4.1. Fermentációs eljárások Módszer tekintetében alapvetően két fő lehetőség jöhet szóba: a szubmerz (folyadék kultúrás) és szilárd (solid state fermentation, SSF) közegű fermentáció. A szubmerz tenyésztés jóval elterjedtebb, ez a jelenlegi ipari fermentációk túlnyomó többségére igaz, továbbá a felületi, szilárd tenyésztés starter, inokulum (oltó) kultúráit is folyadék tenyészetekkel biztosítják. A szubmerz fermentációt a jobb mérhetőség, szabályozhatóság jellemzi. A batch- fermentáció a folyadék fermentációk szakaszos üzemmódja. A batch tenyészetekben a mikrobák szaporodásában négy fázist lehet megkülönböztetni (grafikon): Lag fázis: Ha sejteket az egyik táptalajból egy másikba oltunk át a sejtszám az első néhány órában nem változik, ekkor adaptálódnak organizmusaink a környezetükhöz. Log fázis: A lag fázis végére az adaptálódott sejtek szaporodásnak indulnak és a sejtszám megtöbbszöröződik a növekedés exponenciálissá válik. Stacioner fázis: A növekedés gyengül az elfogyó szénforrás, nitrogénforrás vagy a felhalmozódó az anyagcserében termelődő toxikus anyagok miatt. 18

Fermentációs technológiák általában Stacioner fázis: A növekedés gyengül az elfogyó szénforrás, nitrogénforrás vagy a felhalmozódó az anyagcserében termelődő toxikus anyagok miatt. Pusztuló fázis: Erre a fázisra a biomassza energiatartalékának elfogyása és a sejtek elhalása jellemző. Grafikon Baktérium tenyészet növekedési görbéje A batch fermentációk továbbfejlesztett változatai a feeding fermentációk, ahol a fermentáció kezdetén a tápoldat fontosabb összetevőit kisebb koncentrációban alkalmazzák, majd a fermentáció előrehaladtával folyamatosan kis adagokban a fermentléhez adagolják. A mikroorganizmus által előállított termék maximális bioszintézisét gyakran feed-back gátlás akadályozza, ez - amennyiben deregurált mutánsok nem alkalmazhatók megfelelő fermentációs időben táptalajkomponensek adagolásával (feeding) kivédhető. A szubmerz fermentációk speciális változata a folyamatos fermentáció, ahol a bioreaktorba folyamatosan vezetik be a steril tápoldatot és egyidejűleg ugyanolyan mennyiségű átalakított fermentlevet visznek ki a rendszerből (kemosztát és plug-flow reaktor). 19

Fermentációs technológiák általában Fermentor Levegőliftes fermentor 20

Fermentációs technológiák általában Folyadék sugaras fermentor A szilárd, felületi (SSF) tenyésztést elsősorban penészgombák szaporítására használják. Ilyen körülmények között a levegőztetés egyszerűbb, mivel a nagy felületen elhelyezkedő mikrobák könnyen érintkeznek a levegővel. Az alacsony nedvesség tartalomból (20-50%) következően a helyigénye kisebb, mint a süllyesztett fermentációé, és így a hatóanyagok kinyerése is egyszerűbb. Táptalajuk, szubsztrátumaik egyszerűek akár lehet csak búza vagy rizskorpa (penészkorpás eljárás). Nagy hátránya, hogy a folyamat szabályozása, mérése a tápközeg inhomogenitása miatt nem megoldható. Tözsek tartósítása folyékony nitrogénben. A felületi tenyésztés tálcás eljárása során pl. a búzakorpát 50% nedvességűre nedvesítve sterilezik, majd lyuggatott fenekű fémtálcákra helyezik. 21

Fermentációs technológiák általában A felületi tenyésztés tálcás eljárása során pl. a búzakorpát 50% nedvességűre nedvesítve sterilezik, majd lyuggatott fenekű fémtálcákra helyezik.(kép) A tálcákat kamrákba helyezik és megadott hőmérsékleten 1-5 napig inkubálják. SSF tenyésztő üzem kamrái. A tálcákat kamrákba helyezik és megadott hőmérsékleten 1-5 napig inkubálják tálcás tenyésztés - Üzemi felületi tenyésztés kép Forgodobos fermentor A jelenlegi fermentációs biotechnológiai ipar túlnyomó többsége szubmerz aerob (levegőztetett) fermentáció, ezért a következő fejezetekben ezeket tárgyaljuk 4.2. Nyersanyagok 22

Fermentációs technológiák általában A mikroorganizmus táptalajoknak mindazokat az elemeket tartalmazni kell, amelyek a sejt saját anyagainak felépítéséhez és anyagcseretermékek előállításához szükséges. A kívánt biotechnológiai termékek termeléséhez elengedhetetlen az optimális fermentációs táptalaj összetétele. Ez a táptalaj-optimalizálás. Meg kell választani a helyes táptalajt (összetétel, adagolások), és az ezen a táptalajon előnyösen alkalmas tenyésztési körülményeket (oxigénellátás, hőmérséklet). A termelés céljára szolgáló tápoldatokat előállítási módukban is optimalizálni kell, mivel az előkészítés során minden esetben csíramentesíteni, sterilezni kell. Fontos tehát a komponensek összetétele, minősége, az oldás vagy szuszpendálás sorrendje, kicsapódások megakadályozása, a sterilezett tápoldat változásai, ph értékek előtte és utána, sőt szükség lehet egyes összetevők külön sterilezésére és adagolására. A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak. A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb. Ezekből az anyagokból elsősorban u.n. inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak. A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb.. Ezekből az anyagokból elsősorban u.n. inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen baktériumok általános tenyésztésére alkalmas speciális több összetevőből álló Nurient agar és Nutrient tápleves(broth)táptalajokat látunk. 23

Fermentációs technológiák általában A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak. A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb.. Ezekből az anyagokból elsősorban u.n. inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen baktériumok, gombák tenyésztéséhez használható egyszerű táptalajösszetevők láthatók. Gazdaságossági okokból az ipari termelést olyan u.n főtáptalajokon kell biztosítani, amelyek gyakran komplex, alig meghatározható összetételűek, sok esetben élelmiszeripari melléktermékek, hulladékok. A szénhidrátok pl. glükóz, szacharóz - a mikroorganizmusok általános energiaforrásai, azonban tisztán a költségtényezők miatt nem alkalmazhatók. A melasz a cukorgyártás során a cukorrépa feldolgozásakor keletkező anyalúg a legolcsóbb kb. 50%-ban szacharóz tartalmú szénforrás. E mellett vitaminokat, nyomelemeket, sőt nitrogént is tartalmaz. A glükózszörp (izoszörp) a kukoricakeményítőből nyert glükóz enzimatikus átalakítás során nyert köztitermék, amely mintegy fele-fele arányban tartalmaz glükózt és fruktózt a melaszhoz hasonló koncentrációban. A malátakivonat a sörgyártás során malátásított árpa vizes, nedves kivonata. Összetettebb szénforrás, mint az előzőekben felsoroltak, mivel nemcsak hexózokat, hanem diszacharidokat, triszacharidokat egyaránt tartalmaz fehérjék, aminosavak és vitaminok mellett. Itt érdemes megemlíteni, hogy mind a malátakivonat, de más %-os mennyiségben egyszerű redukáló cukrokat (glükóz, fruktóz) és mellette aminosavakat, fehérjéket tartalmazó táptalajokat kíméletesen kell sterilezni. A Maillard-reakció során a fehérjék aminocsoportjai vagy maguk az aminosavak reagálnak a cukrok karbonil csoportjával és ezeket a mikrobák nem képesek hasznosítani. Sok esetben a megoldás a monoszacharid tartalmú szénhidrátok külön sterilezése és adagolása. A kukoricaliszt vagy maga a kukoricakeményítő és dextrin is alkalmas szénforrás lehet. A cellulóz, növényi olajok és metanol csak speciális esetben alkalmazhatók. Nitrogén-forrásként a leggyakrabban élesztőkivonatot, különböző hús, kazein, zselatin és szójaliszt hidrolizátumokat, peptonokat, és húskivonatokat (beef-extract) alkalmaznak, elsődlegese a laboratóriumi munkában. Üzemi körülmények között a penicillin gyártásnál is áttörést és nagy termelékenységet értek el a kukoricakeményítő előállítás közben keletkező kukoricapréslé, a kukoricalekvár használatával Ez az anyag ma már a biotechnológiai ipar fő nitrogén és vitamin forrása. Fő komponense elsősorban az aminosavak, míg cukortartalma a tejsavbaktériumok révén tejsavvá alakul. Legújabb kísérletek szerint a lekvár szárítását is megoldották, így állandó minőségű kukoricalekvár-por felhasználása is lehetségessé vált. A 24

Fermentációs technológiák általában kukoricalekvár fő jellemzője az élő tejsavbaktériumok jelenléte, amely nem megfelelő sterilezés esetén a fermentáció és a kezdő biotechnológus réme lehet. Használatuknak azonban nincsen akadálya, mivel a tejsavbaktériumok nem spórás szervezetek, így sterilezéssel könnyen elpusztíthatók. Ezeknél kevésbé alkalmas, de költségtényezők miatt sok helyen használt a szójaliszt, amely a szójaolaj kivonási gyártás után visszamaradt komplex tápanyag. A szójaliszt fehérjéi csak lassan metabolizálódnak, ezért csak hosszabb idejű fermentációk esetén alkalmazzák. Minden előkészített tápoldatot, oldatot, kémcsöveket és lombikokat, valamint a fermentorokat és a hozzá tartozó oltócsöveket sterileznünk kell. Az általános gyakorlat a hősterilezés, ez a legfontosabb módszer, ekkor a legtöbb tápoldatot, hacsak nem túl érzékeny, 5-10 perces előfőzéssel kell előkészíteni. Csíramentes anyagokat 121 C-on 1,2 atm telített gőznyomáson 25 perc időtartam alatt lehetséges előállítani. A kisebb csöveket, lombikokat certoklávban, Lombikok sterilezése certoklávban. a fermentorokat autoklávokban Sterilezett 5 literes fermentor autoklávban. míg a több 100-1000 literes fermentorokat helyben direkt gőzbevezetéssel sterilezzük. Az elv minden esetben ugyanaz, bár nagyobb térfogatban (5-10 liter) hosszabb sterilezési időre lehet szükség (45-60 perc) hasonlóan a nagyobb fermentorokhoz. A vitaminokat, hormonokat sterilezett kerámia vagy membrán szűrőn (0,45 mikométeres pórusú) átbocsátva szűrjük csíramentesre és a már sterilezett tápoldatokhoz adagoljuk steril fülkében, vagy szobában. Szubmerz baktérium tenyészet rázógépen. Szubmerz gombatenyészet rázógépen. 4.3. Fermentációs fokozatok (Scale-up) A fermentációs eljárás első lépéseként lombiktenyészetekben rázógépeken optimalizáljuk a gombák és baktériumok tenyésztését. 25

Fermentációs technológiák általában Rézköpenyes általános fűtő bakterológiai termosztát analóg kijelzővel, rázógéppel Hűtő, fűtő temosztát Certomat 12 férőhelyes rázógéppel. A biotechnológiai gyakorlat a következő: az agar ferdéken tenyésztett nemesített organizmusokat 100 ml steril tápanyagokat (tápleves) tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikba mosva (oltva), majd azokat rázógépre helyezve szaporodástól függően meghatározott hőmérsékleten 1-10 napig fermentáljuk. Ez a tenyésztés a nagyipari fermentáció laboratóriumi modellezése. A rázatott lombikok falán a percenkénti 300-450-es rázatási fordulat miatt (r.p.m. rotary per minute) folyadékfilm alakul ki, amelyben a gyors gázcsere lehetővé teszi a mikroszervezetek intenzív légzését. A fermentáció során igen fontos a jó oxigénellátás biztosítása. A mikrobák szaporodása energiát igénylő folyamat (pl. fehérje-, zsírsav-szintézis), s csak a légzés biokémiai mechanizmusával keletezik jó hatásfokkal ez az energiamennyiség. A második fermentációs lépcső a már keverőkészülékkel és levegőztető berendezéssel ellátott üvegfermentorok. 5 literes fermentor ph, oxigén és hőmérséklet szenzora Lecsomagolt 5 literes fementor sterilezés előtt. Ezek már hasonlítanak az üzemi termelőkészülékekhez, hasznos térfogatuk 5-20 liter. Ezekben az edényekben a táptalaj bár eltér az inokulumok összetételétől, de még nem a termelő táptalajt tartalmazza. Ebben a térfogatban fő cél - hasonlóan az inokulum tenyészetekhez hogy a mikroorganizmusok maximális mennyiségben szaporodjanak el. A fermentorok oltásánál fő szempont az oltási százalék meghatározása, azaz hogy milyen mennyiségű pl. baktérium lét mossunk adott térfogatú fermentorhoz. Általában baktériumoknál ez 0,1-1,0 %, gombáknál és növényi sejteknél 3-10 % inokulum fermentlevet (pl. a lombikban szaporított baktériumok tenyészetét) adagolunk. 26

Fermentációs technológiák általában Csővezetékek hálózata köti össze a steril fementorteret a külvilággal. Jobbra az adagoló üvegek láthatók, amelyekből steril szilikoncsöveken áramlik a folyadék. A készülék hűtővizzel és fűtéssel szabályozza hőmérsékletét, ez rendszer a piros gumicsöveken keresztül működőképes. A sárga vízálló vezetékek látják el árammal a keverőmotort és a fermentor szabályozó tornyát (a kép jobb oldalán). 27

Fermentációs technológiák általában A sterilezéshez a csövek végeit és a ph, oxigén szenzor csatlakozóit nátronpapírba és alufóliába csomagoljuk, ez utóbbit a papír nedvesedésének elkerülésére.a fehér, kerek 0,2 mikrométer pórusátmérőjű steril levegőszűrő még csomagolatlanul lóg a fermentor oldalán. Sok esetben félüzemi, kísérleti üzemi léptéket is beiktatnak (pilot-plant), 100 3000 liter térfogatban. Ebben a térfogatban már termelő léptékről beszélhetünk és a fermentáció során már főfermentációs optimalizált táptalajokra oltunk és tenyésztünk. Az üzemesíthetőség megítélésekor ez a félüzemi lépték fontos a következő befejező lépték megvalósításához. 28

Fermentációs technológiák általában Rozsdamentes acél helyben sterilezhető 10 liter hasznos térfogatú párosával elrendezett félüzem. 29

Fermentációs technológiák általában A félüzemi fermentor fején helyezkednek el a szondák. Biztonsági hőálló üvegablak biztosítja a belátást. 30

Fermentációs technológiák általában A fermentorüzem oltófermentorai 100 literes térfogatúak. Rozsdamentes acél megfelelő fejmotorral és műszerekkel(ph és hőmérséklet, nyomás mérése). 31

Fermentációs technológiák általában Az üzemi femenotorokon már nem a fejen, hanem a test oldalsó részén vezetik be az érzékelőket. 32

Fermentációs technológiák általában A modern főüzem 4 köbméteres fermentort működtet. A bonyolult csövezés és számítógép vezérlés lehetővé teszi a tápanyagok csővezetéken történő betöltését, ezekben a fermentorokban már nincs bebújónyílás, szükségtelen. 33

Fermentációs technológiák általában A modern jól szigetelt köbméteres fermentor két emelet között fér el. A kép tetején a fermentor tengely nagyteljesítményű motorja látható(zöld). a csővezetékeken mágnesszelepek láthatók (piros és fekete), melyek a számítógépes vezérlést biztosítják. Végül a termelő fermentáció a termék szükséges mennyiségének megfelelően 1-450 köbméter térfogatban főfermentációs táptalajon folyik. A fermentorokban optimális oltási százalékkal inokulálunk és az előző léptékekben kidolgozott paraméterek szerint tenyésztünk. 10 literes fermentor sterilezése. 34

Fermentációs technológiák általában 100 literes fermentorüzem bemutása. 1 köbméteres fermentorüzem bemutatása. Fermentorüzem mikroprocesszoros programvezérelheto adagoló automatikája. A laboratóriumi eljárások ipari méretben való kifejlesztése (Scale-up) során nagy fontosságú a levegőztetés, hőmérséklet és keverés értékeinek pontos meghatározása. Amint a fermentorban a sterilezett tápoldatot mikroorganizmusokkal beoltják, a levegő formájában adott oxigénen és a ph szabályozásra adagolt savon vagy lúgon kívül az egész folyamat ideje alatt a rendszer összetétele, a biomassza és a metabolitok koncentrációja állandóan változik. Ezért igen fontos a szaporítás alatti ph-beállítás és hőmérséklet megválasztása. A tenyészetek hőmérséklete befolyásolja a szaporodást, ugyanakkor az egyes metabolitok képződését serkentik vagy gátolják, ezért ezeket nehéz összeegyeztetni. Hasonló a helyzet a ph optimummal is. A hőmérsékletet a növekedés, de a termékképződés szempontjából is optimalizálni kell. Nagy tömegű (5 köbmétertől) számolni kell a szaporodási folyamatok hőtermelésével és az esetleges hűtési kapacitás növelésével. A levegőztetés steril szűrőkön keresztül történik szűrőmembránok, vagy szűrőgyertyák alkalmazásával. 35

Fermentációs technológiák általában A sterilezéshez a csövek végeit és a ph, oxigén szenzor csatlakozóit nátronpapírba és alufóliába csomagoljuk, ez utóbbit a papír nedvesedésének elkerülésére.a fehér, kerek 0,2 mikrométer pórusátmérőjű steril levegőszűrő még csomagolatlanul lóg a fermentor oldalán. A fermentorokba a levegőadagolás mérése rotaméterrel történik 0,1-1,0 vvm (levegő térfogat/tápoldat térfogat percenként) mennyiségben. A levegőztetés a fermentáció közben felhasznált oxigén mennyiségétől függ, így pl. intenzív szaporodási időszakban - log fázis - nagyobb mennyiségben szükséges. Stacioner vagy lag fázisban jóval kevesebb, pl. 1 köbméteres fermentorba 30 köbméter óránkénti levegőadagolás is elegendő lehet ( 0,5 vvm). A kívülről behatoló szennyeződések veszélyének csökkentésére a beáramló levegő visszatartásával a 36

Fermentációs technológiák általában fermentorokban 0,1-0,6 bar túlnyomást hoznak létre, és ez természetesen befolyásolja az oxigén és szén-dioxid oldhatóságát. Az oxigén beoldódása az egyik legfontosabb paraméter, ezért megfelelő levegőátbuborékoltatással (levegő lant) és keveréssel kell gondoskodni a teljes fermentlé minden részletének oxigénellátásáról. A keverést többféle kiképzésű keverővel (pl. turbina keverőlapátok), vagy levegőlift (air-lift) alkalmazásával oldják meg. A folyadéksugaras (jet) fermentorokban a fermentlé folyamatos keringetésével biztosítják a levegőellátást. Kisméretű (2-4 mikrométer) bacillusok. 37

2. fejezet - Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek 1. Aminosavak Aminosavakat nagyon széles körben alkalmazzák az élelmiszeriparban mint ízjavítókat, mint pl. a Naglutamátot. A L-lizin, triptofán aminosavakat az aminosavakban szegény takarmányok feljavítására, míg más aminosavakat antioxidánsként alkalmazzák élelmiszerekben. Előállításuk lehetséges fonalas gombák fermentációjával közvetlenül, vagy aminosav prekurzorok, köztes termékek átalakításával élesztős vagy bakteriális fermentációval. 1.1. Nátrium-glutamát A Na-glutamátot ízjavító hatása miatt Japánban az 1900-as évek elején szója és búzasikér hidrolizátumból kezdték előállítani. 50 évvel később a Corynebacterium (Micrococcus) glutamicum fermentációjával kezdték biotechnológiai úton is gyártani. Diplo és tetracoccus típusú sejtek. Micrococcus sp.baktériumok mikroszkópos felvétele. Kémiai szintézissel is lehetséges, de többségében mikrobiálisan állítják elő, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium és Arthrobacter törzsekkel, de rekombinációval E. coli törzsek is képesek. Minden glutaminsav termelő törzs biotint igénylő keto-glutarát-dehidrogenáz blokkolt. A glutaminsavképző mikoorganizmusok az Embden Meyerhof úton glükózból vagy akár acetátból citráton és izocitráton keresztül alfa-ketoglutársav keletkezik, miközben az izocitrát dehidrogenáz által NADPH2 keletkezik. A NADPH2 katalizálja az alfa-ketoglutarát glutamáttá alakítását glutaminsav dehidrogenáz segítségével (reduktív aminálás folyamata). 38

Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek Folyamatábra az Embden-Meyerhof útról és glutamát bioszintézisről A sejt permeábilitása fontos tényezője a glutaminsavképzésnek. Ez növelhető biotinhiánnyal, olajsavauxotrófokkal, zsírsavak vagy penicillin hozzáadásával, illetve glicerin-auxotrófokkal. A biotin hiánya növeli a sejtmembrán károsodását, a sejtmembrán foszfolipid tartalmának csökkenésével, így a sejtben intracellurálisan termelődő glutaminsav kiválasztódhat a fermentlébe. Ellenkező esetben a sejtben koncentrálódva feed-back gátlás alakul ki. Az olajsav auxotrófok szintén a sejtmembrán foszfolipid tartalma szempontjából defektesek. A baktérium sejtfalszintézis gátló penicillin adagolásával még magas biotintartalom mellett is növekszik a termelés, így akár nagy biotin koncentrációjú melasz szénforráson is lehetővé vált 60-100 g/literes hozammal a fermentációs gyártás. 1.2. L-Lizin A növényi takarmányok lizin hiányát régóta adalékanyagokkal (halliszt, húsliszt, takarmányélesztő) próbálják pótolni, majd az utóbbi években a biotechnológiai úton nagy tisztaságban előállított L-lizin hozzáadása került előtérbe. Homoszerin vagy metionin-szerin kettős auxotróf mutánsok alkalmasak hatékony lizintermelő törzseknek, ennek magyarázata a lizin bioszintézise: a lizin baktériumokban az diamino-pimelinsav (DAP), a fonalas gombákban, élesztőkben és algákban amino-adipinsav úton szintetizálódik. 39

Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek A lizin bioszintézis folyamatábrája Amennyiben mutagénkezeléssel sikerül olyan baktérium telepeket izolálnunk, melyek nem képesek homoszerin (homoszerin auxotróf) vagy metionin és treonin (metionin és treonin auxotróf) előállítására, úgy az aminosavak szintézis útja a lizin felé terelődik. A homoszerin képző homoszerin dehidrogenáz a bakteriális lizin termelés kulcsenzime. Ez az enzim treonin és metionin adagolással represszálható, kikapcsolható. Ugyanakkor a lizin szintézis köztitermékét előállító aszpartokináz enzimjeit a metionin a treonin, az izoleucin sőt, a lizin is represszálja, amennyiben túl sok van jelen a sejtekben (feed-back gátlás). A lizin szintézis specifikus enzimje a dihidro-dipikolinát-szintáz szintén feed back gátlást mutat lizin jelenlétében. Ahhoz, hogy a lizin túltermelést el lehessen érni, ezeknek az enzimeknek a működését auxotróf mutánsok előállításával kell kikapcsolni. A lizinfermentáció során egy magas termelőképességű Brevibacterium flavum vagy Corynebacterium glutamicum baktériumtörzset szaporítanak fel melasz, kukoricalekvár és ammónium-szulfát alapú tápoldaton. Az auxotróf törzsek igényesek, ezért a táptalajhoz adagolni kell treonin, homoszerin és metionin aminósavakat (szójaprotein-hidrolizátum) és a biotintartalomnak magasnak kel lennie (melasz). Megfelelő kevertetés és levegőztetés mellett a fermentáció ideje 72-96 óra, amelynek végén a fermentlé L-lizin tartalma 30-100 gramm/liter. A feldolgozás megkezdése előtt a lizint stabilizálják: a fermentlé ph-ját sósavadagolással 5.0-re állítjuk és nátrium-szulfitot adagolunk. 40

Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek Élesztőgombákkal (pl. Crptococcus laurentii) a L amino-kaprolaktám enzimes átalakítása lehetséges lizinné. Az amino-kaprolaktám 10%-os oldatát élő vagy szárított sejtekkel keverik össze, így 24 óra alatt az aminoadipinsav út amino-kaprolaktám hidroláza szinte maradék nélkül L-lizint konvertál. 1.3. L-triptofán A triptofán előállítása elsősorban kémiai szintézissel történik, valamint előanyagok (prekurzorok) fermentatív enzimes átalakításával. Tipikus eljárás a Hansenula anomala élesztőtenyészethez adagolt antranilsav átalakítása vagy Bacillus subtilis indol konverziója. Lehetséges indol és L-szerin adagolt E. coli tenyészetek triptofán szintézise (triptofán - szintetáz reakció), vagy Proteus tenyészetek triptofanáz enzimjével indolból és piruvátból triptofán termelés. A baktériumok által extracellulárisan a fermentlébe kiválasztott aminosavakat nem feltétlenül kell kinyerni, hanem préselt élesztő - praktikusan pék- vagy sörélesztő - hozzáadásával a fermentlevet besűríthetjük 15-20% szárazanyag- tartalomra, majd szeparálás és szűrés nélkül az összfermentlevet porlasztva szárítjuk. Az előállított magas aminosavtartalmú (200-400 gramm/kilogramm) élesztőpor takarmányadalékként közvetlenül felhasználható. Az eljárás előnye, hogy szemben a szintén mikrobiális úton előállított tisztított aminosavak gyártásával, környezetszennyező melléktermékek nem keletkeznek, valamint az ezeknél a portermékeknél gondot okozó higroszkóposság az élesztősítéssel megszűnik, és a termék szárítása és tárolása lényegesen egyszerűbb. 2. Enzimek Az enzimek az élő szervezetekben lejátszódó biokémiai reakciókat irányító katalizátorok, kémiai természetüket tekintve globuláris fehérjék. Enzimeket széles körben állítanak elő ipari fermentációval. A mosószerek nagy mennyiségben tartalmaznak fermentációs proteázokat, az állattakarmányokba pl. amilázokat, cellulázokat, xilanázokat, glüko-amilázokat adagolnak a jobb takarmányhasznosulás érdekében, és pektinázokat, lipázokat a gyümölcslevek előállításánál. Mindezeket baktériumok és gombák fermentációjával lehetséges előállítani. A gombák és baktériumok anyagcsere folyamataikban alapvető szerepük van az enzimeknek. A biotechnológiában elsősorban a sejten kívüli (extracelluláris) enzimtermelést alkalmazzák, mikor a fermentlébe vagy a szilárd közegbe választódnak ki a hatékony enzimek, enzimcsoportok. Extracellularis enzim gyartásának folyamatábrája 2.1. Fehérjebontó enzimek, proteázok, peptidázok 41

Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek A mosószerek 70-80%-a tartalmaz fermentációs proteázokat, ezért ezek termelési mennyiségüket tekintve a legjelentősebb enzimcsoport. 1915-ben Otto Röhm szabadalma indította el a modern mosóporgyártást és gyártanak azóta is mosóporadalékot proteolitikus enzimeket termelő mikrobák segítségével. Proteázokat még a tejipar is hasznosít, valamint a takarmányipar (lásd később). Ezek az enzimek a fehérjéket hasítják, illetve a peptidek keletkezésén át aminosavig bontják a proteineket. A proteinázok az eredeti fehérjemolekulákat (endopeptidázok), a peptidázok (exopeptidázok) viszont a peptideket hasítják. A termelő szervezetek szerint megkülönböztetünk bakteriális és gomba eredetű, valamint savas, semleges illetve lúgos környezetben aktív proteázokat. A mosószerekhez adagolt lúgos proteáz elsősorban Bacillus baktériumok fermentációjából származik, így a legismertebb bacillopeptidázok a Subtisilin Carlsberg (B. licheniformis), a Subtilisin Novo és BPN (B. amyloliquefaciens). Ezek az enzimek lúgos tartományban (ph 8-11) hatnak és magasabb hőmérsékleten is stabilak, tekintve a mosógépekben alkalmazott körülményeket (90 C-os főzőmosás). Nagy proteáz aktivitású fermentleveket fehérje tartalmú tápközegben szubmerz rendszerekben az oxigén nagy parciális nyomása mellett állítanak elő. Semleges kémhatású proteázokat Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces baktériumok és Aspergillus gombák állítanak elő. Elterjedésük korlátozott, főleg a bőrgyártásban cserzésre használják. Kisméretű (2-4 mikrométer) bacillusok. 42

Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek Hajlott jellegzetes pálcák. Bacillus subtilis mozgása. Pseudomonas sp. A gombákból nyerhető savas proteázokat az állattakarmányozásban (lásd lent) és a sajtgyártásban alkalmazzák. A tejfehérje, a kazein kicsapásához a tejet koaguláló rennin (a borjú gyomrának kivonatát, a rennit használták régen) típusú proteázokat kevernek a sajt fajtájának megfelelő starterkultúrával (pl. Lactobacillusok) már savanyított tejhez. Ilyen savas peptidázok termelésére Mucor, Aspergillus vagy a legújabb kutatások szerint hőtűrő, ezért stabilabb proteázt termelő Thermomyces, Humicola gombák is alkalmasak. 43