PhD ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Sejtmagi és kloroplasztisz riboszomális DNS szakaszok vizsgálata a hexaploid búzában és rokonsági körében Rudnóy Szabolcs Biológia Doktori Iskola (Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Dr. Szigeti Zoltán) Témavezetı: Dr. Lásztity Demeter PhD egyetemi docens Eötvös Loránd Tudományegyetem Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék Budapest 2007
Bevezetés A búza az európai civilizáció kétségkívül legjelentısebb kultúrnövénye. Az elsı kovásztalan lepényektıl a mai péktermékekig hosszú út vezetett, de a búzalisztbıl készülı kenyér napjainkig a legalapvetıbb, mindennapi táplálékunk maradt. Ma a búzatermesztés elsısorban a közönséges búza és azon belül is az ıszi búza kultivációját jelenti világszerte, bár vannak régiók, ahol a durumbúzát is jelentıs területeken vetik és egyéb fajok, illetve fajták is szerephez jutnak, például egyre bıvül a táplálkozástanilag kedvezıbbnek tartott tönkölybúza termesztése is. Egykor azonban az ıszi búza mellett ismert más fajok-fajták is sokkal elterjedtebbek voltak és a helyi viszonyoknak megfelelıen a fentiek mellett az alakor és a tönkebúzát is számos helyen ismerték és termesztették, sıt, termesztésük korábban kezdıdött, mint a közönséges búzáé. Jelentıségét tekintve nem meglepı, hogy mióta létezik növénytani tudomány, a búza állandóan a kutatás homlokterében állt, hiszen egyrészt kéznél volt, mint vizsgálati objektum, másrészt megismerése, tulajdonságainak feltérképezése és megváltoztatása, az elınyös változatok kihasználása nagyon is konkrét gazdasági elınyöket jelent. A ma fı kenyérgabonánkként termesztett közönséges búza allohexaploid élılény, vagyis testi sejtjeinek sejtmagjaiban három különbözı genomot hordoz, azaz három teljes, dupla kromoszómaszerelvényt. Amint ez ismertté vált, fölvetıdött a kérdés, hogy mely diploid fajok lehettek az ısei a hexaploid búzának, a számos ma is ismert közelrokon faj közül melyek vehettek részt kialakulásában. Ennek ismerete a nemesítés és a génbankok megırzése szempontjából sem jelentéktelen. A hexaploid búza három genomját A, B, illetve D betőkkel jelölik és az A, ill. a D genom eredetére egyre több konkrét bizonyítékot sikerült találni. A B genom eredete azonban dacára annak, hogy a közönséges búza a Föld legnagyobb területen termesztett növénye, és emiatt számtalan tudományos mőhely vizsgálja a legkülönbözıbb aspektusokból a mai napig vita tárgyát képezi. Szándékunkban állt a hexaploid búza eredetérıl, evolúciójáról, rokonsági viszonyairól az utóbbi idıkben kifejlesztett molekuláris biológiai módszerekkel a lehetı legtöbbet megtudni, az A és D genomra vonatkozó eddigi eredményeket a mi módszereinkkel megerısíteni, vagy cáfolni, és a B genom eredetét tisztázni, illetve új eredményekkel megvilágítani.
Célkitőzés A búza riboszomális DNS (rdns) régiók vizsgálata már eddig is hozott új és érdekes eredményeket és még sok lehetıséget kínál a búza eredetének és evolúciójának kutatásában. Az nrits régió különösen alkalmas faji határok vizsgálatára, sokszor még közeli rokonok esetében is, így adott a felhasználási lehetısége a búza és rokonsági köre evolúciós és genomiális kutatásában. Munkám fı céljait az alábbi pontokban foglalom össze: 1. A hexaploid közönséges búza eredetének, evolúciója fıbb vonalainak vizsgálata riboszomális DNS régiók PCR-alapú vizsgálatán keresztül 2. Az A és D genom eredetére vonatkozó eddigi ismeretek bıvítése, megerısítése, vagy cáfolata az említett módszerekkel 3. A B genom eredetére vonatkozó ismeretek bıvítése új eredményekkel, és amennyiben lehetséges, a B genom eredetének tisztázása 4. Annak vizsgálata, hogyan jelenik meg a búza összetett genomi szerkezetének hatása a riboszomális DNS szekvenciákban
Anyagok és módszerek A kísérletekhez felhasznált búzafajok, búzafajták: Triticum aestivum Mv15 és Galahad fajták, Triticum urartu Mv110, Triticum turgidum ssp. dicoccum Mv300, Triticum monococcum Mv515, Aegilops tauschii Mv363, Aegilops speltoides Mv621, Aegilops squarrosa Mv605. Az összes növényi vizsgálati anyag az MTA martonvásári Mezıgazdasági Kutatóintézetébıl származik, a megadott azonosítási jelek a martonvásári génbankban regisztrált nyilvántartási számot jelentik. A DNS-t részint kifejlett növény levelébıl, részint hidegkezelt csíranövénybıl vontam ki, így a növényi anyag nevelése is ennek megfelelıen kétféle módon történt. A DNS kinyerése, PCR, szekvenálás: A DNS kinyeréséhez a mintákat dörzsmozsarakban dörzsöltem el, kvarchomok és folyékony nitrogén jelenlétében, a porított anyagot 2%-os CTAB lízis pufferben vettem föl. A fehérjéket kloroformos kicsapással távolítottam el, centrifugálás után pedig a vizes fázisú felülúszóból a DNS-t abszolút etanollal csaptam ki. A csapadékot 70%-os etanollal mostam, végül steril ultratiszta vízben, vagy Trisz pufferben (0,1 M, ph=8) vettem föl. A PCR amplifikációhoz Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400, ill. Techne TC-312 típusú készülékeket alkalmaztam, a PCR elegyek végsı térfogata minden esetben 50 µl volt. A reakcióelegyekben 2 mm volt a végsı Mg 2+ koncentráció. A PCR eredményét agaróz gélelektroforézissel vizsgáltam, amelyhez Gibco Horizon 11-14 típusú futtató rendszert használtam. A termék jelenlétét etidium-bromid festékkel mutattam ki. A PCR-termékek tisztítását kétféle módon végeztem, DNS-t specifikusan kötı mátrix (Prep-A-Gene mátrix, Bio-Rad), illetve ultraszőrı membrán (Amicon membrán, Millipore) segítségével. A szekvenáló reakcióhoz a BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit-et (Applied Biosystems) használtam. A szekvenáló reakcióelegyekbıl a jelölt DNS-t etanollal és Na-acetáttal csaptam ki, majd etanollal mostam a DNS-t, végül a csapadékot kiszárítottam. A kapilláris gélelektroforézis ABI PRISM 310 Genetic Analyser, ill. ABI PRISM 3100 Genetic Analyser készülékben (mindkettı Applied Biosystems) történt.
Speciális PCR és klónozás: A hexaploid közönséges búza három genomjának azonosítása érdekében speciális PCR reakciót terveztem és alkalmaztam, amely eredetileg a Glomales rendbe tartozó arbuszkuláris mikorrhizagombák óriás spóráiból való eredményes amplifikációhoz használatos, ugyanis az ilyen spórák erısen metilált DNS-t tartalmaznak és szokásos PCR körülmények között nem, vagy csak nagyon gyenge eredménnyel amplifikálhatóak. A magasabb hımérséklető denaturáció azonban tapasztalatok szerint növelte a PCR eredményességét. Ezt a reakciót két lépésben végeztem, az elsı lépésben erısen denaturáló körülményeket teremtettem, ez természetesen a DNS-polimeráz enzim aktivitását is a szokottnál erısebben csökkenti, a második lépés éppen ezért egy normál PCR reakció, amely az elsı lépésben képzıdött PCRtermékek sokszorosítására szolgál. A reakciót Pfu polimeráz enzimmel végeztem, az utána következı TA típusú klónozáshoz amplifikáció utáni adenilálást alkalmaztam. A speciális PCR termékét T4 DNS-ligáz és pgem plazmid vektor felhasználásával klónoztam JM109 baktérium sejtekbe (pgem-t Easy Vector System II, Promega). A sejteket szélesztettem, majd az inzertet hordozó telepeket kék-fehér szelekcióval különítettem el. Az inzertet PCR reakcióban szaporítottam föl és azonnal, vagy restrikciós enzimes szelekció után szekvenáltam. A szekvenciák kezelése, primerek, filogenetikai analízis: Az ellenırzött szekvenciákhoz hasonló, már leközölt adatokat a nemzetközi adatbázisokban (GenBank, EMBL) a BlastN 2.2.2, illetve a Fasta33_t programok segítségével kerestem, a DNS-szekvenciák pontos illesztését a ClustalW programmal végeztem. Munkám során 14 PCR-, ill. szekvenáló primert használtam, ebbıl tizet én terveztem. A filogenetikai elemzéseket a MEGA 3.1 programcsomag programjaival végeztem, a törzsfák megjelenítése és szerkesztése ugyanezen programcsomag Tree Explorer nevő alkalmazásával történt. Az elemzésekhez kétféle, nemzetközileg is széles körben elfogadott eljárást használtam, a szomszédcsatolás (neighbor-joining) és a legnagyobb takarékosság (maximum parsimony) néven ismert faszerkesztési módszereket. Mindkét módszer esetében a program alapértelmezett beállításait használtam.
Eredmények és értékelésük A direkt nrits szekvenálás eredményei: Munkám elsı fázisában a közönséges búza, valamint rokonsága legfontosabb néhány tagjának nrits szekvenciáját határoztam meg. Feltőnı volt a T. aestivum cv. Mv15 mintánk egyértelmő elkülönülése az összes többi vizsgálati objektumtól, még a közvetlen ıseinek tekinthetı T. turgidum ssp. dicoccum és Ae. tauschii minták ITS szekvenciájától is. Ez a szeparáció mindenképpen igényelte az Mv15 búza ITS régiójának további vizsgálatát. Az Mv15 egyike azon martonvásári búzafajtáknak, melyek az 1RS rozs transzlokációs kromoszómaelemet hordozzák, amely tartalmazhat rdns elemeket, ez befolyásolhatta az eredményeinket. Ezt megerısíti, hogy a rozs szekvencia csatolásával a T. aestivum cv. Mv15 és a rozs (Secale) egymás mellé került a törzsfán, így bebizonyosodott, hogy az Mv15 direkt nrits szekvenciájában a rozs kromoszómaelem egyértelmő, erıs befolyással bír. monococcum urartu Secale tauschii aestivummv15 speltoides 0.005 dicoccum 1. ábra. Szomszédcsatolás (neighbor-joining) eljárással készült gyökértelen törzsfa Kimura- 2-paraméter távolságmátrix adataiból generálva. Az Mv15 által hordozott rozs kromoszómaelem megnyilvánulása az nrits szekvenciákban a kloroplasztisz genetikai állománya felé fordította a figyelmünket, amely független a sejtmagi transzformációktól. Azonban az általunk tanulmányozott plasztisz rdns
markerek nem bizonyultak variábilisnak, így megpróbáltunk ismét az nrits marker speciális vizsgálatával új eredményeket elérni. A rozs elem megnyilvánulása adta az ötletet, hogy belsı információt próbáljunk nyerni a hexaploid búzából a rozs elem és fıként a búza A, B és D algenomjai ITS szekvenciáinak önálló megjelenítésével. A speciális PCR-rel és klónozással elıállított nrits szekvenciák vizsgálati eredményei: A magas denaturáló hımérséklettel mőködı, kétlépéses PCR, majd az azt követı klónozás és plazmidizolálás után összesen 67 ITS klónszekvenciát állítottam elı két mintából, az Mv15 és Galahad búzafajtákból; 20 klón az Mv15 fajtából (M01-M20), 47 pedig a Galahad fajtából származik (G01-G47). A klónok között jelentıs különbségek is adódtak, alapvetıen négy csoportot tudtam elkülöníteni, ezek láthatók az 1. táblázatban. összes aestivum típus D genom típus A genom típus rozs típus ITS klónszekvencia 67 47 8 2 10 ebbıl Mv15 fajtából 20 7 1 2 10 Galahad fajtából 47 40 7 0 0 1. táblázat. Az ITS klónszekvenciák száma (db) és megoszlása típusonként és fajtánként Az Mv15 klónok között nem akadt olyan, amelyik azonos lett volna az eredeti ITS szekvenciával, ellenben a rozs típusú klónok teljesen azonosak voltak a rozs ITS-sel, ill. 1-2 bázisban tértek el tıle. E fajta klónjai között kimutattam még az A, ill. a D genom csoportba tartozó klónokat is. A Galahad búzából nyert ITS klónok csak két fı csoportot alkottak, aestivum és D genom típusba soroltam ıket, és itt már voltak olyan klónok, melyek azonosak a Galahad direkt szekvenálással kapott ITS szekvenciájával. A mindkét fajtából származó összes klónt tekintve jellemzı, hogy a szekvenciák egy típuson belül többnyire különböztek egymástól egy, vagy néhány bázisban, ugyanakkor akadtak köztük azonos klónszekvenciák is, két esetben a két független fajta klónjai között is. Ez utóbbira példa az aestivum típusú klónok között az a csoport, amely az M04 és M06 számú klónok mellett nyolc Galahad klónt is tartalmazott, ill. a D genom típusúak között az M08 és G31 klónok, amelyek szintén 100%- ban azonosak.
2. ábra. Maximum parsimony eljárással készült bootstrap konszenzus törzsfa. Skála: nukleotidcserék száma. Külcsoport: Poa pratensis. Az aestivum típusú klónok csoportját fekete, a D genom csoportot zöld, az A genom csoportot sötétvörös, a Sitopsis fajokat sötétcián szín jelöli. A klónszekvenciák igen jól illeszkednek a törzsfákon kirajzolódó kládokba, ami támogatja az adott csoportokba való rendezésüket és megmutatja, hogy az itt alkalmazott speciális módszer segítségével képet alkothatunk a közönséges búza genomjaiban rejtızködı ITS formákról. A speciális metiláció ellen hatásos PCR /klónozás módszer használatával sikerült kimutatni olyan nrits kópiák jelenlétét a közönséges búza genomjaiból, amelyek a szokásos PCR technikával nem jelentek meg. A szülıi ITS típusokhoz hasonló formák megjelenése nem lehet a véletlen mőve, nem a PCR hibájának eredménye, hanem egykori allopoliploidizációk, esetlegesen késıbbi hibridizációs események nyomai. Az Mv15 fajta direkt nrits szekvenciája egyértelmően hibrid jellegő volt. Mindkét fajtából megjelentek a D genom típusú szekvenciák a speciális módszerrel, és azonos klón is volt köztük. Az Mv15 fajtából ezen kívül rozs és A genom jellegő klónszekvenciák is kimutathatóak voltak. A szekvenciákat nem jellemezték a pszeudogének jellegzetességei, vagyis a sok mutáció adeninre és timire, ill. a magas szabadenergia. A módszer hibarátája olyan alacsony, hogy a klónszekvenciák valószínőleg a valós viszonyokat tükrözik. E szerint a búzában számos olyan kisebb-nagyobb nrdns sorozat létezik, amely különbözik egymástól és korábbi hibridizációk nyomait ırzi. 72 32 23 22 91 65 Galahad G13 G01 G04 23 G22 G23 G02 15 G05 G19 62 G42 G03 G36 G11 G37 G17 Pioneer 97 16 G07 turgidum G34 M11 36 G15 G27 G25 M04 G10 32 G18 G26 G38 G40 G43 speltoides 81 searsii sharonensis tauschii 35 G12 G39 40 M08 G14 43 G24 G16 40 G21 M05 urartu M20 monaj301800 49 monl11581 M02 Rozs 99 M15 95 M01 M10 Poa 53 53 5
Munkám általam legfontosabbnak ítélt eredményeit az alábbi pontokban foglalom össze: Munkám során a plasztiszban és a sejtmagban kódolt rdns régiók felhasználhatóságát vizsgáltam a búza eredetének, evolúciójának vizsgálatában. Eredményeim szerint a cp16s rrns gén, ill. a cp23s és 5S gének közötti régió alig, vagy nem használható ilyen célokra, ellenben a sejtmagi ITS régió jól használható és a kísérleti körülmények és módszerek megfelelı beállításával egykori hibridizációk nyomait hordozó szekvenciák is kimutathatók a búzából A dolgozatban ismertetett speciális módszer használata nélkül ezek a szekvenciák többnyire rejtve maradnak A közönséges búza direkt nrits szekvenciája hibrid jellegő is lehet (Mv15) A T. aestivum direkt nrits szekvencia szinte megegyezik a T. turgidum ITS-sel, valószínőleg ısi szekvenciáknak az együttes evolúció által homogenizált hibridje, és így nem alkalmas a búza evolúciós történetének vizsgálatára Mint a legfiatalabb algenom, a D genom eredetére sikerült a legtöbb bizonyítékot találni, s eredményeim alátámasztják az elfogadott hipotézist, amely szerint a donor az Aegilops tauschii. Az A genom eredetét tekintve eredményeim nem cáfolják, de nem is erısítik meg a T. urartu kizárólagos donor szerepét, de felvetik a lehetıségét, hogy a donor nrits szekvenciája nem egyezett meg a mai két alakor búzafaj valamelyikével (T. urartu és T. monococcum), hanem inkább egy (közös) ısi alakor ITS szekvenciára utalnak Egyértelmően B genom eredető szekvenciát nem sikerült kimutatni a vizsgált fajtákból. Ennek az lehet az oka, hogy az A és B genom hibridizációja óta eltelt idıben az együttes evolúció homogenizálhatta az eredeti szülıi nrits formákat, mégpedig egy új, hibrid típusú szekvencia irányába A búzában és más allopoliploid élılényekben óvatossággal kezelendık a direkt szekvenálással kapott eredmények és a hibák elkerülésére alkalmasnak ígérkezik a dolgozatomban ismertetett módszer, amely lehetıvé teszi régebbi hibridizációs események nyomainak feltárását a búza genomjában, a hagyományos PCR eljárás során többnyire rejtve maradó minor nrits kópiák felszínre hozásán keresztül. Ilyen módon információk nyerhetık a búza összetett genomi szerkezetének egyes elemeirıl közvetlen módon is
A témával kapcsolatos publikációk Dolgozatok referált tudományos folyóiratokban: Rudnóy S, Páldi E, Bratek Z, Szegı D, Rácz I, Lásztity D (2004): ITS regions in hexaploid bread wheat and its supposed progenitors. Cereal Research Communications 32(4): 423-428. Teljes közlemények konferencia-kiadványokban: Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2005): Studies on chloroplast and nuclear rdna in hexaploid bread wheat and its relatives. Acta Biologica Szegediensis, 49(1-2): 35-36. Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2002): Chloroplast 16S rrna sequences from different Triticum species. Acta Biologica Szegediensis, 46(3-4): 47-48. Egyéb publikációk Dolgozatok referált tudományos folyóiratokban: Sramkó G, Gulyás G, Matus G, Rudnóy S, Illyés Z, Bratek Z, Molnár VA (2007): Leaf width, nrdna and cpdna and cpdna ITS sequence variation within Central European Bulbocoidum vernum and B. versicolor (Colchicaceae) populations: are they really two taxa? Acta Biologica Hungarica in press. Gulyás G, Sramkó G, Molnár VA, Rudnóy S, Illyés Z, Balázs T, Bratek Z (2005): Nuclear ribosomal ITS paralogs as evidence of recent interspecific hybridization in the genus Ophrys (Orchidaceae). Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47(2): 1-7. Halász K, Bratek Z, Szegı D, Rudnóy S, Rácz I, Lásztity D, Trappe J (2005): Tests of species concepts on the small, white European group of Tuber spp. based on morphology and rdna ITS sequences with special reference to Tuber rapaeodorum. Mycological Progress 4(4): 281-290. Parádi I, Páldi E, Rudnóy S, Bratek Z, Kovács G, Rácz I, Lásztity D (2003): Changes in the content of modified nucleotides in wheat rrna during greening. Biologia Plantarum 47(1): 33-38.
Kovács GM, Rudnóy S, Vágvölgyi C, Lásztity D, Rácz I, Bratek Z (2001): Intraspecific invariability of the internal transcribed spacer region of rdna of the truffle Terfezia terfezioides in Europe. Folia Microbiologica 46(5): 423-426. Rudnóy Sz, Bratek Z, Halász K, Rácz I, Lásztity D (2000): A fehér nyárral (Populus alba L.) ektomikorrhizás kapcsolatban álló két gombafaj táptalaj szelekciója és molekuláris taxonómiai vizsgálata. Botanikai Közlemények 86-87(1-2): 121-128. Teljes közlemények konferencia-kiadványokban: Illyés Z, Rudnóy S, Bratek Z (2005): Aspects of in situ, in vitro germination and mycorrhizal partners of Liparis loeselii. VIII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged 2002. június 24-27. Acta Biologica Szegediensis, 49(1-2): 137-139. Illyés Z, Szegı D, Rudnóy Sz (2003): A hagymaburok (Liparis loeselii) hazai populációi az európai állományok tükrében. III. Kárpát-medencei Biológiai Szimpózium, 2003. október 28-30, Budapest, Elıadások összefoglalói: 275-278. Bratek Z, Vörös I, Takács T, Parádi I, Rudnóy S, Halász K (2002): Advantages of application of mycorrhizated plants in environment-friendly agriculture and forestations. VII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged 2002. június 24-27. Acta Biologica Szegediensis, 46(3-4): 187-188. Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2002): FLC-like factors in wheat (cv. Mv15) and Conyza sp. VII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged 2002. június 24-27. Acta Biologica Szegediensis, 46(3-4): 45-46. Rudnóy Sz, Bratek Z, Albert L, Barna T, Lásztity D (2000): Kiskunsági fehérnyárasok mikorrhiza viszonyainak feltárása. Kutatói Nap 1998-1999. Szerk.: Horváth B., Baja- Kecskemét-Sopron 2000, Alföldi Erdıkért Egyesület, 94-97. Bratek Z, Albert L, Bagi I, Pálfy B, Takács T, Rudnóy S, Halász K (1999): New and rare hypogeous fungi of Carpathian basin. Actes du V e Congrès International, Science et Culture de la Truffe et des autres Champignons Hypoges Comestibles. 4 au 6 mars 1999, Aix-en-Provence, France, Federation Française des Trufficulteurs, 2.55-56.