A humán multidrog transzporter MDR1 klinikai és biokémiai vizsgálata

A humán multidrog transzporter MDR1 klinikai és biokémiai vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Szakács Gergely Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Pathobiokémia Program Témavezető: Dr. Sarkadi Balázs Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Budapest, 2000

Összefoglalás I. A citosztatikus terápia a daganatos sejtek kialakuló rezisztenciája miatt sok esetben nem bizonyul hatékonynak. A kemoterápia kudarcáért többnyire az ABC (ATP Binding Cassette) fehérjék közé tartozó humán multidrog transzporter MDR1 működése tehető felelőssé. Az MDR1 az ATP energiáját felhasználó aktív transzporter, amely megakadályozza a citosztatikus vegyületek sejten belüli felhalmozódását. Kísérleteink első részében vad-típusú és mutáns MDR1 variánsok ATPáz aktivitását tanulmányoztuk. A fehérjéket Sf9 rovarsejtekben termeltettük, aktivitásukat a 8-azido ATP és foszfát-analóg anionok jelenlétében képződő intermedier komplexek vizsgálatával jellemeztük. Kimutattuk, hogy a nukleotid-kötő doménban lévő Walker A (K433M, K1076M) és az ABCsignature (G534V, G534D, G1179D) aminosavak mutációja ellenére az MDR1 eljut az első ATP hidrolízisét jelentő komplexek formálásáig. Mindkét nukleotid kötő domént érintő kettős mutáció a fehérje teljes inaktivációját eredményezte. Az unilaterális mutációk által előidézett térszerkezeti változás mindkét nukleotidkötő domén működését érintette. A katalitikus aktivitás további vizsgálata kiderítette, hogy az ABC-signature mutánsok parciális reakcióját a drogok gátolták. Eredményeink alapján az MDR1 katalitikus ciklusában a két nukleotidkötő régió rendkívül szoros kooperációban, gyakorlatilag egységes katalitikus szerkezetként működik, melyben a signature-aminosavak közvetlen befolyással bírnak az ATP elhasítására és a drog-indukálta intramolekuláris szignál továbbítására. II. A cisztikus fibrózis kialakulásában szerepet játszó CFTR szintén az ABC fehérjék családjába tartozik, működését a foszforiláció mellett az ATP szabályozza. Kimutattuk, hogy a CFTR katalitikus ciklusában az MDR1-ben detektálthoz hasonló intermedier komplex formálódik. Összhangban a CFTR alacsonyabb katalitikus aktivitásával, az intermedier komplex stabilizáló foszfát analógok nélkül is detektálható volt. A nukleotid-kötő domének szelektív vizsgálata bebizonyította, hogy a CFTR katalitikus egységei különböző funkciót láthatnak el. III. Az ABC fehérjék biokémiai jellemzése mellett tanulmányoztuk az MDR transzporterek klinikai szerepét haematológiai betegségekben. A három évig tartó vizsgálatban 93 de novo akut leukémiás mintát analizáltunk. Célunk az volt, hogy a laboratóriumban rutinszerűen alkalmazott módszert, az MDR1 aktivitását mérő Calcein-próbát klinikai diagnosztikai eljárássá fejlesszük. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a Calcein-próba alkalmas rutin klinikai laboratóriumi módszer a haematológiai proliferatív kórképek kezeléssel szembeni rezisztenciájának meghatározására, a hosszú távú túlélés esélyének jóslására és a multidrog rezisztenciához társuló MRP1 aktivitásának szelektív vizsgálatára. 2

1. Bevezetés Az ABC (ATP Binding Cassette) fehérjék alkotják a ma ismert egyik legnépesebb fehérjecsaládot. A legtöbb ABC fehérje aktív transzportot végez, bár az összes családtagban kötelezően előforduló ABC egység alkalmas más folyamatok energetizálására is. Valamennyi eddig ismert humán ABC fehérjére jellemző, hogy membránhoz asszociálódik és működése során ATP-t hasít. E két tulajdonság szerkezeti alapjául a membránba ágyazódó transzmembrán domén (TMD) ill. az ATP megkötéséért felelős nukleotid-kötő régió (Nucleotide Binding Domain, NBD) szolgál. Az ABC fehérjéket összehasonlítva feltűnő a citoplazmatikus nukleotid-kötő egységek három, az evolúció során megőrzött szekvenciája: a Walker A és B régiók, valamint az ún. ABC-signature szekvencia. A Walker A (GXXGXGKS/T) és B (hhhhd) konszenzus szekvenciák más ATP-t kötő fehérjékben is előfordulnak, míg a signatureszekvencia (LSGGQQ/R/KQR) az ABC fehérjék sajátja. A humán ABC fehérjék funkcionális egysége a transzmembrán domén és a nukleotid-kötő domének tandem duplikációjából áll. A közös szerkezeti séma alapján feltételezhető, hogy az ABC fehérjék hasonló mechanizmussal működnek. Bizonyítottnak tekinthető, hogy az ATP hidrolízise a nukleotid-kötő doménekben történik, nem ismert viszont, hogy a felszabaduló energia hogyan kapcsolódik a fehérje működéséhez. Szerkezeti adatok hiányában az ABC fehérjékről alkotott modellek nagyrészt biokémiai és genetikai kísérleteken alapulnak. Az egyik legtöbbet tanulmányozott modell-fehérje a daganatos sejtek rezisztenciáját biztosító MDR1 transzporter. 1.1. A multidrog rezisztencia fogalma A citosztatikus terápia a daganatos sejtek kialakuló rezisztenciája miatt sok esetben nem bizonyul hatékonynak. A kemoterápia kudarcáért többnyire az ABC (ATP Binding Cassette) fehérjék közé tartozó humán multidrog transzporter MDR1 működése tehető felelőssé. Az MDR1 az ATP energiáját felhasználó aktív transzporter, amely megakadályozza a citosztatikus vegyületek sejten belüli felhalmozódását. Szubszrátjai között a daganatellenes szerek mellett több fontos, a gyógyászatban használt vegyület található. A transzportált drogok közös tulajdonsága, hogy valamennyien hidrofób és amfipatikus vegyületek. Az MDR1 1280 aminosavból épül fel (1. ábra), két homológ felében megtalálhatóak az ABC transzporterekre jellemző transzmembrán és nukleotidkötő (TMD ill. NBD) domének. 3

1. ábra: Az MDR1 membrántopológiája A nukleotid-kötő domén bakteriális transzporterek ABC doménjeinek térszerkezete alapján egy β-redőkből álló központi régióra (I) és egy ettől L alakban elágazó, főként alfa hélixekből álló egységre (II) tagolódik. Az ATP a béta redőkből font zsebben fekszik, adenin gyűrűje hidrofób kölcsönhatások révén rögzített. A kötő felszín kialakításában a konzervált Walker A és B szakaszok vesznek részt. Meglepő, hogy míg a Walker-motívumok a nukleotid köré szerveződnek, addig az ABC fehérjék nukleotid-kötő doménjában kötelezően előforduló harmadik motívum nincs közvetlen kapcsolatban az ATPvel. A signature régió a II. kar egyik központi hélixén, az ATP-től 16 Å-re található. 1.2. Az MDR katalitikus ciklusa Az általánosan elfogadott pumpa modell szerint az MDR1 az ATP energiáját felhasználva biztosítja a drogok transzportját. Valóban, az MDR1 jól mérhető ATPáz aktivitással rendelkezik, melyet a transzportált drog-szubsztrátok jelentős mértékben serkentenek. A katalitikus ciklus az alábbi reakció egyenlettel írható le: MDR1+MgATP MDR1 MgATP MDR1 MgADP Pi MDR1 MgADP+Pi MDR1+MgADP A katalitikus ciklus az ATP megkötésével kezdődik, az ATP energiája több lépésből álló folyamatban szabadul fel. Az ATP megkötése (MDR1 MgATP) után bekövetkező hidrolízis egy nagy energiájú komplex kialakulásához vezet (MDR1 MgADP Pi), amit az anorganikus foszfát (Pi), majd az ADP disszociációja követ. Az MDR1 ATPáz aktivitását a vanadát mikromólos koncentrációban gátolja. A gátlás valószínű mechanizmusa az, hogy a szerkezetükben hasonló vanadát és anorganikus foszfát helyet cserélnek, ezért a reakció a nagy energiájú komplex stabilizációja következtében megakad: MDR1+MgATP MDR1 MgATP MDR1 MgADP Pi MDR1 MgADP+Pi ( MDR1+MgADP) MDR1 MgADP Vi/AlF x /BeF x 4

Az MDR1 MgADP Vi komplex a katalitikus ciklusban formálódó nagy energiájú MDR1 MgADP Pi komplex stabil analógjának tekinthető. Hasonló mechanizmussal gátolja az MDR1 ATPáz aktivitását két másik foszfát analóg, a fluoro-aluminát (AlF x ) és a berillium-fluorid (BeF x ). A gátlás reverzibilis: a kapcsolat felbomlásakor - egy ADP távozásával - az MDR1 ATPáz aktivitása helyreáll. A transzportált szubsztrátok a katalitikus ciklust jelentősen felgyorsítják (drogstimulált ATPáz aktivitás). A katalitikus ciklus részletes vizsgálata kiderítette, hogy a transzportált szubsztrátok ATPáz aktivitásra gyakorolt hatása már a katalitikus intermedier képződésekor jelentkezik. Az MDR1 transzportált drogszubsztrátjai a vanadát-függő intermedier képződését a teljes ATPáz ciklushoz hasonló (koncentrációjuktól függő) módon fokozzák, ugyanakkor a MDR1 MgADP Vi komplex disszociációjára nincsenek hatással. Ennek alapján a kísérletekben detektálható MDR1 MgADP Vi komplex a teljes katalitikus ciklus parciális reakciójának tekinthető. Valószínű, hogy a nagy energiájú intermedier (MDR1 MgADP Pi) képződése a teljes ciklus sebességét meghatározó lépés (rate limiting step), mely a transzportált szubsztrátok kontrollja alatt áll. A szerkezetileg elkülönülő doménekben zajló drog-kötés és ATP hidrolízis szoros kapcsolata intramolekuláris kölcsönhatások révén valósul meg. Az ABC fehérjék szerkezet-funkció kutatásának egyik legnagyobb kihívását az összehangolt működést irányító szignál molekuláris szintű azonosítása jelenti. 1.3. A klinikai MDR vizsgálati módszerei A klinikai MDR megbecsülésére számos módszer kínálkozik, a nemzetközi ajánlások ellenére azonban máig sem létezik olyan laboratóriumi módszer, mely a rezisztencia detektálását standard módon szabályozná. Az MDR fehérjék aktivitására jelzett drogok (daunorubicin, doxorubicin) vagy fluoreszcens festékek (rhodamin123, DiOC 2 ) megoszlásából lehet következtetni, e módszerek azonban többnyire technikailag kedvezőtlenek, nehezen kvantitálhatók. A laboratóriumunkban korábban kidolgozott Calcein-próba a tumor sejtek in vitro rezisztenciájának meghatározására szolgál. A hidrofób Calcein-AM az MDR fehérjék (MDR1, MRP1) szubsztrátja, mely a sejtbe kerülve intracelluláris észterázok hatására zölden fluoreszkáló szabad calceinné alakul. A sejtek rezisztenciájára, azaz az MDR pumpák aktivitására a felhalmozódó fluoreszcencia mértékéből lehet következtetni. A rezisztencia kvantitatív mértékét (MDR Aktivitási Faktor, MAF) a verapamillal gátolt, ill. gátlószer nélküli calcein akkumuláció aránya adja meg. 5

2. Célkitűzések Kutatásaink célja az ABC fehérjék katalitikus ciklusának vizsgálata, valamint az MDR transzporterek klinikai szerepének jellemzése volt. 1. Feltételeztük, hogy az AlF x - ill. BeF x -dependens intermedier komplexek az MDR1 MgADP Vi intermedierhez hasonlóan az MDR1 katalitikus ciklusának részreakcióját tükrözik. Ennek bizonyítására vizsgálni kívántuk az AlF x - ill. BeF x -dependens nukleotid okklúzió idő- és ATP-függését, valamint a transzportált szubsztrátok hatását. 2. A munkacsoportunk korábban több olyan ATPáz negatív MDR1 variánst állított elő, melyekben a mutáció az első vagy a második nukleotid-kötő domén konzervált aminosavait érintette. Célunk az volt, hogy a mutáns fehérjék ATPáz aktivitásának részletes vizsgálatával megpróbáljuk közelebbről meghatározni a kérdéses aminosavak katalitikus szerepét. 3. Az eredmények birtokában az ABC-signature régió funkciójának részletesebb vizsgálatát és további mutánsok előállítását tűztük ki célul. 4. Ismert volt, hogy a CFTR (Cisztikus Fibrózis Transzmembrán Regulátor) által formált kloridcsatorna funkcióját a foszforiláció mellett az ATP szabályozza. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, a CFTR katalitikus ciklusa tartalmaz-e vanadát-függő katalitikus intermediert. A katalitikus aktivitás detekciójának beállítása után jellemezni kívántuk a reakció idő- és koncentrációfüggését, gátolhatóságát, stb., valamint a két nukleotid-kötő domén szerepét. 5. Az ABC fehérjék biokémiai jellemzése mellett vizsgálni kívántuk az MDR transzporterek klinikai szerepét haematológiai betegségekben. Célunk az volt, hogy a laboratóriumban rutinszerűen alkalmazott módszert, a Calcein-próbát klinikai diagnosztikai eljárássá fejlesszük. 6

3. Eredmények és megvitatásuk 3.1. Katalitikus intermedierek vizsgálata Kísérleteink első részében a tumorsejtek széleskörű drog-rezisztenciáját biztosító MDR1 és a mukoviszcidózis patogenezisében szerepet játszó CFTR ATPáz aktivitását tanulmányoztuk. A vad-típusú és mutáns fehérjéket Sf9 rovarsejtekben termeltettük, aktivitásukat a katalitikus ciklusban képződő intermedier komplexek vizsgálatával jellemeztük. Az ABC ATPázok szubsztrátjának tulajdonképpen az ATP tekinthető. A katalitikus ciklus egyes lépései meghatározott kísérleti körülmények mellett külön tanulmányozhatók. A teljes ciklusról az ATPáz aktivitás tudósít, a további lépéseket radioaktívan jelzett azido-atp segítségével követhetjük nyomon (az azido csoport ultraibolya fény hatására kovalens kötést létesít a környezetében található tirozin oldalláncokkal (fotoaktiváció)). Az ATP megkötését (a ciklus első lépését) 0 o C-on vizsgáltuk (ilyenkor a hidrolízis további lépéseitől eltekinthetünk). A nukleotid ebben a lépésben jelöletlen ATP-vel leszorítható. Az intermedier komplex képződését gátló anion jelenlétében, 37 o C-on vizsgáltuk, a fehérjét 10 mm MgATP-t tartalmazó oldattal történt mosás után vetettük alá UV sugárzásnak. Ebben az állapotban a nukleotid a katalitikus centrum egy eldugott belső zsebébe kerül. Kétszeri mosás után csak ez, a külső, jelöletlen ATP elől elzárt (okklúdált, trapped) nukleotid marad a fehérjéhez asszociált állapotban. 3.1.1. Foszfát analógok szerepe a katalitikus intermedierek stabilizálásában A vanadát-függő nukleotid okklúzió az MDR1 katalitikus ciklusának részreakcióját tükrözi, melyet a transzportált szubsztrátok a teljes ATPáz ciklushoz hasonlóan serkentenek. Nem volt ismert, hogy az AlF x - ill. BeF x - dependens intermedier komplex keletkezése fokozható-e a transzportált szubsztrátokkal. Elsőként ezért az AlF x - ill. BeF x -dependens okklúzió drogfüggését vizsgáltuk meg. Kísérleteinkben a verapamil (mely az MDR1 jól jellemzett szubsztrátja) mindhárom komplex képződését felgyorsította. 3.1.2. Nukleotid okklúzió vanadát jelenlétében és hiányában, a CFTR katalitikus ciklusának vizsgálata Patch-clamp kísérletek szerint (melyekben akár egyetlen fehérje működése vizsgálható) a CFTR által formált kloridcsatorna funkcióját a foszforiláció mellett az ATP szabályozza. Ismert volt, hogy a vanadát gátolja a CFTR működését (a csatornákat nyitott állapotban rögzíti), valamint az is, hogy a CFTR alacsony szintű ATPáz aktivitással bír. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, a CFTR katalitikus ciklusa tartalmaz-e vanadát-függő katalitikus intermediert. 7

Eredményeink szerint az MDR1-hez hasonlóan, a CFTR-ben vanadát jelenlétében stabil intermedier komplex alakul ki. A reakció hőmérséklet függése, NEM-, ill. EDTA-érzékenysége alapján a CFTR-ben a vanadát-függő komplex képződése a katalitikus ciklus parciális reakciójának felel meg. Az MDR1-ben a nagy sebességű katalitikus aktivitás miatt az intermedier komplex (MDR1 MgADP Pi) rövid életidejű, ezért kizárólag foszfát analóggal stabilizált állapotában vizsgálható. A CFTR katalitikus gépezete lassabb (az MDR1 kb.10, a CFTR kb.1 ATP-t hasít el másodpercenként). A reakció viszonylag alacsony sebességének köszönhetően a CFTR-ben a nukleotid okklúzió vanadát nélkül is detektálható, a reakcióelegy gyors lehűtése alatt a ciklusban formálódó intermedier komplex nem esik szét. A nukleotid-kötő domének szelektív vizsgálata bebizonyította, hogy a CFTR katalitikus egységei különböző funkciót láthatnak el. A C-terminális nukleotid-kötő doménben zajló hidrolízis az MDR1 katalitikus ciklusához hasonlít, parciális reakciója során képződő intermedier csak vanadát jelenlétében detektálható. Ezzel szemben az N-terminális nukleotidkötő domén vanadát jelenlétében és hiányában is jelölődik, ami arra utal, hogy az intermedier komplex itt is gyorsan kialakul, ám a teljes ciklus a komplex csökkent disszocációja miatt lelassul. 3.1.3. MDR1 nukleotid-kötő mutánsainak vizsgálata A szerkezet-funkció kutatásának egyik bevált módszere mutáns fehérjék készítése. A mutánsok részletes jellemzése helyett azonban sok esetben kénytelenek vagyunk megelégedni annak a ténynek a rögzítésével, hogy a konzervált aminosavak mutációja az ATPáz aktivitás (illetve a transzport funkció) elvesztésével jár. A katalitikus intermedierek vizsgálatával azonban olyan eszközhöz jutottunk, mely lehetővé tette korábban teljesen inaktívnak hitt mutánsok tanulmányozását. Munkám során az MDR1 Walker A (K433M, K1076M, K433M/K1076M) ill. ABC-signature (G534D, G534V, G1179D, G534D/G1179D) régiójában előidézett mutációk katalitikus hatását vizsgáltam. Irodalmi adatok szerint A Walker A régióban található KM mutáció ATPáz negatív fenotípust eredményez, az ATP kötése azonban megmarad. Munkacsoportunk mutatta ki elsőként, hogy a Walker A mutánsokban vanadát-függő nukleotid okklúzió nem detektálható. Miután meggyőződtünk arról, hogy a BeF x - ill. AlF x -dependens komplexek szintén az MDR1 ATPáz ciklusának részreakciójában képződnek, megvizsgáltuk e két gátló anion hatását. Ezekben a kísérletekben mindkét egyszeres mutáns (K433M, K1076M) jelölődött, azaz képes volt az ATP megkötését követő katalitikus lépésre (a kétszeres mutáns nem jelölődött). A gyengébb jelölődéstől eltekintve a mutánsok a BeF x - ill. AlF x -dependens okklúziós kísérletekben a vadtípusú MDR1-gyel minden tekintetben megegyezően viselkedtek. Míg a Walker A és B motívumok más nukleotid-kötő fehérjékben is megtalálhatók, a signature régió kizárólag az ABC család tagjaiban fordul elő. Kísérletek sokasága bizonyítja, hogy a signature szekvenciát alkotó konzervált 8

aminosavak megváltoz(tat)ása a transzporter funkció elvesztésével jár. A signature régió ABC-specifikus szerepe ezzel együtt egyelőre nem ismert. Egyes elképzelések szerint az ABC fehérjék intramolekuláris kölcsönhatásaiban játszik központi szerepet, más modellekben a nukleotid-kötő felszín kialakításában vesz részt. A signature szekvencia negyedik pozíciója csaknem valamennyi ABC fehérjében glicint tartalmaz. Kísérleteinkben az N-terminális signature régióban glicin helyett aszparaginsavat (G534D), vagy valint (G534V) tartalmazó mutánsok, illetve a C-terminális signature régióban előidézett analóg mutáció (G1179D), és a dupla mutáció (G534D/G1179D) hatását vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy az ABC-signature régióban előidézett mutációk inaktiválják az MDR1 ATPáz aktivitását. Az ABCsignature mutánsok ATP kötése nem különbözött a vad-típusú fehérjétől, fluoroaluminát jelenlétében mind a három egyszeres mutáns (G534D, G534V és G1179D) jelölődött (berillium-fluorid a fluoro-alumináttal megegyező eredményt adta). A radioaktív ATP beépülése a mutánsokban jelentősen elmaradt a vadtípusú fehérjétől (40-60%), a reakció azonban Mg2+-függő, NEM-szenzitív volt, a jelöletlen ATP-vel történő preinkubáció a jel eltűnésével járt. A kétszeres mutáns (G534D/G1179D) nem jelölődött. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a féloldali mutációk ellenére a katalitikus centrum eljut addig a konformációig, melyben a nukleotid kívülről már nem hozzáférhető (ez az állapot a vad típusú MDR1-ben az első ATP hidrolízisének felel meg). Felmerült, hogy a gyengült beépülés az alacsonyabb alap aktivitás következménye, mely esetleg transzportált szubsztrátokkal fokozható. Míg a Walker A mutánsokban az intermedier komplex képződését a transzportált drogok gyorsították, a signature mutánsok jelölődése verapamil jelenlétében tovább gyengült. Az ATP és a drog-szubsztrátok megkötése a vad-típusú MDR1- ben függetlenek egymástól. Az ATP kötés verapamil jelenlétében a signaturemutánsokban sem változott, a transzportált szubsztrátok gátló hatása tehát nem az ATP-kötés gátlásával magyarázható. A tanszportált szubsztrátok meglepő hatása arra enged következtetni, hogy a signature-mutációk a drog-kötő hely és a katalitikus centrum közötti molekuláris kommunikációt zavarták meg. 3.1.4. A nukleotid domének közti katalitikus kooperáció Az MDR1 két nukleotid-kötő doménje minden jel szerint szoros kooperációban működik. A vanadáttal stabilizált intermedier (mely csak az egyik nukleotid-kötő doménban alakul ki) mindkét oldal katalitikus aktivitását felfüggeszti. Hasonlóképpen, a katalízisben kulcsszerepet játszó kritikus aminosavak egyoldali mutációja vagy kémiai módosítása az MDR1 inaktivációjához vezet, az ATPáz aktivitás a mérhető küszöb alá csökken, a rezisztencia megszűnik. Eredményeink szerint a katalitikus centrumban lévő Walker A és ABC-signature aminosavak egyoldali mutációja ellenére az MDR1 eljut az intermedier komplexek formálásáig. Az unilaterális mutáció által előidézett térszerkezeti változás azonban mindkét oldalt egyformán érinti: a vizsgált MDR1 mutánsokban vanadát jelenlétében sem a mutáns, sem a vad-típusú centrum 9

nem jelölődik. Ez csak úgy lehetséges, ha a két nukleotid-kötő domén rendkívül szoros kapcsoltságban működik, melynek során az egyik centrumban előidézett változás a másik oldalon is ugyanazt azt a hatást idézi elő. Eredményeink arra utalnak, hogy a két nukleotid-kötő domén a katalitikus ciklus folyamán végig szoros kooperációban, gyakorlatilag egy katalitikus egységként viselkedik. A féloldali mutációk ellenére a katalitikus egységben egy ATP hidrolízise még végbemegy. Kétoldali mutáció hatására a kooperáció (katalitikus egység) felbomlik, a fehérje katalitikus gépezete leáll. 3.1.5. A nukleotid-kötő domének dimerizációja Valamennyi eddig ismert ABC ATPáz funkcionális egysége dimert alkot. A két ATP-kötő domén közti együttműködés megismerése kulcsfontosságú az ABC fehérjék általános működésének megértéséhez. Szerkezeti adatok hiányában az MDR1 két nukleotid-kötő doménje közti szoros kooperáció molekuláris részleteit bakteriális ABC fehérjékben talált dimerek mintájára képzelhetjük el. Jelenleg két dimer szerkezete ismert. A S. typhimurium-ból származó HisP (a hisztidin transzportját végző periplazmikus hisztidin permeáz katalitikus alegysége) kristályszerkezetében az ABC egységek egymásnak hátat fordítanak, az ATP-kötő felszínek a dimer ellentétes oldala felé néznek (2A ábra). A Walker A és B motívumok által határolt nukleotid-kötő felszín periferiális, nyitott helyzetű. A dimerizációs felszínt az I. kar β-redői alkotják, a kapcsolat hidrofób kötéseken keresztül valósul meg. Ettől eltérő szerveződést mutat a Pyrococcus furiosus DNS-repair komplexének egyik alkotórésze, a Rad50 dimerje. A Rad50 lineáris szerkezetében megtalálható konszenzus elemek szerint az ABC ATPázok családjába tartozó fehérje. A DNS kötő felszín kialakítása a katalitikus (ABC) alegység ATP-függő dimerizációja során alakul ki. A Rad50 katalitikus ABC doménjének alapszerkezetében megtalálható a β-redőkből álló központi régió (I) és az attól L alakban elágazó helikális egység (II). A nukleotid-kötő felszín kialakításában a Walker-szekvenciák mellett a signature régió is részt vesz, oly módon, hogy az egyik alegység signature-aminosavai a másik alegységen kötött ATP-vel hatnak kölcsön (2B ábra). 2. ábra: Az ABC alegységek dimerizációs modelljei 10

Kérdés, hogy létezik-e általános érvényű dimerizáció az ABC fehérjék családjában. Eredményeink tükrében az MDR1 működése a fej-láb orientáció modelljével jobban magyarázható: 1. Valamennyi vizsgált mutánsban megfigyelhető volt, hogy a két nukleotid-kötő domén egyformán viselkedett. A féloldali mutációk (K433M, G534D, G1179D) által előidézett térszerkezeti változás mindkét centrum jelölhetőségét megváltoztatta. Hasonlóképpen, a féloldali ABC-signature mutációk hatására a drogok mindkét oldal katalitikus aktivitását gátolták. Mindebből az következik, hogy a két nukleotid-kötő domén a rendkívül szorosan együttműködik, szinte egyetlen katalitikus egységként viselkedik. A HisP dimerjében ez a szoros kooperáció csak közvetetten, pl. a transzmembrán domének révén valósulhat meg. 2. A fej-láb szerinti dimer formáció esetén érthetővé válik a signaturemutánsok inaktivitása, a signature régió közvetlen részvétele az ellenoldali katalitikus centrum kialakításában egyben magyarázza a szekvencia univerzális megőrzöttségét, valamint azt is, hogy az ABC fehérjéknek miért van két ABC doménra szükségük. 3. Eredményeinkből következően a signature-régió része a drog-indukálta szignált közvetítő molekuláris láncolatnak. Modellünk szerint a transzportált szubsztrát megkötését követő szignál eredményeként a II. kar, vele a signature régió a szemközti alegységben megkötött ATP felé mozdul, ami a katalitikus centrum komplementációját, vagyis az ATP-hidrolízis stimulációját eredményezi. A signature-mutációk ellenére az intermedier komplexek formálása még megtörténhet, ám az eltorzult szerkezetű katalitikus centrumok drog-indukálta komplementációja az aktivitást csökkenti. 3.2. Klinikai MDR vizsgálata malignus haematológiai megbetegedésekben A haemopoetikus rendszer proliferatív megbetegedéseinek természete miatt a kemoterápiás kezelés elsőrendű fontosságú. A kombinált citosztatikus terápia ellenére a remisszió aránya elkeserítően magas, az okok közt az MDR fehérjék által fenntartott rezisztencia az első helyen áll. Joggal feltételezhető, hogy a rezisztencia mértékének előzetes ismerete komoly segítséget jelentene a klinikus munkájában. 3.2.1. A Calcein-próba alkalmas a klinikai MDR meghatározására Célunk az volt, hogy a Calcein-próbát, melyet rutinszerűen alkalmazunk a laborban tenyésztett sejtek rezisztenciájának monitorozására, klinikai diagnosztikai eljárássá fejlesszük. Miután bebizonyítottuk, hogy a Calcein-próba klinikai mintákon is kivitelezhető, a vizsgálatot az ország két nagy haematológiai centrumában fekvő betegek mintáin folytattuk. A három évig tartó vizsgálatban 93 de novo akut leukémiás mintát analizáltunk. Az eredmények értékelését a 11

kezelést végző orvosokkal közösen, a klinikai adatok (anamnézis, diagnózis, prognosztikai faktorok) és a terápiás eredmények figyelembevételével végeztük el. A Calcein-próbát a diagnózis felállítása után, a kezelés megkezdése előtt végeztük. A MAF értékek összefüggést mutattak a hosszú távú kórjóslattal. A 3. ábrán bemutatott Kaplan-Meier görbéről leolvasható, hogy a vizsgált betegek közül az MDR negatív esetek átlagos túlélése kedvezőbb volt. survival (%) 100 75 50 MDR + MDR - 25 0 6 12 18 24 time (months) 3. ábra: 26 MDR-pozitív és 39 MDR-negatív beteg túlélési (Kaplan-Meier) görbéje 12

4. A dolgozat alapjául szolgáló közlemények jegyzéke I. Éva Karászi, Katalin Jakab, László Homolya, Gergely Szakács, Zsolt Holló, Béla Telek, Attila Kiss, László Rejtő, Sarolta Nahajevszky, Balázs Sarkadi, János Kappelmayer: Calcein assay for multidrug resistance reliably predicts therapy response and survival rate in acute myeloid leukemia. British Journal of Haematology 112 (2), 308-315 (2001) II. Gergely Szakács, Csilla Özvegy, Éva Bakos, Balázs Sarkadi, András Váradi: Detection of transition-state formation in ATPase-negative mutants of the human MDR1 protein. Biochem Biophys Res Commun 276, 1314-1319 (2000) III. Katalin Szabó, Gergely Szakács, Tamás Hegedűs, Balázs Sarkadi Nucleotide occlusion in the human CFTR: different patterns in the two nucleotide binding domains. J Biol Chem, 274, 12209-12212 (1999) IV. Gergely Szakács, Katalin Jakab, Ferenc Antal, Balázs Sarkadi: Diagnostics of multidrug resistance in cancer. Path Oncol Res.Vol.4, Number 4, 251-257 (1998) V. Gergely Szakács, Csilla Özvegy, Éva Bakos, Balázs Sarkadi, András Váradi: Role of glycine-534 and glycine-1179 of human MDR1 in drugmediated control of ATP hydrolysis. Biochemical Journal, 356, 71 75 (2001) 5. Egyéb saját közlemények jegyzéke I. Éva Bakos, Raymond Evers, Giulia Calenda, Gábor Tusnády, Gergely Szakács, András Váradi, and Balázs Sarkadi: Characterization of the amino-terminal regions in the human Multidrug Resistance Protein (MRP1). (2000) J Cell Sci. 113(Pt 24):4451-4461. II. Smith AJ, van Helvoort A, van Meer G, Szabó K, Welker E, Szakács G, Váradi A, Sarkadi B, Borst P.: MDR3 P-glycoprotein, a phosphatidylcholine translocase, transports several cytotoxic drugs and directly interacts with drugs as judged by interference with nucleotide trapping. (2000) J Biol Chem III. 275(31):23530-9. Éva Bakos, Raymond Evers, Gergely Szakács, Gábor E. Tusnády, Ervin Welker, Katalin Szabó, Marcel de Haas, Liesbeth van Deemter, Piet Borst, András Váradi, Balázs Sarkadi: Functional multidrug resistance protein (MRP) lacking the N-terminal transmembrane domain. (1998) J. Biol. Chem, 273, 32167-32175 IV. Holló Z, Homolya L, Hegedűs T, Müller M, Szakács G, Jakab K, Antal F, Sarkadi B: Parallel functional and immunological detection of human multidrug resistance proteins, P-glycoprotein and MRP1.(1998) Anticancer Res 18(4C):2981-2987 (1998). V. Ferenczi A, Homolya V, Szakács G, Németh K, Kiss E, Váradi A, Fekete Gy: Clinical application of analysis of microsatellite markers in the prenatal diagnosis of cystic fibrosis. Orvosi Hetilap 138(4):209-213 (1997) 13

6. Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt hálával tartozom témavezetőmnek, Sarkadi Balázsnak, aki munkámat irányította, és szakmai előrehaladásomat támogatta. Szerencsésnek érzem magam, hogy a vezetése alatt álló csoportban dolgozhattam. Köszönet illeti Váradi Andrást, aki pályámon elindított és munkámat azóta is gondos figyelemmel kíséri. Köszönöm Tanár Úrnak, Gárdos Györgynek kitüntető figyelmét és segítségét. Köszönetet mondok Bakos Évának, akitől nagyon sokat tanultam; közvetlen munkatársaimnak, akikkel az itt bemutatott munkát együtt végeztük: Özvegy Csillának, Szabó Katának, Hegedűs Tamásnak, Homolya Lászlónak, továbbá Zombori Ilonának, Jakab Katalinnak, Holló Zsoltnak, Kis Juditnak és Petrovics Katalinnak és a csoport valamennyi tagjának. Köszönöm szüleimnek mindazt, amit értem tettek. Végül illesse köszönet Annát a dolgozat (és írója) átfésüléséért. A dolgozat a SOROS alapítvány belföldi doktorandusz ösztöndíjának támogatásával az MTA Membránbiológiai és Immunkórtani Kutatócsoportjában készült. 14

Summary I. The expression of the multidrug resistance (MDR1 or P-glycoprotein) protein confers resistance by maintaining the level of a wide range of currently used antineoplastic drugs below a cell-killing threshold in the tumor cells. Drug transport by MDR1 is coupled to substrate-stimulated ATP hydrolysis. In the presence of ATP, a divalent cation and a transition state analogue, a nucleotide is trapped in the molecule, reflecting a drug-stimulated partial reaction of the ATPhydrolytic cycle. We have investigated the impaired catalytic activity of ATPasenegative MDR1 variants carrying mutations in the conserved Walker A (K433M and K1076M) or in the ABC-signature (G534V, G534D, G1179D) motifs. The mutant proteins were expressed in Sf9 insect cells, and the catalytic activity was followed in experiments using 8-azido ATP as an energy donor substrate and various transition state analogues as trapping agents. MgATP-binding was preserved in each mutant and nucleotide trapping was absent when mutations were introduced into both NBDs (G534D/G1179D, G534D/K1076M and K433M/K1076M). However, all of the single mutations studied allowed nucleotide trapping when fluoro-aluminate or beryllium fluoride was used as complex-stabilizing anions. Drug stimulation of the trapping reactions was observed in the wild type and in the Walker A mutants. In contrast, substrate drugs inhibited nucleotide trapping in the ABC-signature mutants, suggesting a key role for the glycine residues in the interdomain communication regulating drug-induced ATP hydrolysis. Limited trypsin digestion of the mutant MDR1 proteins revealed that whenever a trapping reaction occurred, both ABC domains were involved in the formation of the catalytic intermediates. Our results indicate that the conformational alteration caused a mutation in one ABC domain is propagated to the other, non-mutated domain, suggesting that two ABC domains function as a tightly coupled catalytic system. II. The function of the human CFTR protein as a chloride channel or transportregulator involves cellular ATP binding and cleavage. The human CFTR expressed in insect (Sf9) cell membranes shows specific, Mg2 + -dependent nucleotide occlusion. By using limited tryptic digestion of the labelled CFTR protein we found that the adenine nucleotide occlusion preferentially occurred in the N-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Addition of the ATPase inhibitor vanadate produced an increased nucleotide occlusion and resulted in the labeling of both the N-terminal and C-terminal NBDs. The pattern of nucleotide occlusion indicates significant differences in the ATP hydrolysing activities of the two NBDs, which may explain their different roles in the CFTR channel regulation. III. We evaluated the suitability of the Calcein assay, a fluorescence method for detecting MDR1 activity, as a routine clinical laboratory method for the identification of multidrug resistant phenotype in acute leukaemia. Assays were performed on blast cells of 93 de novo acute leukaemia patients. We show that MDR activity as determined by the Calcein assay is predictive for the response to chemotherapy. 15