HASZNÁLATI UTASÍTÁSOK HASZNÁLATRA KÉSZ TÁPTALAJOK PA-254030.07 Változat: April 2013 BD BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood, Squares HASZNÁLATI JAVASLAT A BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (Mueller Hinton agar 5% juhvérrel) tápközeg különféle kiszerelésekben kapható; a Streptococcus pneumoniae és más streptococcusok klinikai izolátumainak korongos diffúziós antibiotikum-érzékenységi, a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) által szabványosított vizsgálatához használható. 1 AZ ELJÁRÁS ELVE ÉS MAGYARÁZATA Mikrobiológiai módszer. A Bauer-Kirby féle módszer az antibiotikumoknak, melyekkel papírkorongokat itattak át, gélben való diffúzióján alapszik. 2 A teszt során a mikroorganizmus standardizált szuszpenzióját viszik fel a lemez egész felületére. Az antibiotikum vagy más antimikrobiális szer adott adagjával átitatott korongokat a táptalaj felületére helyezik; a lemezt inkubálják, majd a korongok körül megmérik a gátlási zónák átmérőjét. Az CLSI leírja a Bauer-Kirby-féle módszer standard eljárását; a további részletek ott találhatók meg. 1 A Bauer-Kirby módszerrel összhangban számos más nemzeti standardot is kidolgoztak az antibiotikum érzékenység vizsgálatára. Ezek a standardok az inokulum sűrűségében, az inokuláció módszerében, a gátlási zóna méretében és annak értelmezésében különbözhetnek az CLSI Standard-tól. Mivel az antibiotikum érzékenység vizsgálatának nem léteznek általánosan elfogadott európai standardjai, amennyiben az CLSI irányelvei nem alkalmazhatók, a helyi nemzeti standardok szerint kell eljárni. A szuplement nélküli Mueller Hinton Agar, mely amúgy alakalmas a gyorsan növő aerob patogének vizsgálatára, nem felel meg a legtöbb érzékeny mikroorganizmusnak, mint amilyen a Streptococcus pneumoniae is. Az CLSI Document M2 fejezete előírja a Mueller Hinton Agarnak 5% defibrinált juhvérrel való dúsítását, és részletesen leírja a S. pneumoniae-val és más streptococcusokkal való munka minőségi ellenőrzési módját valamint az interpretive kritériumokat. REAGENSEK BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood 1 liter szűrt vízre vonatkoztatva* Húskivonat 2,0 g Kazein savas hidrolizátuma 17,5 Keményítő 1,5 Agar 17,0 g Juhvér, defibrinált 5% ph 7,3 +/- 0,2 *Úgy beállítva és/vagy összekeverve, hogy megfeleljen a működési követelményeknek. FIGYELMEZTETÉS In vitro diagnosztizáláshoz Csak szakember kezéhez. Ne használja a lemezeket, ha azon mikrobiális szennyeződés, kiszáradás és betöredezés, ill. a károsodás bármilyen más jelét észleli. Amennyiben ez a táptalaj kiszáradás miatt erősen zsugorodott, úgy az hamis eredményekhez vezethet. A steril munkával, a biológiai veszélyekkel és a használt termékek hulladékként való kezelésével kapcsolatban olvassa el az ÁLTALÁNOS HASZNÁLATI ÚTMUTATÓT. PA-254030.07-1 -
TÁROLÁS ÉS ELTARTHATÓSÁG Átvétel után felhasználásig, a lemezeket sötét helyen, 2-8 C-on az eredeti lezárt tasakban tárolja. Kerülni kell a lemezek megfagyását, illetve túlmelegedését. A lemezeket a lejárati időn belül kell inokulálni (lásd: olás címkéje) és az előírt inkubációs időt be kell tartani. A felbontott 10-es olás lemezeit, tiszta helyen, 2-8 C-on tárolva, egy héten belül fel kell használni. FELHASZNÁLÓI MINŐSÉGI ELLENŐRZÉS A felhasználói minőségi ellenőrzéshez amennyiben lehetséges kövesse az idevágó CLSI-t 1, vagy amennyiben az nem alkalmazható, úgy kövesse a nemzeti standardokat. Általában a következőkben az Eljárás címszó alatt felsorolt lépéseket kell követni, beleértve a S. pneumoniae ATCC 49619 kontroll törzset, és azt, hogy a laboratórium által használt antibiotikumos korongok hatékonyágát legkevesebb hetente kétszer ellenőrizni kell. A megfelelő gátlási zóna átmérő értékek az CLSI Document M100 fejezetében találhatók, melyek az CLSI Document M2 részét képzik. 1 A nem inokulált táptalaj színe: Vörös (vérszínű), opalizáló ELJÁRÁS Szállított anyagok BD Mueller Hinton II Agar with 5% Sheep Blood (különböző lemez méretekben; lásd Kiszerelések). Mikrobiológiailag ellenőrzött Nem szállított anyagok 1. Inokulum tápleves 5 ml-es adagokban, mint pl. Mueller Hinton II Agar (BBL Kat.sz.:4397701, 16 x 102 mm csövekben) vagy 0,9%-os fiziológiás sóoldat, a standard inokulumok elkészítéséhez. 2. Bárium-szulfát összehasonlító standard (0.5 ml 0,048 M BaCl 2 [1,175% w/v BaCl 2 2H 2O] 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% v/v]-hoz). 3. Fotometrikus készülék az inokulum szuszpenzió turbiditásának beállításához, hogy az ekvivalens legyen a 0,5 McFarland-os standarddal. 4. A fent felsorolt eszközök (1-3) helyett használható a BD Prompt Inoculation System (térfogatmérésen alapuló inokulum készítő eszköz). 1,3 5. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 kontroll tenyészet. 6. Meghatározott mennyiségű antimikrobiotikummal átitatott papírkorongok, pl. BD Sensi- Disc antibiotikum érzékenység mérő korongok. 7. Elosztó eszköz, mint pl. a BD Sensi-Disc Self-Tamping 6-, 8-12-Place Dispenser. 8. A gátlási zónák méréséhez tolómérő, vagy vonalzó. 9. Egy inkubátor, mely 5%-os CO 2 tartalmú légkört képes biztosítani, vagy bármilyen más eszköz mely hasonló CO 2 tartalmú légkört képes előállítani. 10. Kiegészítő táptalajok, reagensek, laboratóriumi eszközök, az előírásoknak megfelelően. Minták típusa Ez a termék klinikai mintából izolált tiszta tenyészetek antibiotikum-érzékenységének tesztelésére szolgál (lásd még: TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI). A teszt kivitelezése S. pneumoniae tesztelésekor a közvetlen telep-szuszpenzió módszert kell alkalmazni. 1 Dolgozzon aszeptikusan. 1. Győződjön meg arról, hogy rendelkezésre áll egy friss (= 24 órás), nem szelektáló véres agarról származó kultúra. 2. Suszpendálja a telepet pl. Mueller Hinton II Broth-ban (tápleves) vagy steril, 0,9%-os fiziológiás sóoldatban. Állítsa be a turbiditást a bárium-szulfát standardnak (0,5 McFarland) megfelelően. A standard és az inokulum turbitásának méréséhez tartsa mindkét kémcsövet egy fehér háttér elé, melyen vékony fekete vonalak vannak, ill. használjon egy fotometrikus mérőműszert. PA-254030.07-2 -
3. Azokat az alternatív inokulum készítési módszereket, melyek folyamán olyan eszköz kerül alkalmazásra, mely lehetővé teszi a turbiditás beállítása nélkül az inokulum standardizálását, mint pl. a BD Prompt Inoculation System, elfogadásra kerültek a rutin teszt eljárások körében. 1,3 4. Legfeljebb 15 perccel az inokulum turbiditásának beállítása után, merítsen bele egy steril mintavételi pálcikát a pontosan hígított inokulumba, majd néhányszor görgesse meg azt a kémcső felső részéhez nyomva, hogy a felesleges nedvességet kipréselje. 5. A lemezen a BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood agar teljes felületét három alkalommal inokulája úgy, hogy az egyenletes szélesztés érdekében minden inokulálás után 60 -os szögben fordítsa el a lemezt. 6. Mielőtt felhelyezné a hatóanyaggal átitatott korongokat, annak érdekében, hogy az agar felülete beihassa a felesleges nedvességet, a lemezek fedelét 3 percig hagyja félig nyitva és legfeljebb 15 percre tartsa szobahőmérsékleten a lemezeket. A 150 mm-es lemezeken legfeljebb 9, a 90 és 100 mm-es lemezeken pedig legfeljebb 4 korongot használjon. A S. pneumoniae penicillin érzékenységének tesztelésére 1 g oxacillin korongot használjon. 4 7. Inkubálja a lemezeket 20-24 órán át, 35 C-on, 5% CO 2 -ot tartalmazó légkörben. Eredmények Inkubálás után a legtöbb lemezen összefolyó telepeket fog találni. Amennyiben kizárólag különálló telepek fejlődnek, az inokulum túl híg colt és a tesztet meg kell ismételni. Levett fedővel, felülről mérje meg a teljes gátlási zónák méretét (szabad szemmel észleve) a korong átmérőjével egyetemben, kerekítsen kerek milliméterre, egy tolómérő vagy vonalzó segítségével. 5 A végpontokat ott kell felvenni, ahol szabad szemmel jól látható, hogy nincs növekedés. Az apró, nehezen látható telepeket hagyja figyelmen kívül. A BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood táptalajon a gátlási zóna méretét kell megmérni és nem a hemolízis gátolt zónájét. Számlálás és az Eredmények értelmezése A gátlási zónák átmérőjét S. pneumoniae esetében a CLSI Document M100 (M2) 2G Táblázatának adataival, más streptococcusok esetében a 2H táblázat adataival hasonlítsa össze, ahol interpretive kritériumokat is talál. 1 A kapott értékeket sorolja a rezisztens, közepesen érzékeny vagy érzékeny kategóriákba. Ügyeljen az ebben a standardban a S. pneumoniae oxacillin 19 mm gátlási zónájával kapcsolatban feltüntetett speciális interpretive kritériumokra (lásd még TELJESÍTMÉNY JELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI). Megjegyzés: Az CLSI Document M2 fejezetének kiegészítései, vagy az átdolgozott változatai, melyek az antimikrobiális korongok módosított táblázatait és a interpretive standardokat tartalmazzák, időszakosan jelennek meg. Az aktuális ajánlásokról a legfrissebb táblázatokból értesülhet. A teljes standard és a kiegészítő anyagok megrendelhető: Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100. TELJESÍTMÉNY JELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI Ezt az antibiotikum-érzékenység tesztet kizárólag tiszta tenyészetekkel lehet elvégezni. Az antibiotikum-érzékenységi teszt elvégzése előtt tanácsos az izolátumok gram-festését és előzetes identifikálását elvégezni. 1 Ezt a táptalajt a S. pneumoniaea és más streptococcusoknak egyes antibiotikumokkal szembeni érzékenységének tesztelésére használják. 1,2,5 Megjegyzés: amoxycillin, ampicillin, cefepim, cefotaxim, ceftriaxon, cefuroxim, imipenem és meropenem esetében S. pneumoniaehez nem létezik megbízható antibiotikum-korongos-érzékenységi teszt. Ezeknek az antibiotikuomknak az in vitro aktivitását célszerűbb egy MIC módszerrel meghatározni. 1 A S. pneumoniae penicillin érzékenységének meghatározásához használjon oxacillin korongot. A 20 mm-es oxacillin gátlási zónát mutató S. pneumoniae izolátumok érzékenyek (MIC 0.06 mg/ml) penicillinre. Mivel az oxacillin szűrés 19 mm-es gátlási zónái átfedésben vannak a penicillin-rezisztens, közepesen érzékeny, és bizonyos érzékeny törzsek eredményeivel, a penicillin, meropenem és cefotaxim vagy ceftriaxon MIC-et minden, oxacillinnel 19 mm-es gátlási zónát eredményező S. pneumoniae izolátum esetében meg kell határozni. 1 PA-254030.07-3 -
Nem S. pneumoniae streptococcusok esetében a penicillin érzékenység nem javallott oxacillin teszttel megahtározni. Béta-hemolitikus streptococcusok esetében használjon penicillin vagy ampicillin korongot. A viridans csoport streptococcusai esetében a penicillin és oxacillin korongteszt nem megbízható; érzékenységüket MIC-teszttel kell meghatározni. 1 Házon belül, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 felhasználásával, antibiotikumérzékenységi vizsgálatot végeztek el cefaclor, cefprozil, kloramfenikol, erythromycin, ofloxacin, tetracyclin, trimethoprim/sulfamethoxazole és vancomycin korongokkal. A M2-A5-ben leírt teszt eljárásnak megfelelően húsz tesztek végeztek el a minőőség ellenőrző törzzsel és nyolc antibiotikum koronggal; a teszt időtartama 10 nap volt. Mind a nyolc antibiotikum esetében 100%-ban (160/160) a gátlási zónák mérete beleesett abba a tartományba, mely a M2-A5-ben és az NCCLS Document M100-S6 fejetének 3C Táblázatában jelent meg. 6,7 Tetracyclin esetében a standard eltérés kevesebb, mint 1 mm volt, az összes többi antibiotikum esetében pedig kevesebb, mint 2 mm volt. 8 A vizsgálatot a fenti antibiotikumok mindegyikével két különböző helyen (naponta háromszor, három napon át) megismételték a S. pneumoniae ATCC 49619 és másik kilenc, jól leírt S. pneumoniae törzzsel. Minden antibiotikum esetében az NCCLS Document M2-A5 fejezetének 2C Táblázatának és a M100-S6 kiegészítésének gátlási zónákra érvényes interpretive standardjait követték. 6,7 Az antibiotikumokkal, kloramfenikol, erythromycin, ofloxacin, tetracyclin és vancomycin, végzett tesztek eredményei 95%-nál magasabb arányban egyeztek az NCCLS referencia módszerrel. A trimethoprim/ sulfamethoxazole-lal végzett tesztek eredményei 90%-os arányban egyeztek az NCCLS referencia módszerrel. A reprodukálhatóságot nem lehetett meghatározni a cefaclor és a cefprozil esetében, mivel ennek a két antibiotikumnak hiányoznak az interpretive standardjai. A fent ismertetett tanulmányok alapján a cefaclor, a ceprozil vagy a trimethoprim/ sulfamethoxazole használata nem ajánlott a S. pneumoniae-nak ezen a táptalajon való tesztelésekor. Ezenkívül, a szakirodalom is beszámol jelentős hibákról a Mueller Hinton sheep blood Agar-os lemezeken alkalmazott trimethoprim/ sulfamethoxazole korongos érzékenység vizsgálatok során. 9 Bizonyos mikroorganizmus-antibiotikum kombinációk esetében a gátlási zóna határa nem válik el élesen, ami pontatlan leolvasást eredményezhet. Kiderült, hogy a korongmódszeres antibiotikum-érzékenység vizsgálatot számos tényező befolyásolhatja. Ezek közé sorolható a táptalaj vastagsága, a korong potenciája, az inokulum koncentrációja és életkora, valamint a ph. 2 A nem megfelelő koncentrációjú inokulum pontatlan eredményeket adhat. A gátlási zóna túl kicsi, amikor az inokulum túl sűrű, ill. túl nagy, amikor az inokulum túl híg. Az antibiotikum érzékenység mérő korongok helytelen tárolása következtében, azok hatékonysága csökkenhet, ami hamis rezisztencia eredményekhez vezethet. Egy mikroorganizmusnak az in vitro érzékenysége egy adott antimikrobiotikummal szemben nem jelenti feltétlenül azt, hogy ez a hatóanyag in vivo is hatékony lesz. A kapott eredmények értelmezéséhez tanulmányozza az idevonatkozó szakirodalmat. 2,10 Nem S. pneumoniae streptococcusok és béta-hemolitikus streptococcusok esetén ne ezt a táptalajt használja a baktériumok érzékenységének korong módszerrel való teszteléséhez. IRODALOMJEGYZÉK 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Approved Standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 2. Washington, J.A., and G.L. Woods. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 4. Swenson, J.M., B.C. Hill, and C. Thornsberry. 1986. Screening pneumococci for penicillin resistance. J. Clin. Microbiol. 24:749-752. PA-254030.07-4 -
5. Hindler, J.F., and J.M. Swenson. 2003. Susceptibility test methods: fastidious bacteria. In: In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8thed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1993. Approved Standard: M2-A5. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 5th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1995. Sixth informational supplement: M100- S6. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 8. Data on file at Becton Dickinson Microbiology Systems. 9. Jorgensen, J.J. 1994. Detection of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae by use of standardized susceptibility testing methods and recently developed interpretive criteria. Clin. Microbiol. Newsl. 16(13)97-104. 10. Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr. 1991. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society of Microbiology, Washington, D.C. KISZERELÉSEK BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (90 mm Stacker lemezek). Cat. No. 254030 Cat. No. 254080 Használatra kész táptalajok, 120-as BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) Cat. No. 255080 BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood, Squares (120 x 120 mm) Cat. No. 254517 TOVÁBBI INFORMÁCIÓK További információkért forduljon a BD helyi képviselőjéhez. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD PA-254030.07-5 -