Molekuláris / Mikrobiális rátermettség g tájkt jképek Kun Ádám
Rátermettség g tájkt jkép Minden genotípushoz rendeljünk nk egy fenotípust Minden fenotípushoz rendeljünk nk egy valós számot, ami a rátermettsr termettsége A genotípusok közötti k távolst volság g a Hamming távolság A tájkép magassága maga a rátermettsr termettség
Miért jók j k a molekuláris / mikrobiális tájkt jképek? Gyors szaporítás/szaporod s/szaporodás Környezet jobbára állandósítható Nincs (korlátozott) az egyedfejlődési zaj A genotípus és/vagy fenotípus mérhető A rátermettsr termettség g mérhetm rhető
Molekuláris rátermettsr termettség g tájkt jkép Enzimek aktivitása kihat az egyed rátermettségére. re. Az enzim aktivitás s könnyen k mérhetm rhető (az egyed rátermettsr termettsége nem) Az enzimek könnyen k mutálhat lhatóak ak és szaporíthatóak Az enzimek fenotípusa a 3D szerkezetük
Legegyszerűbb tájkt jkép rátermettség Fentipusos jelleg
Fuji hegy tájkt jkép rátermettség Fentipusos jelleg
Két t csúcs rátermettség Fentipusos jelleg
Mi van ha 3D-t t nézünk? n nk?
RNS másodlagos m struktúra ra Neurospora VS ribozim 144 nukleotid hosszú
RNS másodlagos m szerkezet Bázispárok számától l függ f a szabadenergia. Dinamikus optimalizáci ció a bázispb zispárok számának maximalizálására (energia minimalizálására) A bázispb zispárok energetikáját t kísérletesen k vizsgálj lják
RNS másodlagos m szerkezet meghatároz rozás Szekvencia R=r 1, r 2, r 3,..., r n ; ahol r i {A,C,G,U} Másodlagos szerkezet S = i.j bázispárok rendezett halmaza 1. 1 i < j N 2. j - i>3 3. i.j és k.l bázispárokra (i<k) igaz az egyik: a) i=k és j=l (ugyanaz a bázispár) b) i<j<k<l (egymás után jönnek) c) i<k<l<j (i.j magába foglalja k.l-t) Keressük a legalacsonyabb energiájú (vagy ahhoz közeli) szerkezetet, feltehetően ez a másodlagos szerkezete egy RNS molekulának
Másodlagos szerkezet energiája A srtruktúra energiája a hurkok energiájától függ Bármely struktúra egyértelműen felbontható m+1 (m a bázispárok száma) hurokra hajtűkanyar halmozódó bázispár kitüremkedés belső hurok elágazás A struktúra energiája, így az egyes hurkok energiájának összege m e L E S i 0 i
Szerkezet a fenotípus A másolm solási si sebesség, vagy az enzimatikus aktivitás s a struktúrától függ. Egy RNS molekula fenotípusa nem a bázissorrend, hanem a struktúra. ra. 4 N szekvencia lehetséges, mennyi struktúra? ra? Hogyan határozzuk meg a struktúrát
RNS tájkt jképek Kémiailag és s fizikailag megalapozott genotípus pus-fenotípus térkép Ilyen máshol m még m g nincs a biológi giában
RNS tájkt jképek tulajdonságai I Körülbelül l 2.35 N struktúra, ra, azaz egy struktúrához több t szekvencia tartozik. Kevés s mutáci ció (1-3) általában nem változtatja meg a struktúrát Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, nk, akkor az átlagosan 7.2 mutáci cióval olyanná alakíthat tható,, hogy kívánt k MFE struktúrája legyen
RNS tájkt jképek tulajdonságai II Mesterkópia: AUCGUCUGUCGGCGAU Mutáns: GCAUGACUCAUUAUGC Azonos struktúra Azonos fitness Semleges utak a tájképen Az utak 21.7%-a perkolál
Gyakoribb struktúrák (((((...)))))... ((((((...))))))......((((((...))))))...(((((...))))) ((((((...))))))......(((((...))))). (((((((...)))))))......((((((...)))))).(((((...)))))......(((((((...))))))) (((((((...)))))))......(((((((...)))))))...((((((...))))))..((((((...))))))... ((((((...))))))... 0.014641 0.012883 0.011643 0.010716 0.009548 0.007631 0.007611 0.007594 0.007503 0.007433 0.007084 0.006633 0.006577 0.006296 0.006246
Gyakoribb struktúrák Struktúra osztály gyakoriság (darab) 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 1 10 100 1000 10000 Gyakoriság rang (logaritmikus)
RNS tájkt jképek tulajdonságai III Vannak gyakoribb struktúrák A szekvenciák k zöme z gyakori struktúrát vesz fel (evolválódott ribozimek gyakoriak) ribozimek minden bizonnyal A struktúrák k zömét z t csekély számú szekvencia veszi fel Minden szekvencia körüli k kb. 20 mutáci cióval elérhet rhető gömbön n belül l minden gyakori struktúra ra elérhet rhető
Ribozimok rátermettsr termettség g tájkt jképe A rátermettsr termettség g tájkt jkép kísérletes adatokra épül Rátermettség g tájkt jképek általános szerkezetének vizsgálata Feltételezz telezzük, hogy az enzimaktivitás arányos a rátermettsr termettséggel (protosejt sejt)
Mely ribozimok jöhetnek j szóba? 1. Jól l karakterizált Csak a természetes ribozimok teljesítik ezt a kritériumot 2. Nem túl t l hosszú (pra praktikus ok) Az I-es és II-es csoportbeli intronok kiesnek 3. Nem lehet a transz ható enzim szerkezetben pszeudo eudo-csomó (algoritmus követelménye) Hepatitis Delta Virus kiesik e miatt Neurospora VS Ribozyme, Hairpin, Hammerhead
Neurospora Varkund Satellit Ribozim IV V N = 144 5 3 c a ugaaauug -U- CguAgCAGU U u g acuuuaac GUaUUGUCA C U ug G A 710 670 U G 700 C-G U A U C-G III A-U C-GA 660 U-A A gcgguaguaagc AgGA A 720 650 730 740 C-G GCU AA GUG-A-CGGuAuUggc g uaagag cguucg-ccc u GAACACGA CAC GUUaUgAcug a GAC a 640 780 II 680 770 A pozíciók 83/144 (57%) mutálva van, mi összesen 183 mutánst vettünk figyelembe 690 760 VI 750
VS Ribozim: mutáci ciós s kísérletekk 144 nukleotidból 87-en végeztek mutációs kísérletet Összesen 183 mutánst vizsgáltak
VS Ribozim Elágazások fontosak Aktív hely Hossz nem fontos Hossz nem fontos Kitüremkedés nem lehet a másik száron, de törölhető Szubsztrát kötés
Hajtűkanyar ribozimim N = 50 5 3 H1 H2 H3 H4 1 10 aaacagagaagucaaccag A G A A 30 A C A CACG loop A loop B AUGGUc C AUUAUAUG GUG u u 50 20 40 A pozíciók 39/50 (78%) mutálva van, összesen 142 mutáns vettünk figyelembe
Ribozimokkal kapcsolatos általános megfigyelések 1. A szerkezet a fontos, nem az egyedi bázispb zispárok 2. A szerkezet kissé változtatható 3. Vannak kritikus helyek 4. A tájkt jkép multiplikatív (lehet hogy van egy gyenge szinergia)
Mutáci ció fajtái Semleges mutáns Kritikus hely Rontó mutáci ció Visszaáll llító
Általános funkcionalitás s tájkt jkép Rendeljen minden lehetséges 4 N szekvenciához egy relatív v enzimaktivitást I. Kompatibilis szerkezet II. Hibás s bázispb zispár III.Kritikus helyek IV. Jósolt struktúra ra sequence structure misspair critical energy
Többszörös s mutáci ciók k kérdk rdése Legegyszerűbb feltevés, hogy a hatások függetlenekf A kevés s rendelkezésre álló adatból l ez nagyjából l igaznak vehető.. Van egy kis pozitív v hatás s (azaz a 2. mutáci ció negatív hatása kisebb, mint várnánk) nk) Measured activity 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Equation: y = a*x^b Chi^2/DoF = 0.00617 R^2 = 0.96299 a 1.10171 ±0.0598 b 0.90554 ±0.10992 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Calculated activity
I. Kompatibilis szerkezet A célstruktc lstruktúrának megfelelő bázis-párok mindegyike legtöbbje ki tud-e e alakulni? Néhány hibás s pár p (rosszul párosp rosított bázispár) megengedhető, de Nem lehet kettő ilyen egymás s mellett Nem lehet egy régir gióban kettőnél l többt A structure a szekvenciával val kompatibilis struktúrának megfelelő aktivitás.
II. Hibás s bázispb zispárok Minden megengedett hibás s bázisb zis-pár csökkenti az aktivitást Az elhelyezkedésükt ktől l függf ggően más m s hatásuk lehet az egyes hibás s pároknakp misspair misspair, i
III. Kritikus helyek Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk nk aktivitást ezeken a helyeken. critical critical, i
IV. Jósolt szerkezet A 2D szerkezet meghatároz rozása. Package) sa. (Vienna RNA Elfogadjuk, ha a célszerkezetbe c tekeredik. A MFE nem biztos, hogy a kísérletesen k meghatározott másodlagos m szerkezet
A tájkt jkép p tulajdonságai 1 Neurospora VS Ribozyme 1 Hairpin Ribozyme fraction of all mutants 0.1 0.01 1E-3 1E-4 1E-5 Perfect ribozyme Functional ribozyme 0 1 2 3 4 5 6 7 # of mutation from the original sequence fraction of all mutants 0.1 0.01 1E-3 1E-4 1E-5 Perfect ribozyme Functional ribozyme 0 1 2 3 4 5 6 7 # of mutation from the original sequence = 0.26 = 0.22
Mozgás s a tájkt jképen
Moran folyamat Populáci ció méret állandó. Átfedő generáci ciók Haláloz lozás s véletlenszerv letlenszerű,, szaporodás rátermettségarányos Rátermettség g arányosan kiválasztunk egy egyedet. Ő fog szaporodni. Egy véletlen v szerint választott v egyed meghal, a helyébe szaporodik.
Szuboptimális maximum 1 bázispb zispárban van eltérés! Minden lehetséges mutáci ció ebben a párban tovább rontja a másodlagos szerkezetet
Rátermettség g tájkt jképek és s populáci ció méret Nagy populáci ció egy sima rátermettségtájképen gyorsan megtalálja lja az optimumot Nagy populáci ciókban nem fog sodródás miatt előnytelen mutáns elterjedni Nagy populáci cióban több t előny nyös s mutáci ció lehet D.E. Rozen, M.G.J.L. Habets, A. Handel, J.AG.M. de Visser 2008. Heterogeneous Adaptive Trajectories of Small Populations on Complex Fitness Landscapes. PLoS ONE 3(3): e1715. doi:10.1371/journal.pone.0001715
Kísérletes körülmk lmények E.coli 500 generáci ciónyi evolúci ció sima rátermettség g tájkt jképen (minimális médium) m és rögös tárjépen (komplex médium). m A populáci cióméretet a baktériumkult riumkultúra ra térfogatának változtatv ltoztatásával érték k el (5x10 5 vs. 2.5x10 7 ), ami 50x különbsk nbséget jelent. A relatív v rátermettsr termettséget (és( így az adaptáci ciót) egy máskép p jelölt lt ősi törzzsel t való közvetlen kompetíci ciós kísérletben tesztelték.
Eredmény Kis populáci ciókban az adaptáci ció heterogénebb, nagy populáci ciókban nem. Nagy populáci ció gyorsan adaptálódott dott a sima rátermettség g tájkt jképeken Kis populáci ció viszont gyorsabban adaptálódik dik rögös s tájkt jképen.
Eredmény 2 A legmagasabb relatív v rátermettsr termettséget elérőnél eleinte kicsi a rátermettsr termettség g növekedn vekedés s (pontozott görbék) (A kis populáci ció,, B nagy populáci ció) A legmeredekebb lejtőn n felfelé nem biztos, hogy a legmagasabb csúcs találhat lható Sok ki populáci ció nem találta lta meg az optimumot...