Gén technológia a mezőgazdaságban

Hasonló dokumentumok
Gén technológia a mezőgazdaságban

Transzgénikus növények alkalmazása a funkcionális genomikai kutatásokban

A genetikai módosítás növényekben, jelenlegi helyzet, vizsgálati módszerek

Transzgénikus növények alkalmazása a funkcionális genomikai kutatásokban

Nemesítési haladás. Főbb trendek a növénynemesítésben. R. W. Allard (1996) Genetikai elszegényedés és a hasznos gének akkumulációja.

A vírusellenálló transzgénikus növények. Az RNS silencing antivirális rendszer működése.

R. W. Allard (1996) Nemesítési haladás

Transzgénikus növények előállítása

Gén technológia a mezőgazdaságban

GENETIKAILAG MÓDOSÍTOTT SZERVEZETEK ALKALMAZÁSÁNAK VÉLT, ÉS/VAGY VALÓS ELŐNYEI ÉS HÁTRÁNYAI

Antiszenz hatás és RNS interferencia (a génexpresszió befolyásolásának régi és legújabb lehetőségei)

A szamóca érése során izolált Spiral és Spermidin-szintáz gén jellemzése. Kiss Erzsébet Kovács László

Klónozás: tökéletesen egyforma szervezetek csoportjának előállítása, vagyis több genetikailag azonos egyed létrehozása.

TRANSZGÉNIKUS NIKUS. GM gyapot - KÍNA. GM szója - ARGENTÍNA

Géntechnológia a mezőgazdaságban

Többgénes jellegek. 1. Klasszikus (poligénes) mennyiségi jellegek. 2.Szinte minden jelleg több gén irányítása alatt áll

Fehérje expressziós rendszerek. Gyógyszerészi Biotechnológia

GMO = genetikailag módosított organizmusok. 1. Gének megváltoztatása. Gének megváltoztatása. Pécs Miklós: A biológia alapjai

Transzgénikus állatok előállítása

Molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a GMO analitikában és az élelmiszerbiztonság területén

transzláció DNS RNS Fehérje A fehérjék jelenléte nélkülözhetetlen minden sejt számára: enzimek, szerkezeti fehérjék, transzportfehérjék

A preventív vakcináció lényege :

TÉMAKÖRÖK. Ősi RNS világ BEVEZETÉS. RNS-ek tradicionális szerepben

Transzgénikus vírusrezisztencia II. Stratégiák, fajták, előnyök, kockázatok

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

A növény inváziójában szerepet játszó bakteriális gének

Új genetikai stratégia kidolgozása az Arabidopsis stressz válaszát szabályzó gének azonosítására

Kromoszómák, Gének centromer

I. A sejttől a génekig

A genetikai lelet értelmezése monogénes betegségekben

A nagy termés nyomában. Mezőhegyes, szeptember 11.

NÖVÉNYNEMESÍTÉS. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

NÖVÉNYNEMESÍTÉS. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Gelencsér Tímea. Peszticidek alkalmazása helyett ellenálló GMO-k létrehozásának lehetőségei. Készítette: Budapest, 2004

Bioinformatika - egészséges környezet, egészséges élelmiszer

A búza termőterülete és termésátlaga között a Világon

GM-fajta előállítása szabadalomvásárlással

ÉLELMISZERBIZTONSÁG 9.

Silhavy Dániel. A növényi génexpresszió RNS-szintű minőségbiztosítási rendszereinek molekuláris biológiája. című Doktori Értekezésének bírálata.

NÖVÉNYNEMESÍTÉS. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Transzgénikus. nikus állatok. Transzgénikus nikus minden olyan állat, melynek genomja emberi közremk bejuttatott DNS-t t tartalmaz.

Molekuláris terápiák

III/3. Gének átvitele vektorokkal

BIOLÓGIA HÁZIVERSENY 1. FORDULÓ BIOKÉMIA, GENETIKA BIOKÉMIA, GENETIKA

NÖVÉNYNEMESÍTÉS. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Különböző Capsicum annuum var. grossum paprikafajták endofita baktériumainak izolálása, jellemzése és molekuláris biológiai vizsgálata

Az X kromoszóma inaktívációja. A kromatin szerkezet befolyásolja a génexpressziót

Genomadatbázisok Ld. Entrez Genome: Összes ismert genom, hierarchikus szervezésben (kromoszóma, térképek, gének, stb.)

PROGRAMFÜZET. "GENETIKAI MŰHELYEK MAGYARORSZÁGON" XIII. Minikonferencia SZEPTEMBER 12.

Hátterükben egyetlen gén áll, melynek általában számottevő a viselkedésre gyakorolt hatása, öröklési mintázata jellegzetes.

A biotechnológia alapjai A biotechnológia régen és ma. Pomázi Andrea

Genetika 2. előadás. Bevezető

A kromoszómák kialakulása előtt a DNS állomány megkettőződik. A két azonos információ tartalmú DNS egymás mellé rendeződik és egy kromoszómát alkot.

Hamar Péter. RNS világ. Lánczos Kornél Gimnázium, Székesfehérvár, október

Poligénes v. kantitatív öröklődés

Egy új, a szimbiotikus gümőfejlődésben szerepet játszó ubiquitin ligáz funkcionális jellemzése

Mit tud a genetika. Génterápiás lehetőségek MPS-ben. Dr. Varga Norbert

Génmódosítás: bioszféra

A géntechnológia genetikai alapjai (I./3.)

Növényvédelmi Tudományos Napok 2014

A C. elegans TRA-1/GLI/Ci szex-determinációs faktor célgénjeinek meghatározása és analízise. Doktori értekezés tézisei.

Genetika 3 ea. Bevezetés

NÖVÉNYGENETIKA. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Biomassza alapú bioalkohol előállítási technológia fejlesztése metagenomikai eljárással

Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés és validálása a MANGFOOD projekt keretében

RNS-ek. 1. Az ősi RNS Világ: - az élet hajnalán. 2. Egy már ismert RNS Világ: - a fehérjeszintézis ben résztvevő RNS-ek

TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben

Juhász Angéla MTA ATK MI Alkalmazott Genomikai Osztály SZEKVENCIA ADATBÁZISOK

1.ábra Az intront tartalmazó génkonstrukció felépítése.

NÖVÉNYNEMESÍTÉS. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

BMGE, Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok, 2009 Transzformációs módszerek

Precíziós nemesítés Kulcs az agrárinnovációhoz Szerkesztők: Balázs Ervin és Dudits Dénes Agroinform Kiadó és Nyomda Kft., Budapest, 2017.

NÖVÉNYVÉDELEM. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

NÖVÉNYÉLETTAN. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Epigenetikai Szabályozás

4.4 BIOPESZTICIDEK. A biopeszticidekről. Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai

Molekuláris genetikai vizsgáló. módszerek az immundefektusok. diagnosztikájában

Intelligens Rendszerek Elmélete. Párhuzamos keresés genetikus algoritmusokkal

A növényi génexpresszió RNS-szintű minőségbiztosítási rendszereinek molekuláris biológiája. Silhavy Dániel

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM. Természetes és mesterséges agrobaktérium rezisztencia vizsgálata szőlőben. Galambos Anikó

Biológiai biztonság: Veszély: - közvetlen - közvetett

A PKU azért nem hal ki, mert gyógyítják, és ezzel növelik a mutáns allél gyakoriságát a Huntington kór pedig azért marad fenn, mert csak későn derül

A vírusellenálló transzgénikus növények. Az RNS silencing antivirális rendszer működése. (A silencing-független vírusellenállóság genetikai alapjai)

Biológiai feladatbank 12. évfolyam

Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

A transzgénikus (GM) fajták fogyasztásának élelmiszer-biztonsági kockázatai

3. Általános egészségügyi ismeretek az egyes témákhoz kapcsolódóan

Heszky László Transzgénikus növények - az emberiség diadala vagy félelme?

GOP

Génkifejeződési vizsgálatok. Kocsy Gábor

PRECÍZIÓS GÉN- ÉS GENOMSZERKESZTÉS AZ ÉLHETŐBB VILÁGÉRT a Magyar Tudományos Akadémia állásfoglalása

NÖVÉNYGENETIKA. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Immunológia 4. A BCR diverzitás kialakulása

Kétszikű ill. kertészeti növényfajokon folytatott kísérletek. Dohány Burgonya Alma Nyárfa Szőlő Szegfű Repce Lucerna

A FISH technika alkalmazása az előnemesítésben

c. Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei BUKOVINSZKI ÁGNES Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola

A genetikailag módosított növények termesztésének környezeti kérdései

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Átírás:

Gén technológia a mezőgazdaságban Mészáros Klára Magyar Tudományos Akadémia Agrártudományi Kutatóközpont 2016. december 6. Mészáros Klára

Milyen elvárásoknak kell megfelelni az új fajtáknak? Környezeti adaptáció: Abiotikus stressz rezisztencia Biotikus stressz rezisztencia Termőképesség Beltartalmi elvárások Mennyiségi tulajdonságok 2016.12.06. Mészáros Klára

Hagyományos keresztezéses növénynemesítés A genetikai variációk felkutatása: Nemzetközi együttműködés, alapanyag csere: egzotikus források Saját törzsek és fajták Génbank: tájfajták, régi fajták. Vad és termesztett rokon fajok Szülők kiválasztása: Fajta előállítás: Adaptábilis törzsek kiválasztása Forrás előállítás: Extrém genotípusok kiválasztása Új genetikai variáció létrehozása: az utódok között a transzgresszív szegregáció vizsgálata, új tulajdonságokat hordozó genotípusok szelektálása Szaporodásbiológia Genetikai 2016.12.06. Mészáros Klára

Növénynemesítés új feladatai Növénytermesztés hatékonyságának és a termésbiztonság növelése speciális termesztési rendszerek biztosítása (herbicid tolerancia) biotikus stressz tolerancia növelése környezeti adaptáció és abiotikus stressz tolerancia javítása. Fagyállóság, hő-és szárazságtűrés javítása Víz (WUE) és nitrogén hasznosítás (NUE) javítása, Funkcionális élelmiszer alapanyag előállítására alkalmas növényfajta Bioenergetikai célra alkalmas növények nemesítése Technológiai rendszerekre adaptált és/vagy nemesített fajták (gyógyszer alapanyag, oltóanyag) sejt fermentorokban szántóföldi növénytermesztésben 2016.12.06. Mészáros Klára

Hagyományos nemesítés korlátai Keresztezhetőség határai Genetikai kapcsoltság hátrányos tulajdonsággal Több évtizedig tartó nemesítés A termesztett növények és tenyésztett állatok csak azokkal a tulajdonságokkal rendelkeznek melyek génjeikben kódoltak. Új módszerek keresése: BIOTECHNOLÓGIA 2016.12.06. Mészáros Klára

Növényi biotechnológia fő területei Molekuláris biológiai technikák: Strukturális és funkcionális genom analízis Molekuláris ujjlenyomat készítése Markerszelekció (MAS): Génpiramidálás BC a rekurrens szülői tulajdonság szelektálásának felgyorsítása Fenotípusosan ritkán vizsgálható tulajdonság esetén QTL-analízis Pedigree analízis Genom szekvenálás: Arabidopsis thaliana 800 millió nukleotid Kukorica 3,9 milliárd nukleotid Búza 17,0 milliárd nukleotid Gén expressziós vizsgálatok Transzgénikus technikák vagy GÉNTECHNOLÓGIA 2016.12.06. Mészáros Klára http://www.illumina.com Bead Array leolvasó (SNP-re)

Marker kapcsoltsági térképek Két szülős térképező populációk Széles genetikai bázist képviselő fajtakör Jelölt gén megközelítése Gén azonosítás főbb módszerei Genom pozíció függő stratégiák: pozicionális klónozás, deléciós vonalak Összehasonlító genomikai stratégiák: modell növények Mesterséges genetikai variáció (indukált mutációs populációk) Gén expressziós mintázatok elemzése: Differential Display DNS microarray, DNS chip 2016. december 6. Mészáros Klára

Genomok és genemböngészők + szekvenciaelemzés Szekvenciaelemzés Genomok, kromoszómák és böngészők Primertervezés A gén értelme gén ontológai (GO) Funkcionális annotáció: in silico predikció (homológia alapján), génexpresszió (korreláció alapján), fehérje-fehérje interakció ( guilty by association ) közvetett módszerek Fehérje: UNIPRO Nukleinsav: EBI NCBI És itt a cross references Makai Szabolcs

Géntechnológia Géntechnológia: a sejtmagban vagy a sejtorganellumokban (mitokondrium, plasztiszok) meglévő genetikai program megváltoztatása molekuláris genetikai módszerekkel. Genetikai transzformáció: idegen származású DNS bevitele a növényi genomba hagyományos szexuális út kikerülésével, génátviteli módszerek alkalmazásával. Transzgénikus vagy genetikailag módosított (GM) élőlény: a genomjába idegen származású gén bejuttatása géntechnológiai módszerrel, amely a genomba integrálódik, működik és öröklődik. Ezáltal a GM élőlény idegen származású fehérjét termelnek. Ciszgénikus növény: saját vagy rokon fajból származó gén bejuttatása géntechnológiai módszerrel. 2016.12.06. Mészáros Klára

Növények genetikai transzformációja Vektorok: riporter, szelekciós, hasznos, a beépüléshez és működéshez szükséges szekvenciák Transzformációs technika: Transzformálható fajták: Közvetlen: A DNS-t közvetlenül juttatjuk be a befogadó szervezet sejtjeibe Közvetett: A DNS bejuttatása közvetítő organizmusok segítségével történik Célpont: sejt, protoplaszt, szövet, növény Hatékony in vitro regenerációs rendszer Transzformálás transzgénikus növény regenerálása Transzgén beépülésének és működésének kimutatása Transzgénikus növény felhasználása 2016. december 6. Mészáros Klára

Biolisztikus transzformáció, génágyú Aranyszemcse mérete (0.4-1.2 um) és mennyisége (29-235 ug/lövés) A mirohordozóra vitt oldat összetétele 2.5-20 ug plazmid vagy lineáris DNS 8-16 mm spermidin 0.2-1.9 M Ca 2+ ion a He gáz nyomása (4.5-7.6 MPa, 68-71Hgmm a kamrában) A lövési távolság (2.5-5.5 cm) Nagy nyomású He gáz 2016. december 6. Mészáros Klára

Indirekt, Agrobacterium közvetített transzformáció Agrobacterium tumefaciens és Agrobacterium rhizogenes talajban élő Gram-negatív baktérium, sebzési helyeken gyökérgolyvásodást vagy hajszál gyökeresedést okoz (crown gall) Gazdakörük rendkívül széles A növény sérülésekor felszabaduló jel érzékelése mozgás és kapcsolódás sérült növényi sejtekhez Kétkomponensű érzékelőrendszer aktivációja a transzfer (T-)DNS kivágásához, A baktérium- és növényi sejt közötti átjáró létrehozása DNS-fehérjekomplex felépítése és bejuttatása a növényi sejtbe, A komplex beszállítása a sejtmagba, és a DNS beépítése a növényi kromoszómába. 2016. december 6. Mészáros Klára

Biolisztikus A bejuttatott DNS mennyisége nagy: Több kópiában történő beépülés Komplex átrendeződést Génexpresszió gátlása Agrobaktériumos transzformáció A sejtbe legfeljebb csak néhány T-DNS molekula jut be: Alacsonyabb kópiaszámban épül a genomba Csökkenti a szerkezeti átrendeződések esélyét Növeli a génexpresszió valószínűségét A beépülés helye véletlenszerű: hátrányos lehet a gén működésére A belövés során fragmentálódik a DNS: nagy molekulatömegű DNS nem juttatható be A transzgén beépülése a transzkripciósan aktív régiókba preferáltan történik Nagy molekulatömegű DNS bevitele lehetővé teszi egy lépésben több gén beépítését 2016. december 6. Mészáros Klára

Növény transzformáció főbb lépései Explantum izolálása, előkészítése T Genetikai módosítás Kallusz indukció Regeneráció 3 óra + 3 nap Tranziens génexpresszió Riporter gének 18 nap 3 hét Első szelekció Szelekciós gén beépülése és 3 hét múködése Második szelekció 3 hét Kiültetés Hasznos gén beépülése és működése 2016. december 6. Mészáros Klára

Transzgén kimutatása a transzformáció folyamatában 1. Tranziens génexpresszió kimutatása 2. Integrálódott gén jelenlétének kimutatása 3. A beépült kópiaszám meghatározása 4. A gén által expresszált termék jelenlétének és mennyiségének detektálása, mérése 5. A génbeépülés helyének meghatározása 2016. december 6. Mészáros Klára

Gének működésének vizsgálata Hasznos géneket visznek át egyik szervezetből a másikba A transzgénikus élőlényekkel kapcsolatos kockázat elemzés

Transzgénikus növények alkalmazása a funkcionális genomikai kutatásokban Gyakorlatban alkalmazható transzgénikus növények létrehozásának alapfeltétele: a genomban kódolt gének funkcionális ismerete - funkcionális genomika Funkcionális annotáció: in silico predikció (homológia alapján), génexpresszió (korreláció alapján), fehérje-fehérje interakció ( guilty by association ) közvetett módszerek Génfunkció megbízható megérétéséhez mutáns génváltozatokra (természetes vagy indukált) van szükség. Forward genetika: mutáns fenotípust okozó gént keressük Reverz genetika: az ismert génhez keressük a funkciót pl. knockout technika A large-scale kísérleti technikák (transzkriptóm, proteóm analízis, etc.) kombinációja a genom ismeretére épülő genetikai eszközökkel A kérdéses génekben előidézett mutációk jellemzése: klasszikus fenotípus analízis (pl. fejlődési rendellenességek) Dóczi Róbert

Transzgénikus növények a funkcionális genomika szolgálatában Állati kísérleti rendszerekben (egér) irányított knockout mutánsok hozhatóak létre: helyspecifikus homológ rekombináció működik. Növényekben nem, a transzgén beépülése random. A reverz genetika lehetőségeinek kihasználása a növénybiológiában csak nagyszabású projektek keretében valósulhattak meg: T-DNS inzerciós mutánskollekciók kialakítása: több tízezer független transzformáció, a T- DNS beépülés helyének utólagos megállapítása a határoló szekvencia alapján. Nyilvános projektek: a vonalak szabadon hozzáférhetőek a tudományos közösség számára. A transzgénikus növények igazi sikertörténete. Dóczi Róbert

A modellnövény Arabidopsis thaliana a növénybiológia egere kis méret (5-10 cm átmérőjű rozetta, 20-25 cm magas) rövid generációs idő (6-8 hét alatt magok foghatóak) önporzó, de idegentermékenyülő is ideális genetikai analízis céljából kis genom méret (120Mb, 5 kromoszóma, 27 000 gén) teljes genom szekvencia ismert 2000 óta (első növényi genom) a szekvencia közzétételekor a kódolt gének mindössze 10%-ának volt ismert funkciója egyszerű, gyors, hatékony transzformáció (flower dip - virág merítés) Dóczi Róbert

T-DNS inzerciós mutagenezis ( knockout technika) vizsgált gén genomi DNS - vad típus Arabidopsis átlagos gén méret: 1,5-2 kb T-DNS (4-5 kb) genomi DNS T-DNS beépüléssel A beépült 4-5 kb méretű T-DNS képes drasztikusan csökkenti a transzkripció hatékonyságát (kimutathatósági határ alá). A keltkezett transzkriptumok korai STOP kodonokat tartalmaznak. jelenleg közel 400 000 T-DNS inzerciós Arabidopsis vonal elérhető Dóczi Róbert

Inzerciós növényanyagok kísérleti felhasználásának követelményei Egy T-DNS mutagenizált növényvonalban több mint egy, egymástól független beépülés is lehet a SALK vonalak átlagos inzert száma 1,5 igazolni kell, hogy a megfigyelt fenotípusok valóban a vizsgált génben bekövetkezett mutáció okozza: független mutáns vonalak fenotípusainak összehasonlítása az Arabidopsis genom megfelően telített T-DNS mutánsokkal, hogy két vagy több független T-DNS mutáns elérhető legyen egy génben komplementáció: a mutáns vonal felültranszformációja a vizsgált gén vad típusú változatával (fenotípus visszaállítása) eltérő rezisztencia marker fontos! kondicionális komplementáció: a knockout háttérbe transzformált konstrukció csak részleges funkcióvesztést okoz (pl. csökkent enzimaktivitás, kötőhely megszüntetése) specifikus funkciók részletes analízisét teszi lehetővé túltermeltetés: vad típusú háttérben erős konstitutív promóterrel (pl. 35S) expresszáltatott transzgén ellentétes fenotípus a KO vonalhoz képest visszakeresztezés vad típusba: együtt szegregál-e a fenotípus és a genotípus? Dóczi Róbert

vektor (gyűjtemény) T-DNS inzerciós mutagenezis: több mint knockout különböző rezisztencia markerek Knockout mkk2, mkk3 knockout knock-up: a 35S promóter 5 upstream beépülése RB 5 ATG (START) STOP 3 35S p GÉN antiszensz: a 35S promóter 3 bépülése, komplementer szál átírása 5 ATG (START) STOP 3 GÉN RB 35S p knockout promoter trap: A GUS riporter egy promóter mögé épül be specifikus expressziós mintázatú promóterek izolálhatóak 2015. október 15. Dóczi Róbert

Alternatív transzgénikus génfunkció vizsgálati módszerek Génelcsendesítés egyéb módszerei Knockout mutáns hiányában: Géncsendesítésen alapuló módszerek: Hogyan érhetjük el? antiszensz, sirna, amirna hátránya: nem teljes expresszióvesztés, független vonalakban a géncsendesítés mértéke eltérő, generációnként szintén változó mértékű a transzformáns növényanyagok gondos jellemzése elengedhetetlen Túltermeltetés: önmagában kevésbé elfogadott bizonyíték a nagy mennyiségben jelenlévő fehérje aspecifikus hatásokat okozhat; megjelenik olyan sejttípusokban, és fejlődési stádiumokban is, amikor a vad típusban nem MKK2, MKK3

Alternatív transzgénikus génfunkció vizsgálati módszerek promóter:riporter konstrukcó alkalmazása: a génexpressziós vizsgálatok transzgénikus növények létrehozásán alapuló speciális módszere: közvetett (korrelatív természetű) információt nyerhetünk önmagában nem funkcionális bizonyíték, segíti a génmutáción alapuló eredmények értelmezését; kiegészítő információ MKK3 promóter riporter NosT saját promóter szekvencia által szabályozott riporterfúzió: a riporter segítségével a gén expresszióját, a fehérje stabilitását és sejtbéli lokalizációját is nyomon követhetjük A poláris auxin transzport mechanizmusinak feltérképezése promóter ATG (START) STOP STOP GÉN riporter NosT Dóczi Róbert

Tudástranszfer: T-DNS kollekciók készítése más fajokban is megkezdődött feltétel: szekvenált genom pl. rizs, Brachypodium (modell gabona) ismert gének (pl. Arabidopsis ortológok) túltermelése vagy csendesítése gazdasági növényekben Géncsendesítési módszerek közül jelenleg a leghatékonyabb: mesterséges mikro RNS (amirna) konstrukció bejuttatása géncsaládok párhuzamos csendesítésére is alkalmas technika Arabidopsis KO vonalak keresztezése redundáns gének funkcionális vizsgálatára bevett gyakorlat Dóczi Róbert

A transzgénikus növények gyakorlati alkalmazása

Az RNS silencing antivirális rendszer működése és a silencing-alapú transzgénikus vírusellenállóság Avagy hogyan védhetjük meg a haszonnövényeket a vírusoktól? Vírusfertőzés mértéke elérheti vagy meghaladhatja a 46%-ot - Vírus vektorok kiirtása (inszekticidek stb.) -Vírusellenálló növények termesztése. Olcsó, környezetbarát alternatíva. A vírusellenálló növény legalább egy lépését gátolja a vírus fertőzési ciklusnak, -vírus vektor fertőzést -replikáció a primary infected sejtekben -sejtről-sejtre mozgást -szisztemikus mozgást Virológusok: Vírusrezisztens a növény, -ha a vírus nem képes replikálódni az elsődleges fertőzött sejtekben, -vagy ha nem tud sejtről-sejtre, illetve szisztemikusan mozogni Silhavy Dániel

Vírusrezisztencia típusok Természetes rezisztencia A rezisztencia gének hagyományos úton bevihetőek Kell rezisztencia forrás és szelekciós rendszer Genetikai módosításon alapuló rezisztencia A rezisztencia gének transzformációval építhetőek csak be Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus (genetikai variabilitás, hagyományos nemesítés) Poligénes Monogénes Ált. quantitatív rez. Recesszív!! Domináns ritkán használt, de 1/3 2/3 pl. MSV mastrevírus jó R-gén!!! Inhibitor! Általános antivirális rendszer (RNS silencing,rnai) (genetikai variab. nincs hagyományos nemesítéshez rossz, biotechnológiai nemesítés) Silhavy Dániel

Pathogen derived resistance A PDR koncepció Cél: Idegen gén beépítésével vírusellenállóvá tenni a növényt. Elvben nagyon sokféle gén alkalmas lehet rá, pl dsrns vírusok ellen dsrns kötő fehérjék termeltetése. Gyakorlatban egy domináns típus: Pathogen derived resistance (PDR) PDR általános mesterséges védekezés lehet bármely patogén ellen (vírus, gomba, baktérium). Elv: fertőzéshez patogén fehérjék (és RNS-ek) megfelelő mennyisége és minősége kell. A növényekben PDR-alapú transzgénikus vírusrezisztencia kétféle módon is elérhető, virális fehérje, illetve RNS termeltetésével!!!! Az RNS-alapú hatékonyabb!!!! RNS silencing Silhavy Dániel

A növényi vírus és aberráns RNS indukálta sejt-szintű RNS silencing útvonalak A növényi RdRP aberráns mrns-ként ismeri fel azokat a transzkripteket, amelyeknek nincs cap-je vagy polya farka, ilyenek az srns vágástermékek. RdRP ampl. regulált, különben 1 hibás mrns minden hasonló mrns-t eltüntetne.

Transzgénikus vírus rezisztens növények 2 Virális szekvenciák fordított ismétlődésként transzgénről expresszáltatva Transzgén, cprns TEV aberráns virális RNS CP intron PC Transzgén, vírusdarab fordított ismétlődésben Hairpin RNS Növény RdRP dsrns Fertőzés vírusszekvencia srns dsrns DICER RISC RISC Vírus + RNS RISC Vírus RNS degradáció Jóval hatékonyabb, dsrns képzéshez nem kell RdRP!!!! Több srns, Több virális srns-risc, hatékonyabb védettség!!!

RNS interferencia NAIK-MBK mirns útvonal sirns útvonal A növény védekező mechanizmusa vírus dsrns indukálja sirns (21-25 nt) OFF-target 15 C alatt nincs A növény endogén szabályozási mechanizmusa mirns prekurzor indukálja mirns (21-24nt) OFF-target 15 C alatt is Jenes Barnabás

Mesterséges mirns (amirns) technológia NAIK-MBK Egy prekurzor bármilyen célszekvenciára átalakítható (endogén gén, vírus) Másodlagos szerkezet megtartásával Szekvencia-specifikus és hatékony géncsendesítés A vírus adaptációjának elkerülése és a hatékonyság növelése érdekében több célszekvenciára specifikus amirns-t tartalmazó prekurzor összeépítése A mirns prekurzor átalakítása Policisztronikus amirns konstrukció

Vírus célszekvenciák keresése NAIK-MBK Wheat dwarf virus árpa és búza törzsek Rep (replikáz) és MP (mozgási fehérje) génjeinek összehasonlítása Potenciális target helyek ráillesztése Konzervatív target helyek kiválasztása Ezekre specifikus amirns szekvenciák meghatározása WDV Rep összehasonlítás (részlet) WDV MP összehasonlítás (részlet)

Vírus célszekvenciák keresése Megfeleljen az adott mirns/mirns szerkezet szekvenciaösszetétel és energetikai követelményeinek A vírusfertőzés szempontjából nélkülözhetetlen régió legyen Ne okozzon of-target hatást A rezisztencia kialakulásának gátlására több célszekvenciát kell beépíteni Sok vírustörzzsel szemben rezisztenciát kell biztosítani

Policisztronikus amirns NAIK-MBK VirusBuster171 WDV replikáz specifikus amirns-eket tartalmazó prekurzorok összeépítése eg konstrukcióba

Árpa transzformáció NAIK-MBK Éretlen árpa embriók fertőzése AGL-1 Agrobacterium törzzsel pcubivirusbuster171 vektorral 77 db PCR+ T 0 árpanövény 19 önálló vonal

Vonalak analízise VB8 VB20 WDV1 Mock

A recesszív rezisztencia gének és a CRSPR-alapú transzgénikus vírusellenállóság R-gén alapú rezisztencia gyakori mindenféle patogénnel szemben Recesszív monogénes főleg csak virális patogének ellen hasznosak. A vírusok a gazda génexpr. rendszerét használják. Model: rec. rezisztencia passzív, a gazda egyik olyan faktora hiányzik, ami a vírusnak kell Silhavy Dániel

A mrns stabilitását biztosító Cap-PABP ribonukleoprotein (RNP) komplex felépítése A cirkuláris struktúra -transzláció iniciációját segíti, -védi a mrns-eket az exonukleázoktól! -eif4e vagy eif(iso)4e fehérjék kellenek az egyes vírusok replikációjához -eif4e vagy eif(iso)4e hiány nem okoz komoly gondot Azaz ha tudunk csinálni eif4e vagy eif(iso)4e hiányos növényeket, ezek minden az adott faktort igénylő vírus ellen ellenállóak lesznek

CRISPR/Cas9 rendszer-eredetileg baktériumok DNS vírusok védekezési rendszere, de eukariótákban hatékony, specifikus mutációs rendszerként használható!!! Cas9 vágja a guide RNS-sel komplementer régióban vágja a DNS-t, a reparáció során hibák, mutáció. Ha egy növényben termeltetünk Ca9-et és egy guide RNS-t, a guide-dal komplementer DNS-t mutáltathatjuk

RNS silencing alapú transzgénikus rezisztencia: Minden vírus ellen alkalmazható Több, teljesen eltérő vírus ellen hatékony Domináns jelleg Transzgénnek a növényben folyamatosan működnie kell: Törvényi szabályozás szempontjából mindenképpen transzgénikus CRISPR/Cas9 alapú transzgénikus rezisztencia: Csak ott alkalmazható, ahol ismert a gazdafaktor ami kell a vírusnak (kevés ilyen) Minden az adott faktor igénylő vírus ellen jó Recesszív, csak homozigótaként működik A genetikai módosítás utána transzgénnek nem kell jelen lenni: Törvényi szabályozás szempontjából nem feltétlen transzgénikus

A KUKORICA ROVAR-REZISZTENCIA JAVÍTÁSÁNAK LEHETŐSÉGEI Kukoricamoly és kukoricabogár rezisztens hibridek: Bacillus thüringiensis (Bt) baktérium által termelt delta-endotoxint kódoló génszakaszt építették be. Bt baktérium különböző törzsei többféle kristályos toxint termelnek, melyek más és más rovarfajokra hatnak. 1999-ig 130-féle gént, ill. fehérjét azonosítottak, melyek mindegyike csak egy, vagy csak néhány rovarfajra toxikus. 2016.12.06. Marton L. Csaba

Agronómiai tulajdonságok Biotikus Stressz Rovar rezisztencia Bt kukorica Betegségellenállóság vírus, baktérium, gombal, fonálféreg Liszthatmattak szemben ellenálló búza Gyomirtószer rezisztencia Abiotikus Stresss Szárazság, hideg, meleg, sós talaj, sovány talaj Minőségi tulajdonságok Nitrogén asszimiláció, Keményítô bioszintézise, O 2 asszimiláció Feldolgozhatóság Kereskedelmi élettartam Reprodukció: szexuális határok, hímsterilitás, magnélküli termés Tápanyagtartalom Makro: Fehérje, szénhidrát, zsírok, rost Mikro: Vitaminok, ásványi anyagok, antioxidánsokstb Káros anyagok: allergenek és toxinok eltávolítása Íz, illat Rost, minôség, szilárdság, természetes színek Felépítés Dísznövények: szín, kereskedelmi élettartam, morfológia Új növényi termékek Olajok Fehérjék: gyógytápanyagok, terápiás anyagok, vakcinák Polimerek

Olajok Megváltoztatott telítettségű és összetételű zsírsavak Fehérjék Enzimek - Észteráz (nyúl májból) búza endospermiumban Vakcinák» Hepatitis B v. banánban» Cholera toxin B. v. rizsben (saját eredményeink) Polimerek Műanyaggyártás

EURO bankó GM gyapotból Sör GM sörélesztő Sajt tejoltó enzim (rennin) GM élesztőből Szennyezett talaj tisztítása GM baktériummal Mosószer GM baktériumban Olajszennyeződés GM baktériumok bontják Inzulin GM baktériumban Véralvadási faktor GM baktérium

Az infarktus utáni vérrögöket oldó hatóanyag A vérképzést segítő eritropoetin A tüdőtágulás kezelését szolgáló alfa-1- antitripszin Számos vakcina (veszettség, hepatitis B, stb.) A fájdalomcsillapítók 80%-a, az asztmagyógyszerek 60%-a, a depressziót kezelő hatóanyagok 62%-a, a migrén megszüntetését segítők 52%-a és a skizofrénia kezeléséhez használt gyógyszerek 60%-a is.

Engedélyeztetés az EU-ban A GM-termékek (GMO-k, GMO-t tartalmazó vagy a GMO-val előállított termékek) piacra történő kibocsátását az EU-ban engedélyeztetni kell. EFSA (European Food Safety Authority, Parma, Olaszország) tudományos alapon végzi a GM-termékek kockázatértékelését, az engedélyezés az Európai Bizottságra és a Tagállamokra, mint kockázatkezelőkre hárul. GMO Panel és Szakértői Munkacsoportjai Kockázatbecslés lépései Az európai és amerikai megközelítés közötti különbség Gelencsér Éva

Az érvényben lévő új Alkotmány XX. cikke (2) bekezdése. Kísérleti célból lehetséges szabadföldön engedély kérés után, a rendszabályok betartásával. Vetőmagpiaci pozíció, GM mentes előny megtartása fontos Európában 2. legnagyobb kukorica vetőmagexportőr ország vagyunk. Az elsőgenerációs GM növények 20 évvel ezelőtti technológia termékei. Jenes Barnabás

Kloroplasztisz GM növények előállítása A beépített gén a zöld színtest önálló genetikai anyagába (plasztom) kerül A plasztom a sejtmagi kromoszómáktól független öröklődést mutat A plasztom (és a beépített transzgén is)szigorúan anyai öröklődést mutat tehát a virágporral nem jut át más növényekbe A sejtenként csaknem 10.000 génkópia a leghatékonyabb élő biorekatort biztosíthatja (lásd gyógyszer hatóanyagtermelés) Jenes Barnabás

RNS alapú géncsendesítési technológiák elterjedése Ebben az esetben a beépített transzgén alapján a növény már nem termel új fehérjét, a termelődő RNS molekulák meglévő növényi gének működését módosítják Jenes Barnabás

Köszönöm a figyelmet! Sikeres felkészülést a vizsgára!