Vörösvértestmembránokra ható vegyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata Ágner Gabriella Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola 6. sz. program: Ionizáló és nemionizáló sugárzások biológiai hatásai 2001
Vörösvértestmembránokra ható vegyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata Ágner Gabriella Témavezető: Dr. Blaskó Katalin Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola 6. sz. program: Ionizáló és nemionizáló sugárzások biológiai hatásai 2000 A Pseudomonas syringae pv. syringae növényi kórokozó baktérium által termelt ciklikus lipodepszipeptidek (CLP), a syringomycin E (SRE) és a syringopeptin 22A (SP22A) fungicid hatást gyakorolnak különböző gombafajokra. A vegyületek hatásának fő támadáspontja a sejtmembrán. A CLP-ek vagy származékaik a szisztémás gombás betegségek terápiájában is felhasználásra kerülhetnek, ezért fontos, hogy megismerjük a vörösvértestekre kifejtett hatásukat. A CLP-ek emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatását radioizotópos transzportkinetikai módszerekkel vizsgáltuk. A SRE 2 x 10 6 molekula/sejt-nél nagyobb koncentráció esetén a sejtek egy részén igen gyors és irreverzibilis hemolízist hoz létre és a lízis mértéke a mérés során változatlan marad. A SP22A által okozott lassú és a sejtek duzzadásával járó hemolízis a kolloid ozmotikus mechanizmus eredményeként jön létre. 2 x 10 6 molekula/sejt-nél nagyobb koncentrációban alkalmazott SRE hatására megnőtt a lízist túlélő vörösvértestek membránjának ionáteresztőképessége, a SP22A pedig már a lízisküszöb alatti koncentrációban is megnövelte a membrán 86 Rb + -ra 2
vonatkozó permeabilitását. A permeabilitás-növekedés oka, hogy a CLP-ek a vörösvértestmembránban pórusokat képeznek és az ionok ezeken keresztül szabad diffúzióval áramlanak. A SP22A hatására a membrán 86 Rb + -permeabilitása átlagosan négyszerese az azonos koncentrációjú SRE hatására létrejött 86 Rb + -permeabilitásnak. Meghatároztuk a két CLP megoszlási hányadosát a vörösvértestmembrán és az extracelluláris tér között és megállapítottuk, hogy a SRE megoszlási hányadosa négyszerese a SP22A-ének. Ebből arra következtettünk, hogy a két vegyület hatására létrejövő különböző mértékű permeabilitás növekedés oka a SP22A nagyobb pórusképző aktivitása, és nem az eltérő lipofilitás miatt a membránban létrejött különböző hatóanyag koncentráció. A SRE-pórusok meghatározott élettartammal rendelkeznek, majd időben inaktiválódnak. A csatorna-inaktiválódás sebessége nagymértékben függ a hőmérséklettől. A SRE-pórusok 37 C-on már 15 20 perc alatt inaktiválódnak, 20 Con csak 40 50 perc alatt, míg 6 C-on, a vörösvértestmembrán fő lipidjeinek fázisátalakulási hőmérséklete alatt nem lép fel inaktiváció. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a SRE-pórus inaktivációs mechanizmusában fontos szerepük van a membránt alkotó lipideknek. A SP22A-pórusok a vizsgált időtartamban, 90 perc alatt még testhőmérsékleten sem inaktiválódnak. Az emberi vörösvértestmembrán lipidösszetételét megváltoztatva megvizsgáltuk az egyes szterolok SRE-pórusképzésre gyakorolt hatását. Megállapítottuk, hogy a membrán koleszterintartalmának csökkentése ill. ergoszterinre történő részleges szubsztitúciója megnöveli a pórusképző aktivitását. A koleszterinnek az SREpórusképződést gátló hatása fontos lehet a SRE szisztémás alkalmazása szempontjából. 3
Action mechanism study of drugs effecting red blood cell membranes Ágner Gabriella Consultant: Dr. Blaskó Katalin Semmelweis University, School of Ph.D. Studies Program No. 6: Biological effects of ionizing and non-ionizing radiations 2000 The cyclic lipodepsipeptides (CLPs) syringomycin E (SRE) and syringopeptin 22A (SP22A) produced by the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. syringae have fungicidal activity on different fungi. The primary site of their action is the plasma membrane. The molecules or their derivatives may also be perspective drugs in the therapy of systemic opportunistic mycoses so it seems to be important to know their effect on red blood cells. Transport kinetic methods were used to study the action of CLPs on human red blood cells (RBCs). SRE above the concentration of 2 x 10 6 molecules/cells lyses a fraction of cells in a fast and irreversible way, then the extent of lysis remains constant. The SP22A induced relatively slow hemolysis accompanied by the swelling of cells is based on the colloid osmotic mechanism. Above the concentration of 2 x 10 6 molecules/cells SRE increases the ion permeability of the lysis survived cells, while SP22A has that effect already below the lytic threshold concentration. The permeability 4
increase was explained by the formation of CLP-pores in RBC membranes and the free diffusion of ions through these pores. The SP22A-induced 86 Rb + -permeability is about 4 times of that induced by SRE at the same concentration. The partition coefficients of both CLPs between the RBC membrane and the extracellular space were determined. It was found that the partition coefficient of SRE is 4 times higher than that of SP22A. It was concluded that the different permeability increases induced by the 2 CLPs is the result of the higher pore-forming activity of SP22A as compared to that of SRE and not that of the different CLP concentration in the membrane due to the different lipophilic character of the molecules. SRE forms pores with well defined life times then they inactivate in time. The speed of pore inactivation depends strongly on temperature. The SRE pores are inactivated at 37 C in 15 20 min, at 20 C only in 40 50 min, while at 6 C, below the phase temperature of the major lipid components of the human RBCs there is no pore inactivation. This result indicates that the lipids are involved in the mechanism of the SRE pore inactivation. With SP22A no pore inactivation was observed during the measurement (in 90 min after the addition of SP22A) even at 37 C. The influence of sterols on the SRE-pore formation was studied after altering the membrane sterol composition of the human red blood cells. Partial depletion of cholesterol or partial substitution by ergosterol increased the pore-forming activity of SRE compared to membranes with unaltered sterol composition. The protective role of cholesterol in the pore-forming activity of SRE may be an important factor in the perspective therapeutic use. 5
1. Bevezetés és célkitűzések...9 2. Irodalmi áttekintés...10 2.1. Az emberi vörösvértestmembrán szerkezete és funkciói...10 2.1.1. Az emberi vörösvértestmembrán szerkezete...10 2.1.1.1. A vörösvértestmembrán lipidösszetétele...12 2.1.1.2. A vörösvértestmembrán fehérjéi...14 2.1.2. Az emberi vörösvértestmembrán transzportfolyamatai...15 2.1.2.1. Semleges molekulák transzportja...15 2.1.2.2. Elektrolitok (ionok) transzportja...16 2.1.2.2.1. Aniontranszport...16 2.1.2.2.2. Alkáli kationtranszport...17 2.1.3. A vörösvértestek membránpotenciálja...18 2.2. Membránra ható vegyületek és az emberi vörösvértestmembrán alkáli-kationtranszportja...21 2.2.1. Melittin...21 2.2.2. Primycin...22 2.2.3. Gramicidin A...23 2.2.4. Amphotericin B...25 2.3. Szisztémás gombás betegségek terápiájában jelenleg alkalmazott hatóanyagok összehasonlítása 26 2.3.1. Hajlamosító tényezők...26 2.3.2. Kórokozók...27 2.3.3. Szisztémás mycosisok gyógyszeres kezelése...28 2.4. Egy új gombaölő vegyületcsalád, a Pseudomonas syringae pv. syringae által termelt lipopeptidek...30 2.4.1. Ciklikus lipopeptidek hatása a gombákra...33 2.4.2. Ciklikus lipopeptidek hatása növényi és állati sejtekre...35 2.4.3. Ciklikus lipopeptidek hatása modellmembránokon...36 3. Módszerek...40 3.1. Kísérleti anyagok...40 3.2. Iontranszport mérése...43 3.2.1. 86 Rb + efflux mérése...43 3.2.2. Hemoglobin efflux mérése...45 3.3. Hemolízis és megoszlási hányados meghatározása...46 3.3.1. A CLP-ek által okozott hemolízis meghatározása...46 3.3.2. A CLP-ek megoszlási hányadosának meghatározása a vörösvértestmembrán és az extracelluláris tér között...46 3.4. A módosított sejtek koncentrációjának számítása...48 3.5. Humán vörösvértestmembrán szterolösszetételének megváltoztatása liposzómás előkezeléssel 49 3.5.1. Liposzóma készítése és inkubálása a vörösvértestekkel...49 3.5.2. A vér koleszterin- és ergoszterin-tartalmának meghatározása...50 3.6. Membránpotenciál meghatározása humán vörösvértesteken...51 4. Eredmények...56 4.1. A SRE emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásai...56 6
4.1.1. A SRE hemolízist okozó hatása...56 4.1.2. A SRE hatása a vörösvértestmembrán ionpermeabilitására...58 4.2. A SRE hatásait befolyásoló tényezők...64 4.2.1. Hőmérséklet...64 4.2.2. A vörösvértestmembrán szterolösszetétele...69 4.2.3. Membránpotenciál...71 4.3. A SP22A emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásai...73 4.3.1. A SP22A hemolízist okozó hatása...73 4.3.2. A SP22A hatása a vörösvértestmembrán ionpermeabilitására...75 5. Megbeszélés...79 5.1. A SRE hemolízist okozó és pórusképző hatása emberi vörösvértestmembránon...79 5.2. A SRE-pórusok inaktivációja...82 5.3. A vörösvértestmembrán szterolösszetételének hatása a SRE pórusképző aktivitására...86 5.4. A SP22A hemolízist okozó és pórusképző hatása emberi vörösvértestmembránon...87 5.5. A SRE és a SP22A emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásainak összehasonlítása...89 6. Köszönetnyilvánítás...93 7. Irodalomjegyzék...94 7
A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke: 3-OH-Asp 4-Cl-Thr BLM CC 6 CLP Dab Dhb DOPC DOPE DOPS EC IC MOPS PC PE PS SM SP22A SRE Val 3-hidroxi-aszparaginsav 4-kloro-threonin bilayer lipid membrán 3,3'-dihexyl-2,2'-oxacarbocyanin ciklikus lipodepszipeptid 2,4,-diamino-vajsav 2,3-dehidro-2-aminovajsav dioleoil foszfatidil-kolin dioleoil foszfatidil-etanolamin dioleoil foszfatidil-szerin extracelluláris intracelluláris morfolino-propánszulfonsav foszfatidil-kolin foszfatidil-etanolamin foszfatidil-szerin szfingomielin syringopeptin 22A syringomycin E valinomycin 8
1. Bevezetés és célkitűzések A Pseudomonas syringae pv. syringae növényi kórokozó baktérium által termelt lipodepszipeptidek, a syringomycin E (SRE) és a syringopeptin 22A (SP22A) fungicid hatást gyakorolnak különböző gombafajokra. A vegyületek hatásának fő támadáspontja a sejtmembrán. A molekulák vagy származékaik a terápiában is felhasználást nyerhetnek, ezért a vörösvértestekre kifejtett hatásuknak, mint potenciális szisztémás gombaellenes szerek hatásának ismerete fontos lehet. A vörösvértestmembrán, mint egyszerű, ugyanakkor természetes biológiai membrán, modellként szolgál különböző membránra ható gyógyszermolekulák, elsősorban ionofór antibiotikumok által előidézett iontranszport-folyamatok kinetikai vizsgálatáran is. Ilyen meggondolások alapján vizsgáltuk a SRE és a SP22A emberi vörösvértestekre gyakorolt hatásait transzportkinetikai módszerekkel. Munkánk célja volt, hogy a két lipodepszipeptidnek az emberi vörösvértestmembránon keresztül a transzportfolyamatokra gyakorolt befolyását tanulmányozzuk, és megvizsgáljuk az iontranszport-növelő hatás mechanizmusait. Különös érdeklődéssel vizsgáltuk a szterolok esetleges jelentőségét a SRE-nek az emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásában, mivel korábbi adatok szerint ezek a lipidek játszanak szerepet a SRE gombaellenes hatásában. 9
2. Irodalmi áttekintés 2.1. Az emberi vörösvértestmembrán szerkezete és funkciói 2.1.1. Az emberi vörösvértestmembrán szerkezete Az emberi vörösvértestek (erythrocyták) a vöröscsontvelőben keletkező mag- és intracelluláris organellumok nélküli sejtek. A vörösvértestmembrán igen alkalmas modell a membrán szerkezetének és transzportfolyamatainak tanulmányozására. Előnyei, hogy 1, a vérből nagy mennyiségben és tisztán kinyerhetők a vér lecentrifugálása után a fehérvérsejtlepedék és a retikulocitaréteg eltávolításával; 2, nincsenek benne intracelluláris organellumok, így belseje homogén, emiatt a sejt feltárása után a centrifugálással kiülepíthető membránfrakció csak plazmamembrántöredékekből áll [45]. A membránbiológia két fontos felismerése, a lipidkettősréteg alapszerkezete és a membránfehérjék elhelyezkedése egyaránt a vörösvértestmembrán vizsgálatának eredménye. 2-1. ábra Az emberi vörösvértest vázlatos képe 10
Az érett vörösvértestek 7-8 m átmérőjű bikonkáv korongok, vastagságuk a korong széli részén kb. 2,6 m, a közepén kb. 0,8 m [43] (2-1. ábra). A vörösvértestek átlagos membránfelülete 137 m 2 [38], viszonylag nagy a sejt térfogatához, a 85 90 m 3 -hez képest [71]. Ez különösen alkalmassá teszi e sejteket a transzportfolyamatok vizsgálatára. A vörösvértestmembrán deformálható, de nyújthatatlan. Hipozmotikus (c < 300 mosm/l) közegben víz áramlik a sejt belsejébe, ezáltal csökken a felület/térfogat arány és a sejt alakja egyre jobban megközelíti a gömbét (szferocita) majd egy adott térfogatot elérve a membrán megreped, a sejt belsejéből a hemoglobin és az oldott fehérjék kidiffundálnak (ozmotikus hemolízis). A lízis után visszazáródott membránok az ún. ghostok. 2-2. ábra A membrán felépítése A vörösvértestmembrán fehérjéket és koleszterint tartalmazó foszfolipid 11
kettősréteg, aminek külső felszínén glikoproteinek és glikolipidek is vannak (2-2. ábra). A membrán lipidtartalma átlagosan 49 %, fehérjetartalma 51 % [18]. A vörösvértest két oldala között elektromos potenciálkülönbség, az ún. membránpotenciál áll fenn ( ). 2.1.1.1. A vörösvértestmembrán lipidösszetétele A vörösvértestmembránt foszfo- és glikolipidek, valamint koleszterin építik fel, ebből kb. 40 % koleszterin, 2 % glikolipid és 58 % foszfolipid [26]. A foszfolipidek részben glicerofoszfolipidek (foszfatidil-etanolamin (PE), foszfatidil-kolin (PC), foszfatidil-szerin (PS)), részben szfingofoszfolipidek (szfingomielin (SM)). A foszfolipideknek átlagosan 33 %-a foszfatidil-etanolamin, 29 %-a szfingomielin, 27 %-a foszfatidil-kolin és 12 %-a foszfatidil-szerin [26]. A membrán mindezeken kívül kisebb mértékben más foszfolipideket (glicerinsav, stb.) is tartalmazhat. A lipid kettősréteget túlnyomórészt a glicerofoszfolipidek és a szfingomielin építik fel, a foszfolipidek hidrofób zsírsavláncai egymás felé fordulva a membrán belsejében helyezkednek el, míg a hidrofil fejrészek a külső oldalon kifelé, a belső oldalon befelé tekintenek. Ebbe a lipid kettősrétegbe épülnek be a koleszterin és a fehérjemolekulák is [50, 87]. A lipidek elhelyezkedése a vörösvértestmembránban aszimmetrikus, a külső oldalon található a foszfatidil-kolin és a szfingomielin döntő többsége valamint a glikolipidek, míg a belső oldalon a foszfatidil-etanolamin 80%-a és az összes foszfatidil-szerin (2-3. ábra) [128]. Testhőmérsékleten a kettősréteg belsejében levő zsírsavak a folyadékokhoz 12
hasonló rendezettséget mutatnak, ezért a membránnak ez a belső része nagy mobilitású ún. lipidkontinuumot képez. A hossztengelyekkel párhuzamosan egymás mellett levő lipidmolekulák részben szabadon foroghatnak hossztengelyük körül (rotációs mozgás) részben a egyes zsírsavláncok elhajolhatnak, részben az egyes lipidmolekulák saját rétegükön belül helyet is cserélhetnek (laterális diffúzió), illetve igen korlátozott mértékben a membrán egyik oldaláról a másikra juthatnak (flip flop mozgás) [26, 45]. 2-3. ábra A vörösvértestmembrán-lipidek elhelyezkedése a membránban A felsorolt mozgások biztosítják a membrán folyékonyságát, a fluiditást, aminek következményeképpen a membránba ágyazott fehérjék is elmozdulhatnak a membrán síkjában. A membrán fluiditását a hőmérséklet döntően befolyásolja. A fő 13
fázisátalakulási hőmérséklet alatt a membrán merev, ún. gél állapotban van, ekkor a lipidek mozgása rendkívül korlátozott. A fázisátalakulási hőmérséklet felett a folyadékkristályos ún. fluid állapot alakul ki, ahol a fluiditás jelentősen megnő, itt jelentősek a korábban említett mozgások. Testhőmérsékleten az emberi vörösvértestmembrán fluid állapotban van. A vörösvértestmembrán-lipidek fázisátalakulási hőmérsékletére vonatkozó adatok némileg ellentmondásosak. Zimmer és Schirmer [140] direkt viszkozimetriás módszerrel 18 19 C körüli fázisátalakulási hőmérsékletet mért. Verma és Wallach [129] Raman spektroszkópiával mért eredményei alapján két fázisátalakulási hőmérsékletről beszélhetünk: az egyik 17 C körül, a másik 0 C alatt van. Ugyanekkor Hui és mtsai [65] elektrondiffrakciós módszerekkel azt találták, hogy az intakt vörösvértestben a fázisátalakulási hőmérséklet 0 3 C körül van. Mások szerint az intakt vörösvértestmembrán-lipideken nem észlelhető fázisátalakulás sem kalorimetriás, sem röntgendiffrakciós módszerekkel [51, 70]. 2.1.1.2. A vörösvértestmembrán fehérjéi A vörösvértestmembrán fehérjéi részben beépülnek a lipid kettősrétegbe, ezek az integráns membránfehérjék, ilyenek az ún. 3. sáv v. anionkicserélő fehérje, a glikoforinok, a glükóztranszporter fehérje; a fehérjék másik része a sejt belső felszínéhez rögzül, ezek a perifériás fehérjék, ilyen a vörösvértestmembrán alakját biztosító spektrin és az aktin [116]. 14
2.1.2. Az emberi vörösvértestmembrán transzportfolyamatai A vörösvértestek transzportfunkciót teljesítenek: lehetővé teszik az oxigénnek a szövetekhez történő szállítását, valamint a széndioxidnak a szövetekből történő eliminációját, és részt vesznek a vér és az interstíciális folyadék ph-jának beállításában. Az emberi vörösvértestmembrán egyik fontos sajátossága, hogy speciális transzportrendszerei révén egyes ionokra nézve rendkívül nagy gradienst tud létrehozni a vörösvértestmembrán intracelluláris tere (IC tér) és az extracelluláris környezetet képező vérplazma (EC tér) között (2-1. táblázat) [43]. 2-1. táblázat Az emberi vörösvértestek intra- és extracelluláris ionösszetétele c IC c EC Na + (mmol/l) 16 140 K + (mmol/l) 134 4 Ca 2+ (mmol/l) 10-3 1,2 Cl - (mmol/l) 77 115 - HCO 3 (mmol/l) 16 24 ph 7,2 7,4 2.1.2.1. Semleges molekulák transzportja Az emberi vörösvértestmembrán vízre nézve permeábilis, elsősorban az integráns fehérjemolekulák képeznek csatornát a vízmolekulák számára. Ugyanakkor nagyobb poláris anelektrolitok, pl. szacharóz számára a membrán nem átjárható, így szemipermeábilis hártyának tekinthető. Ezért hipozmotikus oldatban vizet vesz fel, 15
megduzzad, majd hemolizál [44]. Az oxigén és a széndioxid a lipidkettősrétegen keresztül passzív diffúzióval akadálytalanul jut át a membránon [43]. Mivel az emberi vörösvértestek energiaellátását egyedül a glükóz lebontása szolgáltatja, a folyamatos glükózellátás nélkülözhetetlen e sejt működéséhez. A vörösvértestek a glükózt facilitált diffúzióval veszik fel a vérplazmából. Ez a koncentrációgradiens irányának megfelelő, specifikus karrier közreműködésével történő transzport, amit jelen esetben a membrán integráns glikoproteinje, a glükóz transzporter (GLUT1) segít elő [45]. 2.1.2.2. Elektrolitok (ionok) transzportja 2.1.2.2.1. Aniontranszport A vörösvértestek feladata a széndioxid szállítása a szövetekből a tüdőbe. Ebben a működésben játszik közre az anionkicserélő vagy 3. sáv fehérje, ami a Cl - - és HCO 3 anionok 1:1 arányban történő cseréjét végzi. A fehérje a szövetekben a HCO - 3 sejtből történő eltávolítását, a tüdőben a HCO - 3 felvételét segíti elő [45, 48]. A Cl - ion a fenti antiportmechanizmuson kívül passzív diffúzióval is képes a vörösvértestmembránon átjutni, permeabilitási állandója 10-8 cm/s, ami kb. százszorosa a K + és Na + permeabilitási állandójának [44]. 16
2.1.2.2.2. Alkáli kationtranszport A kationok közül itt részletesen csak az alkáli kationok (Na +, K + ) transzportjával foglalkozunk, de megemlítjük, hogy más kationok is átjuthatnak az emberi vörösvértestmembránon, pl. a Ca 2+ egy aktív transzportrendszer, a Ca 2+ -ATP-áz segítségével. a, Aktív transzport Az emberi vörösvértestmembránban K + és Na + ionokra nézve egyaránt nagy koncentrációgradiens áll fenn, a Na + elsősorban az extracelluláris térben, míg a K + főleg az intracelluláris térben található meg (l. 2.1. táblázat). Ezt a koncentrációgradienst a K + Na + -ATP-áz enzim (K + Na + -pumpa) aktív transzport révén biztosítja. A pumpa hatására egyetlen ATP hidrolízise során 3 Na + lép ki a vörösvértestből és 2 K + lép be, mindkét folyamat a koncentrációesés ellenében megy végbe. A K + Na + -pumpa szívglikozidokkal (ouabain, sztrofantin) specifikusan gátolható [33]. A sejteket 0 C-ra hűtve, a glikolízis sebessége erőteljesen csökken. Mivel az ATP fő forrása a glikolízis, ezért a pumpa működése a hűtéssel reverzibilisen gátlódik, melegítés után a működés ismét helyreáll [45]. b, Facilitált diffúzió A koncentrációesés irányában végbemenő K + - illetve Na + -kicserélődés ATP-t nem igényel, bizonyos anyagokkal (pl. furoszemiddel, bumetamiddal) specifikusan gátolható [34, 112]. 17
c, Passzív diffúzió Az emberi vörösvértestmembrán jellemző tulajdonsága, hogy permabilitási állandója mind Na +, mind K + ionokra nézve kicsiny, p Na p K 1,1 x 10-10 cm/s [44]. Ez az igen kismértékű passzív transzport sem szívglikozidokra, sem furoszemidre nem érzékeny. Jellegzetessége, hogy alacsony hőmérsékleten (0 C körül) a K + - és Na + - permeabilitás megnő [112]. Fiziológiás körülmények között a háromféle transzport egyensúlyban van, így fennmarad a K + -ra és Na + -ra vonatkozó nagy koncentrációgradiens. A szervezetben megtalálható alkáli kationokhoz (Na, K) hasonlóan viselkednek más alkáli kationok is: a rubídium K-analóg, míg a lítium Na-analóg módon vesz részt a transzportfolyamatokban. 2.1.3. A vörösvértestek membránpotenciálja A Na +, K + és Cl - ionokra nézve a membrán két oldala között koncentrációgradiens áll fenn és az emberi vörösvértestmembrán Na + és K + ionokra nézve kevésbé, míg Cl - -ra nézve inkább permeábilis (p Cl p K p Na ). Ennek következtében a membrán két oldala között membránpotenciál ( IC EC ) alakul ki, amelynek értékét elég jó közelítéssel a mobilis ionra (Cl - ) számított Donnan-potenciál adja meg [79]: RT c Cl, IC IC EC ln {1} F ccl, EC ahol R az egyetemes gázállandó, T az abszolút hőmérséklet, F a Faraday állandó, c Cl,IC és c Cl,EC pedig az intra- ill. extracelluláris Cl - koncentráció. értéke emberi 18
vörösvértesteken fiziológiás körülmények között 10 mv [44]. Nem fiziológiás viszonyok között, bizonyos paraméterek módosításával a membránpotenciál értéke megváltoztatható. A membránpotenciál megváltozása többféle módon érhető el: 1, valinomycines kezeléssel: A valinomycin szelektív K + -ionofór vegyület, amely jelentősen megnöveli a membrán átjárhatóságát káliumionokra nézve [57, 121], ezért a valinomycines kezelés hatására a Cl - - és a K + -koncentráció együttesen határozza meg a membránpotenciált, az e két ionra felírt Hodgkin Huxley Katz egyenletnek megfelelően: RT c c K, EC Cl, IC IC EC ln {2} F ck, IC ccl, EC ahol P P K Cl, p K és p Cl a membrán permeabilitási koefficiense K + -ra ill. Cl - -ra nézve, értéke pedig 3 [62]. Az extracelluláris oldat összetételének változtatásával befolyásolható a valinomycin hatására kialakuló membránpotenciál értéke. Ha különböző Na + - ill. K + - tartalmú oldatokban a Cl - -összetétel valamint a K + - és a Na + -koncentráció összege állandó, akkor a membránpotenciál valamennyi oldatban szuszpendált vörösvértestre nézve azonos lesz. A valinomycines kezelés után a kialakult membránpotenciált az egyes oldatok K + -tartalma fogja meghatározni. Minél kisebb az extracelluláris K + - koncentráció, annál nagyobb koncentrációkülönbség hajtja ki a sejtből a K + -t és annál kifejezettebb lesz a membránpotenciál csökkenése, a hiperpolarizáció mértéke. A 19
membránpotenciál változása és a K + -koncentráció logaritmusa között lineáris összefüggés van. 2, Az extracelluláris ph változtatásával Az oldat ph-jának csökkentése a H + -ionok és velük együtt a Cl - -ionok sejtbe befelé irányuló transzportját eredményezi. Ennek következményeképpen megnő a belső Cl - -koncentráció a külsőhöz viszonyítva, így a membrán belseje depolarizálódik, nő a membránpotenciál. A fiziológiástól eltérő ph vagy Cl - -koncentráció a membránpotenciál értékének megváltozását eredményezi. Ha ilyen esetben valinomycines kezeléssel megváltoztatjuk a membránpotenciált, akkor nem számolhatunk a fiziológiás membránpotenciállal, hanem a kiindulási membránpotenciált abból az extracelluláris K + -koncentrációból kell kiszámolnunk, amely az adott ph és Cl - -koncentráció-viszonyok mellett nem idéz elő változást a membránpotenciálban, azaz az eredeti, csak a Cl - -arány által meghatározott membránpotenciál egyensúly esetén megegyezik a valinomycin hozzáadása után a K + - és a Cl - -koncentráció által együttesen meghatározott membránpotenciállal. Felírható: RT F c ln c Cl, IC Cl, EC RT F c ln c K, EC K, IC c c Cl, IC Cl, EC {3} Ebben az esetben a membránpotenciál nem függ értékétől, így meghatározható ennek abszolút értéke [61]. 20
2.2. Membránra ható vegyületek és az emberi vörösvértestmembrán alkálikationtranszportja Az emberi vörösvértestmembrán permeabilitása mind Na + -ra, mind K + -ra nézve igen kicsiny. Bizonyos membránra ható vegyületek a membránba beépülve megnövelik annak permeabilitását, szelektíven, egyes ionokra nézve (pl. a K-szelektív carrier típusú valinomycin) vagy aspecifikusan, pl. a csatornaképző toxinok, antibiotikumok. Mi itt részletesen csak ez utóbbiakkal foglalkozunk. 2.2.1. Melittin A mézelő méh fő toxinja, a melittin egy 26 aminosavból álló, 6 pozitív töltésű oligopeptid, amely monomer ill. tetramer formában fordul elő. A melittin az emberi vörösvértesteket koncentrációtól függően erősen hemolizálja, valamennyi sejt kationpermeabilitását megnöveli és gátolja a K + Na + -ATP-áz enzimet [14]. A permeabilitást növelő hatás azon alapul, hogy a melittin az emberi vörösvértestmembránban valamint más membránban is, pl. bilayer lipid membránban (BLM) csatornákat képez [14, 124]. Tosteson és mtsai [124] planáris BLM-en melittin hatására a membrán két oldala közé kapcsolt elektromos potenciálkülönbségtől függően az áramerősség növekedését mérték, ami arra utal, hogy a működő melittin csatornák száma függ a feszültség nagyságától. Hosszabb ideig végezve a mérést, az áramerősség időben csökkent, vagyis a csatornák inaktiválódtak [125]. Blaskó és mtsai [14] emberi vörösvértestmembránon keresztül melittin hatására mért 86 Rb + ill. 22 Na + transzport kinetikájából arra következtettek, hogy a melittin az emberi vörösvértestmembránban is csatornát képez. A tapasztalat szerint a csatornaképző hatás függ a 21
membránpotenciáltól: míg a fiziológiás körülményekre jellemző 10 mv esetén jelentős 22 Na + influxot mértek, addig 0 mv-os membránpotenciál esetén melittin jelenlétében a 22 Na + nem jutott be a sejtekbe. A melittin hemolízist okozó és a K + Na + -pumpát gátló hatásai ugyanakkor nem függnek a membránpotenciáltól. Tosteson és mtsai [123] szerint a melittin által okozott hemolízis a kolloid ozmotikus mechanizmuson alapszik. Ez abban áll, hogy a csatornákon keresztül az ionok, majd a kialakult kolloid ozmotikus nyomás miatt a víz a sejtbe áramlik, a sejtek megduzzadnak és az ilymódon megnőtt térfogat szétfeszíti a sejtet [77, 133]. 2.2.2. Primycin Az Ebrimycin gél hatóanyaga a primycin, egy először Magyarországon előállított antibiotikum. Szerkezete: arabinóz és guanidino csoportokkal szubsztituált laktongyűrű, amely egy pozitív töltéssel rendelkezik. Az anyag csatornaképző hatását Blaskó és mtsai [13] primycin jelenlétében modell lipid bilayer membránon vezetőképesség mérésekkel, emberi vörösvértestmembránon pedig iontranszport mérésekkel igazolták. Megállapították, hogy a BLM vezetőképessége a primycin koncentráció második hatványával arányos, ami arra utal, hogy az antibiotikum a mesterséges membránban dimer formában képez csatornát. Sugár és mtsainak [114] az iontranszport-kinetikai mérések alapján felállított modellje azt igazolta, hogy az emberi vörösvértestmembránban a primycin dimer aggregátumokból álló csatornákat hoz létre, amiknek felépítésében lipidek is részt vesznek. 22
2.2.3. Gramicidin A A transzportfolyamatokban az egyik legtöbbet vizsgált membránra ható antibiotikum a gramicidin A, egy lineáris pentadekapeptid, amely a membránban dimer formában képez csatornát [60, 114, 122]. Csatornaképző hatását először bilayer lipid membránokon mutatták ki. A csatornák alkáli kationokra csak kismértékben szelektívek, anion-áteresztő képességük csekély [35, 98, 99]. Schagina és mtsai [98] szférikus BLM-en végzett 86 Rb + efflux mérések eredményei alapján megállapították, hogy a gramicidin A csatornákon a 86 Rb + single file diffúzióval transzportálódik, a csatornákban egyidejűleg két kation tartózkodik, amik a gramicidin csatornákon csatolt folyamat révén jutnak át. Blaskó és mtsai [16] az antibiotikummal kezelt emberi vörösvértestmembránon keresztül végbemenő 86 Rb + és 22 Na + transzport kinetikájával igazolták, hogy a gramicidin A az emberi vörösvértestmembránban is csatornákat képez, amik meghatározott élettartammal rendelkeznek. A gramicidin A hatására a vörösvértestmembránban és a BLM-en létrejött alkáli ionpermeabilitás növekedés függ az extracelluláris oldat ionösszetételétől, ami a csatornán áthaladó és a csatornához kötődő kationok közti kölcsönhatásra utal [16, 99]. A gramicidin A által emberi vörösvértestmembránon létrehozott radioaktív iontranszport kinetikájából a csatornák időbeli inaktivációjára lehet következtetni. Schagina és mtsai [97] azt találták, hogy a gramicidin A jelenlétében 20 C-on mért 86 Rb + influx egy exponenciális függvénnyel jellemezhető diffúziós folyamat, míg a 22 Na + influx kinetikáját legalább két exponenciális függvény eredőjeként tudták jellemezni. A membrán 22 Na + -ra vonatkozó permeabilitása ugyanis időben csökkent. Ha 23
a 86 Rb izotópot 140 perccel a gramicidin A adagolás után adták, akkor a 86 Rb + influx kinetikája is két exponenciális összegével volt jellemezhető. Tapasztalataik szerint 30 C-on a membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitása már 90 perccel a gramicidin A hozzáadása után csökken. Ezek az eredmények a gramicidin A csatornáknak a hőmérséklettől függő inaktivációjával értelmezhetők. A vörösvértestmembrán fő lipidjeinek fázisátalakulási hőmérséklete alatt, 6 C-on a gramicidin A jelenlétében a membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitása 4 órán keresztül nem változott, ami arra utal, hogy a gramicidin A csatornák inaktivációjában szerepük lehet a vörösvértestmembrán lipidjeinek is. Schagina és mtsai [101] 20 C-on mérték a 86 Rb + influxot liposzómás előkezeléssel felére csökkentett, ill. 30 %-kal megnövelt koleszterin tartalmú valamint a koleszterin helyett részben ergoszterint vagy 7-dehidro-koleszterint tartalmazó vörösvértestmembránon gramicidin A jelenlétében. A megnövekedett koleszterintartalmú vörösvértestmembrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitása már 70 perccel a 86 Rb + hozzáadása után csökkent, míg a csökkent koleszterin-tartalmú ill. a koleszterin helyett részben ergoszterint tartalmazó vörösvértestmembrán 86 Rb + -permeabilitása változatlan maradt három órán keresztül. Ebből arra következtettek, hogy a gramicidin A csatornák inaktivációjáért a koleszterin gramicidin kölcsönhatás a felelős. Különböző lipidösszetételű (dioleoil-foszfatidil-kolin (DOPC)-ből és koleszterinből/ergoszterinből/szitoszterinből/7-dehidro-koleszterinből álló) lipid bilayer membránon végzett vezetőképesség mérések eredményei azt mutatták, hogy csupán a szteránváz B gyűrűjében két kettőskötéssel rendelkező szterolok hozzáadásával készült membránokon tapasztalható időbeli vezetőképesség-csökkenés, a többi esetben nem. Ez arra utal, hogy a koleszterin B gyűrűjének 2. kettőskötése és a gramicidin közti 24
kölcsönhatás vezet a csatorna inaktivációjához [101]. 2.2.4. Amphotericin B Az amphotericin B polién antibiotikum, amit a terápiában elsősorban szisztémás fungicid szerként alkalmaznak, és hatását úgy fejti ki, hogy a membránban csatornát képez, és ezáltal megnöveli annak permeabilitását. Az amphotericin B mind az anionokra, mind a kationokra vonatkozó permeábilitást modell lipid membránon és vörösvértestmembránon megnöveli [1, 2, 120]. Van Hoogevest és mtsai kimutatták, hogy a szterolok az amphotericin B molekula csatornaképző hatásához szükségesek [127]. Az amphotericin B a gombasejt membránjában található ergoszterinhez igen nagy affinitással kötődik és ehhez képest más szterolok, így az állati sejtekben található koleszterin iránti affinitása kisebb [120]. Lipid bilayer membránon és liposzómákon nyert eredmények alapján feltételezik, hogy a csatornák 8 amphotericin B molekulából és 8 koleszterin vagy ergoszterin molekulából álló komplexek, és két ilyen komplex összekapcsolódásával egy teljes, a membrán kettősréteget átérő csatorna jön létre [29, 127]. Mivel az emberi vörösvértestmembrán jelentős mennyiségű koleszterint tartalmaz, ezért az amphotericin B szterol komplexek ezekben a sejtekben éppúgy kialakulhatnak, mint az ergoszterint tartalmazó gombasejtekben, ennek tudható be a jelenleg legelterjedtebben használt szisztémás gombaölő vegyület igen erős toxicitása. A vegyület mellékhatásainak csökkentésére Wiebe és mtsai [135] az amphotericin B-t liposzómába zárták, és így kevésbé toxikusnak találták. Perkins és mtsai [88] pedig arra az eredményre jutottak, hogy a liposzómába zárt amphotericin B-nek kétféle 25
konformációja létezik, a monomer és egy ún. szalagszerű, kompresszált forma. Ezek közül az utóbbi nem lép kapcsolatba az emberi sejtekkel, így toxicitása lényegesen kisebb, mint az előbbié. Az itt felsorolt csatornaképző vegyületek mindegyike rendelkezik valamilyen antimikróbás hatással, a primicin és a gramicidin A antibakteriális, az amphotericin B fungicid hatása révén vonult be a terápiába. A melittin szintén baktériumölő vegyület, bár igen erős toxicitása miatt e hatását a nem használják terápiás célra. Jelenleg az antibiotikumok igen széles skálája ismert, ugyanakkor hiány mutatkozik fungicid szerekben, különös tekintettel a szisztémás gombaellenes készítményekre; és a meglévő, igen kisszámú vegyület is jelentős mellékhatásokkal bír (l. részletesen 2.3. fejezet). Vizsgálatainkban két ígéretes, új membránra ható gombaellenes vegyületre, a P. syringae pv syringae által termelt ciklikus lipopeptidek családjába tartozó syringomycin E-re és syringopeptin 22A-ra koncentráltunk, és az emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásait tanulmányoztuk. 2.3. Szisztémás gombás betegségek terápiájában jelenleg alkalmazott hatóanyagok összehasonlítása Az immunrendszer legyengülésével járó betegségek és terápiás eljárások miatt egyre növekvőben van az opportunista szisztémás gombás fertőzések elterjedésének gyakorisága és lefolyásának súlyossága. 2.3.1. Hajlamosító tényezők Az opportunista szisztémás gombás fertőzésekre hajlamosító betegségek közül 26
legfontosabbak az AIDS, a tuberculosis, a malignus daganatok (leukémia, lymphoma, szolid tumorok), bizonyos anyagcsere rendellenességek, mint a diabetes mellitus, életmódbeli zavarok, mint az alkoholizmus, a kábítószer-élvezés, valamint égési sérülések, nagy kiterjedésű sebek. Gyakran nem maga az alapbetegség, hanem annak gyógyszeres kezelése gyengíti le a beteg immunrendszerét és növeli meg ily módon a gombás betegségek kialakulásának valószínűségét. Ilyen hatást kiváltó gyógyszerek a citosztatikumok, a széles hatású antibiotikumok, a kortikoszteroidok és a szervátültetésnél alkalmazott immunszupresszív szerek. Más kezelési eljárások pl. az intenzív terápia során alkalmazott infúziós kezelés, hemodialízis vagy mesterséges légzés is járhat hasonló következményekkel [115]. 2.3.2. Kórokozók A szisztémás mycosisok közül a candidiasis fordul elő leggyakrabban. A legtöbb fertőzésért a Candida albicans és a C. crusei a felelős, de a többi Candida faj (C. kursei, C. parepsilosis, C. guillermondii) jelentősége is növekvőben van [58]. Az AIDS-es betegekben igen gyakran kialakuló gombás fertőzés egyik fő okozója a Cryptococcus neoformans, amely tüdőgyulladáshoz vagy agyhártyagyulladáshoz vezethet [58, 130]. Az Aspergillosis elsősorban a tüdőt és a paranazális üregeket támadja meg, a kórokozók az A. fumigatus, A. niger, A. flavus, A. glaucus [58, 115]. Hasonló támadáspontú kórokozó a Mucoraceae család (Mucor, Absidia és Rhizopus fajok) [58, 115]. Egyéb fajok, pl. a Geotrichum candidum, a Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon beigelii is okoznak gombás fertőzéseket gyengült immunrendszerű betegekben [106, 115]. 27
2.3.3. Szisztémás mycosisok gyógyszeres kezelése Az ideális szisztémás gombaellenes szer kritériumai a következők: legyen hatékony valamennyi szisztémás mycosist okozó gombán, per os jól szívódjon fel, parenterális adagolás legyen lehetséges, minimális mellékhatásai legyenek, valamennyi testüregbe és szervbe jusson el. Ezeknek a feltételeknek egyetlen, jelenleg alkalmazásban levő gyógyszer sem felel meg [91, 131]. A szisztémás mycosisok kezelésére gyakran használják az amphotericin B-t, az 5-fluorocytosint, valamint az imidazol- és triazol-származékokat (ketoconazol, fluconazol, itraconazol). a, Amphotericin B Az Amphotericin B polién antibiotikum, ami a gomba sejtfalában levő ergoszterinhez kapcsolódva megváltoztatja a gomba membrán permeabilitását (l. 2.3. fejezet). Előnye, hogy széles hatásspektrumú szer és ritkán alakul ki ellene rezisztencia, hátrányai közé tartozik, hogy csak intravénásan adható. Az Ampho, a rettenetes becenévre hallgató gyógyszernek legnagyobb hátránya, hogy súlyos mellékhatásai vannak, lázat, anémiát, vesekárosodást, tromboflebitist okoz [20, 58, 91]. Ezek a mellékhatások csökkenthetők akkor, ha a hatóanyagot liposzómába zárják (Ambisone ) [135]. b, 5-Fluorocytozin Az 5-fluorocytozin pirimidinbázis, amely a gomba pirimidin metabolizmusának károsításával az RNS-, és ezen keresztül a fehérje szintézist gátolja. A szer előnye, hogy 28
per os is adható, hátránya szűk hatásspektruma és az ellene viszonylag könnyen kialakuló rezisztencia. E miatt általában kombinált kezelés részeként alkalmazzák. Az 5-fluorocytozin mellékhatásai többek között májkárosodás, gasztrointesztinális tünetek, vérképzőszervi elváltozások [58]. c, Triazolok és imidazolok A nemrégiben felfedezett imidazol- és triazolszármazékok a gombaellenes terápia legkorszerűbb szerei: hatásukat a gomba sejtmembránjában levő ergoszterin szintézisének gátlásával fejtik ki. Mivel az állati sejtekben nincs ergoszterin, így jóval kevesebb mellékhatással rendelkeznek, mint az Amphotericin B és az 5-fluorocytozin. 1, Ketoconazol A ketoconazol imadazolszármazék, amelyet leginkább hisztoplazmózisban és blastomycosisban, esetleg candidiasisban alkalmaznak. Hatása lassan alakul ki, ezért csak krónikus szupresszív terápiára jó. Mellékhatásként gasztroenterális és bőrtünetek jelentkeznek a leggyakrabban, de súlyos májkárosodást és gyomorkárosodást is okozhat [58]. 2, Fluconazol A fluconazol jól felszívódik, orálisan és parenterálisan egyaránt alkalmazható hidrofil triazolszármazék. Invazív candidiosisban és cryptococcosisban alkalmazzák, azonban több faj rezisztens vele szemben. Gasztrointesztinális mellékhatásai mellett teratogenitását is meg kell említeni [20, 58, 76]. 29
3, Itraconazol Az itraconazol jól felszívódó, szájon át alkalmazott lipofil triazolszármazék. A fluconazollal szemben bizonyos Aspergillus fajok ellen is hatásosnak bizonyult. Elsősorban Aspergillosis terápiájában használják, mellékhatásai különböző gasztrointesztinális és bőrtünetek [20, 58]. Mindezek alapján megállapíthatjuk, hogy a jelenleg alkalmazott szerek egyike sem ideális az egyre növekvőben levő szisztémás opportunista gombás fertőzések hosszantartó kezelésére, amit még a szűk hatásspektrumaik valamint az ellenük kialakuló rezisztencia is alátámasztanak. Ezért is szükséges lenne újabb, az ideálist mindjobban megközelítő gombaellenes gyógyszereket találni. 2.4. Egy új gombaölő vegyületcsalád, a Pseudomonas syringae pv. syringae által termelt lipopeptidek Egy növényi kórokozó baktérium, a Pseudomonas syringae pv. syringae különböző ciklikus lipopeptideket (CLP) termel, amelyek két fő csoportba sorolhatók: 1, a syringomycinek [47, 55, 102, 109, 126] és más hasonló szerkezetű lipodepszinonapeptidek: a syringostatinok [47], syringotoxinok [47, 55] valamint pseudomycinek [8]; 2, a syringopeptidek [7]. Valamennyi peptid fungicid hatást fejt ki különböző patogén és nem patogén gombafajokon [10, 68, 80, 108]. Emellett a ciklikus lipopeptideknek leginkább a 30
syringopeptideknek szerepük lehet a baktérium által a növényeken kifejtett károsító hatás kiváltásában is [3, 10, 19, 31, 54, 68, 80, 107]. Az első csoportba tartozó syringomycinek, syringostatinok, syringotoxinok, és pseudomycinek szerkezetüket tekintve kilenc aminosavból és lipidfarokrészből álló lipodepszinonapeptidek [8, 47, 55, 102]. Legfontosabb képviselőjük a syringomycin E (SRE) (2-4. ábra). Ez a vegyület fiziológiás körülmények között nettó két pozitív töltéssel rendelkezik a laktongyűrűt alkotó főleg poláros aminosav-oldalláncok jelenléte miatt [100]. A syringopeptidek lipidfarokrészéhez egy 22 vagy 25 aminosavból álló peptidrész kapcsolódik [7]. A 2-5. ábrán látható syringopeptin 22A (SP22A) esetében a 22 aminosav közül nyolc alkot egy laktongyűrűt, szintén két pozitív nettó töltéssel. A laktongyűrűn kívül eső aminosav-oldalláncok nagyrészt apoláros jellegűek, ennélfogva a SP22A a SRE-hez képest erősebben lipofil [10]. Ser Dab Dab + + N H 3 N H 3 O H C H 2 C H 2 Ser OH C H 2 C H 2 C H 2 Arg C H 3 (C H 2) 8 C H C H 2 C O N H C H C O N H CH CO NH CH C O N H C H C O N H + N H 2 CH 3 C H (C H 2) 3 N H C \ O CO N H 2 CO CH N H C O C H N H C O C N H C O C H N H CH O H C H O H C C H 2 / \ CH 2C l C O O - H CH 3 4-Cl-Thr 3-OH-Asp Dhb Phe 2-4. ábra A SRE szerkezete Az ábrán szereplő nem esszenciális aminosavak: Dab: 2,4,-diamino-vajsav; 3-OH-Asp: 3-hidroxi-aszparaginsav; Dhb: 2,3,-dehidro-2-aminovajsav; 4-Cl-Thr: 4-kloro-threonin. 31
2-5. ábra A SP22A szerkezete 32
2.4.1. Ciklikus lipopeptidek hatása a gombákra A syringomycinek és rokon vegyületeik in vitro kísérletek eredményei szerint több patogén és nem patogén gombára hatnak, csaknem valamennyi patogén Candida fajra, a Cryptococcus neoformansra, a Saccharomyces cerevisiaere, a Rhodotorula pilimanaere, egyes Aspergillus és Fusarium fajokra [30, 52, 108], valamint igen kis koncentrációban elpusztítják a Geotrichum candidumot [31, 107]. A syringopeptidek szintén jelentős fungicid hatással rendelkeznek, ám hatásspektrumuk eltér a syringomycinekétől: míg egyes gombákon (Bacillus megaterium, Rhodococcus fascians, Botrytis cinerea) hatásuk nagyobb, mint a syringomycineké, addig a legtöbb gombafajra kevésbé vagy egyáltalán nem hatnak [80]. Valamennyi Pseudomonas syringae pv. syringae által termelt ciklikus lipopeptid közül a legjelentősebb a SRE gombaellenes hatása [10, 108], ami vaginális candidiosisban egereken in vivo alkalmazva is hatásosnak bizonyult [110]. A továbbiakban a P. syringae pv. syringae által termelt ciklikus lipopeptidek első csoportjából főleg a SRE molekulával foglalkozunk. A SRE és a syringopeptidek hatásának fő támadáspontja a sejtmembrán [10, 138]. A mindkét vegyületben megtalálható lipofil farokrész valószínűleg elősegíti a lipopeptidek beépülését a membránba. S. cerevisiae-n és R. pilimanae-n nyert eredmények alapján a SRE a gombasejt membránján keresztül megnövekedett K + -, Ca 2+ -, és H + -fluxust hoz létre [94, 119, 139], megnöveli a membránpotenciált [94, 119, 138, 139] és fokozza a K + H + -ATP-áz enzim aktivitását [94]. Ezek a hatások arra vezethetők vissza, hogy az amfifil szerkezetű SRE a gombasejt membránjában pórusokat képez, ezeken keresztül a K + ki, a H + és a Ca 2+ pedig beáramlik, megnövelve 33
ezáltal a membránpotenciált [10, 67]. A megváltozott külső és belső koncentrációk a K + H + -ATP-áz enzim működését is befolyásolják. A syringopeptidek valószínűleg ezen az úton fejtik ki gomba- és növénykárosító hatásukat [10, 66]. A SRE fungicid hatásának mélyebb megismerése érdekében olyan mutáns S. cerevisiae törzseket hoztak létre, melyek syringomycinre nem reagáltak. Ezeknek a törzseknek a genetikai állományából bizonyos enzimek kódolásáért felelős gének hiányoznak, és ebből következtettek a lipideknek a SRE hatásában játszott szerepére [118]. Az egyik ilyen hiányzó gén a SYR1, amely az ergoszterin szintéziséért felelős egyik enzimet kódolja, így feltételezhető, hogy ez a szterol fontos szerepet játszik a SRE hatásában [117]. Ezt megerősíti Julmanop és mtsainak eredménye [72], akik azt találták, hogy különböző szterolok az extracelluláris térben megvédik a S. cerevisiae-t a SRE hatásától. A vizsgált szterolok (koleszterin, ergoszterin, szitoszterin, sztigmaszterin) közül legjelentősebb védő hatása a koleszterinnek van. Wangspa és Takemoto [132] olyan mutáns S. cerevisiae fajokon vizsgálták a SRE hatását, amik a minimális táptalajon kívül szterolokat is igényelnek növekedésükhöz. Megállapították, hogy a szteroloknak a gombasejtben játszott két fontos funkciója közül a SRE hatásához a növekedést segítő (ún. growth-promoting ) működés szükséges, míg a membrán szerkezeti integritását biztosító ún. bulk funkció nem feltétele a SRE fungicid hatásának. Egy másik, a SRE-re rezisztens S. cerevisiae fajokból hiányzó gén a SYR2 [24]. Ez a gén a sejt foszfolipid tartalmának szabályozásáért felelős, a gombasejt membránjában levő hosszú oldalláncú szfingolipidek szintézisének egyik lépését, a 4-es helyzetű hidroxilációt végző enzimet kódolja [53]. Ennek alapján igen valószínű, hogy a 34
SRE hatásában a szterolok mellett a szfingolipideknek is fontos szerepük van. Ezt megerősítették Stock és mtsai [113] is, akik két új, a SRE-re rezisztens S. cerevisiae fajokból hiányzó gént találtak, amik a hosszú oldalláncú szfingolipidek szintéziséért, valamint a mannóz- és foszfoinozitol-csoportok szfingolipidekhez való kapcsolódásáért felelősek. 2.4.2. Ciklikus lipopeptidek hatása növényi és állati sejtekre A Pseudomonas syringae pv syringae által termelt ciklikus lipopeptidek különböző növényi sejteket is károsítanak. Megfigyelték, hogy a syringomycinek kukorica levelen, tehénborsó hajtáson, őszibarack levelen nekrózist okoznak [54, 107]. Mind a syringomycinek, mind a syringopeptidek sárgarépa gyökérből izolált sejteken elektrolit-kiáramlást hoznak létre [68, 80], Xanthium strumarium levélen K + effluxot követő sztómaelzáródást idéznek elő [32, 86], dohány protoplasztokat lizálnak [66, 67, 68]. Valamennyi hatás szempontjából a syringopeptidek mutatkoznak aktívabbnak. Reidl és Takemoto megfigyelése szerint a SRE a Rhodotorula pilimanae élesztőgomba K + H + -ATP-áz enzimjét aktiválja [94], ugyanakkor különböző növényi sejtekből izolált K + H + -ATP-ázon létrehozott hatása ellentmondásos. Míg Bidwai és Takemoto [11] SRE hatására megnövekedett cékla ATP-áz aktivitást mért, addig Camoni és mtsai [21] SRE és syringopeptidek hatására kukoricagyökérből izolált ATPáz enzim csökkent működéséről számoltak be. Batoko és mtsai [9] rizshajtásból származó ATP-áz enzimen azt találták, hogy a syringomycin kis koncentrációban stimulálja, nagy koncentrációban pedig gátolja az enzim működését. Az 1998 nyarán hazánkban fellépő súlyos dinnyepusztulásért is a Pseudomonas 35
syringae pv syringae baktérium felelős. A károsodott dinnyékből Takemoto és mtsai kétféle, a baktérium által termelt ciklikus lipopeptidet, SRE-t és SP22A-t izoláltak, ezeket használtuk a saját vizsgálatainkhoz is. A ciklikus lipopeptidek hemolítikus hatását különböző állatfajokból származó vörösvérsejteken többen tanulmányozták. Sorensen és mtsai [108] megállapították, hogy a SRE a gombaellenes hatáshoz szükséges koncentrációban (2,5 g/ml) juh vörösvérsejteken lízist okoz. Hutchison és mtsai [66] összehasonlították a SRE és a SP22A ill. a SP22B hemolítikus hatását ló vörösvérsejteken és azt tapasztalták, hogy a lízishez szükséges minimális koncentráció SP22A és SP22B esetében 0,5 nmol/ml, míg SRE esetében 0,6 nmol/ml. Feltételezték, hogy a SRE és a syringopeptidek által okozott hemolízis a kolloid ozmotikus mechanizmus alapján jön létre. Dalla Serra és mtsai [28] szerint a hemolízist okozó SRE koncentráció emberi és nyúl vörösvérsejten egy nagyságrenddel kisebb, mint a hemolízist kiváltó SP22A és a SP25A koncentráció. Ezzel ellentétben Lavermicocca és munkatársai [80] azt találták, hogy juh vörösvérsejtek ugyanolyan mértékű hemolíziséhez kisebb SP22A és SP25A koncentráció szükséges, mint SRE. Megállapíthatjuk, hogy bár a SRE és a syringopeptinek hemolízist okozó hatását valamennyi fent említett munkában kimutatták, mégis, a két vegyület hatáserősségére vonatkozó adatok ellentmondásosak. 2.4.3. Ciklikus lipopeptidek hatása modellmembránokon A SRE és a syringopeptidek a sejtmembránban pórusokat képeznek [10, 28, 67]; a pórusok képződésének és tulajdonságainak tanulmányozása modellmembránokon, bilayer lipid membránon (BLM) és liposzómákon történő fontos lépés a szerek 36
hatásmódjának megismerése érdekében. A bilayer lipid membránok planáris vagy szférikus szerkezetűek, kettős lipidrétegből állnak és az élő sejtek plazmamembránjának modellezésére széles körben nyernek alkalmazást. Feigin és munkatársai [40] tiszta dioleoil foszfatidil-szerinből (DOPS) álló planáris bimolekuláris lipid membránon mért vezetőképesség mérések alapján igazolták, hogy a SRE anionszelektív csatornákat hoz létre. Mivel a CLP hatására létrejött vezetőképesség a SRE koncentráció hatodik hatványával arányos, ezért feltételezték, hogy a csatorna 6 monomerből áll. Hutchison és mtsai [66, 67] kimutatták SRE- és SP22B-, Dalla Serra és mtsai [27] pedig SP25A-pórusok jelenlétét sík lipid bilayer membránon. Dalla Serra és mtsai [28] liposzómákon nyert eredmények alapján azt találták, hogy nagy unilamelláris vezikulákon a SP22A és a SP25A 3-6 molekulából álló pórusokat képeznek. Kaulin és mtsai [74] valamint Schagina és mtsai [100] különböző méretű polietilénglikolszármazékok jelenlétében a BLM vezetőképességének méréséből meghatározták a SRE csatorna átmérőjét, ez 2 nm-nek adódott. Dalla Serra és mtsai [28] különböző méretű cukrokkal a SRE által okozott hemolízist kivédve azt találták, hogy a csatornák mérete függ a SRE koncentrációjától. A SRE-csatornaátmérő 1,4 és 3,4 nm között változik; a SP22A- ill. SP25A-pórusok átmérője pedig a koncentrációtól függetlenül mindig 1,8 ill. 2 nm. Megállapíthatjuk, hogy a kétféle membránon nyert eredmények egymással összhangban vannak. Kaulin és mtsai [74] single channel vezetőképesség mérésekkel kétféle típusú, ún. kis és nagy SRE-csatornát figyeltek meg DOPS és dioleoil foszfatidil-etanolamin (DOPE) 1:1 arányú keverékéből álló BLM-en. A nagy csatorna vezetőképessége kb. 37