Neurofiziológiai kurzus tervezett program I. Félév celluláris neurofiziológia A neuronok elektrofiziológiája: membrán potenciál, ioncsatornák és ion transzporterek; elektrotónusos és akciós potenciálok ionális mechanizmusai, a membrán passzív elektromos tulajdonságai és ennek következményei az ionáramok mérése és jellemzése Szinaptikus transzmisszió: a szinapszis felépítése és típusai, pre- és posztszinaptikus celluláris folyamatok a kémiai szinapszisban, neurotranszmitterek és transzmitter receptorok, intracelluláris szignalizáció, posztszinaptikus potenciálok, a szinaptikus plaszticitás alapjai, wiring versus volume transmission A szenzoros transzdukció celluláris alapjai: a szenzoros inger neurális aktivitás összefüggés általános törvényszerűségei, a szenzoros (generátor) potenciál keletkezése különböző szenzoros modalitásokban, a szenzoros információ kódolása a neuronokban A neuronok kalcium háztartása és annak élettani és kórélettani vonatkozásai az ic. Ca2+ tranziensek mérése Intracelluláris transzport folyamatok a neuronokban: az axonális transzport mechanizmusai és jelentősége, a neuronális (membrán) fehérjék életciklusa az axonális és az intraneuronális transzport folyamatok vizsgálata Neurogenezis, differenciálódás (cell faith), fejlődés és regeneráció, neuronális őssejtek, de novo neurogenezis, neurotrophikus faktorok és egyéb trofikus szignálmolekulák, axonal guidance A neuronok intermedier anyagcseréjének és energiaháztartásának jellegzetességei. A neuronális energiaháztartás zavarai, a mitochondriumok szerepe a neuronális funkciókban és a neuronok károsodásában, neurodegeneráció és apaptózis Ajánlott irodalom: Principles of Neural Science (Eric R. Kandel, James Schwartz, and Thomas Jessell) Neuroscience, 2nd ed. (Dale Purves, George J Augustine, David Fitzpatrick, Lawrence C Katz, Anthony-Samuel LaMantia, James O McNamara, and S Mark William) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=neurosci http://nobelprize.org/ - Official web site of the Nobel Prize Élettan tankönyvek (Fonyó A. Ligeti E.: Orvosi Élettan) A molekuláris élettan alapjai (Dr. Erdélyi Lajos) Basic Neurochemistry, 6th ed. (George J Siegel, MD, Bernard W Agranoff, Wayne Albers, Stephen K Fisher and Michael D Uhler) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=bnchm A plazmamembrán klasszikus fluid mosaic modellje (Singer és Nicholson, 1972 ) A plazmamembrán felépítése I. lipidek - lipoidok Amphiphyl lipid molekolák által képzett lipid kettősréteg: foszfolipidek: foszfatidilkolin, foszfatidilszerin, foszfatidiletanolamin, stb. sphingomyelin glikolipidek: gangliozidok koleszterin Spontán membrán képződés (mesterséges membránok) + micellák, liposzómák A lipidmembrán permeabilitása: hirofób anyagok >> hidrofil anyagok Plaszticitás: deformáció, lefűződés, összeolvadás Lipid Raft -ok: koleszterinben és glikolipidekben gazdag membrán szigetek (raftok): Detergent Resistant Lipid Microdomain Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 1
Lipid kettősréteg Diffúziós konstans függ: hőmérséklettől A diffundáló anyag és a diffúziós barrier fiziko-kémiai tulajdonságaitól: Zsír- és vízoldékonyság Palzmamembrán esetében magas permeabilitás: gázok, etilalkohol, urea, lipidek nagyméretű vízoldékony molekulák és ionok: nagyon csekély permeabilitás Suggested definition of lipid rafts (Pike LJ. 2006. J. Lipid Research "Membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, steroland sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized to form larger platforms through proteinprotein and protein-lipid interactions." Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 A lipid raftok A plazmamembrán alkotói II. - fehérjék (a tömeg 25-70%-a) Az hidrofób amninósav oldalláncok és a zsírsav láncok közötti apoláros kölcsönhatások rögzítik az egyes fehérjéket -transzmembrán domének hidrofób aminósav oldalláncok dominálnak (Val, Leu, Ile stb.) A fehérjék (és a lipoidok) transzport vezikulák segítségével recirkulálnak Intraceluláris transzport folyamatok biztosítják a fehérjék célzott mozgását Trafficking, axonális (dendritikus) transzport Jelentőségük: platform egyes fehérjék felszíni sűrűségének növelésére, fehérje komplexek kialakulására és stabilizálására (jelátvitel, endo-/exocitózis, stb.) Laterális diffúzió: a membrán alkotó molekulák mozgása a membrán síkjában Single Particle Imaging/Tracking de: a laterális diffúziót különböző kölcsönhatások akadályozhatják: más membrán fehérjék, citoszkeleton, membránszkeleton ( Confinement ) 2
Anyagáramlás a IC és az EC folyadéktér között transzmembrán transzport folyamatok Szabad diffúzió Ioncsatornán és pórusokon keresztül történő transzport Facilitált diffúzió (karrier/transzporter mediált passzív transzport) Karrier mediált aktív transzport (pumpák) Exo- és endocytózis (vezikuláris transzport) Transzport molekulák Ioncsatornák és pórusok (porinok, perforin, komplement MAC) Karrier molekulák, pumpák Hajtóerő lehet passzív: koncentráció grádiens Ionok: elektrokémiai grádiens (Nernst potenciál) aktív trp.: metabolikus energia (ATP hidrolízis) Általános tulajdonságok: Specifikus: szelektív permeabilitás, szubsztrátspecifikus kötés Szaturáció: A transzport sebessége függ az aktív karrierek/csatornák mennyiségétől (T max ): maximális transzport ráta Hőmérséklet függőség Aktiválható/szabályozható: Gating (csatorna alegységek konformáció váltása Kovalens/nem-kovalens modifikációk gén expresszió változás, transzlokáció Szelektív gátolhatóság szelektív farmakonokkal gátolható (aktiválható) (pl. kompetitív kötés, csatorna gátlás) Csatornák: Vezetőképesség: 10 6-10 8 ion/s (Siemens (S): ps = 10-12 S) Ionszelektivitás: szelektív és nem szelektív ioncsatornák (pl. NMDA receptor) Rektifikáció: a csatorna vezetőképessége függhet az áram irányától is A csatornák aktivitása (nyitás/zárás) általában szabályozott: kapuzás (Gating) feszültségfüggő csat. (transzmembrán potenciál) ligandfüggő csat. (transzmitter, mediátor) feszülés érzékeny csat. (mechano- és ozmoreceptorok) hőmérséklet érzékeny csat. (termoreceptorok) intracelluláris szignálra érzékeny csat. (g-fehérje, foszforiláció, stb.) Szivárgó (leaky) csatornák tartósan nyitott csatornák membrán potenciál beállítása background current 3
Az ioncsatorna működés funkcionális modellje kölcsönhatás a transzportált ion és a csatorna között A pórus domain konzervetív konszenzus szekvenciája IC EC Ion potenciális energiája MacKinnon, Nobel ea. 2003 Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Az ionáramok feszültségfüggése a rektifikáció jelensége I m Kifelé (outward) rektifikálás Az ioncsatorna kapuzás molekuláris háttere Ohmikus áram (nincs rektifikáció) E m Befelé (inward) rektifikáció Voltage-current relationship of Kir 2 channels MacKinnon, Nobel ea. 2003 4
Hot on the trail of TRP channel structure. Moiseenkova-Bell VY, Wensel TG. J Gen Physiol. 2009 Mar;133(3):239-44. Comparison of reported structures from electron microscopy of TRP channels and other membrane proteins. Negative stain structures, resolution: Prestin, 20 Å (Mio et al., 2008a); CFTR, 20 Å (Mio et al., 2008b); TRPM2, 37 Å (Maruyama et al., 2007); TRPC3, (Mio et al., 2005). Cryo electron microscopy structures: Na channel, 19 Å (Sato et al., 2004); InsP3 receptor, 20 Å (Sato et al., 2004); TRPC3, 15.3 Å (Mio et al., 2007); TRPV1, 19 Å (Moiseenkova-Bell et al., 2008). Fourier shell correlation >0.5 is used as the resolution criterion for electron microscopy structures. X-ray structure: Kv2.1-1.2, 2.4 Å (Long et al., 2007). J Gen Physiol. 2009 March; 133(3): 239 244. doi: 10.1085/jgp.200810123. Példa I.: ligandfüggő ioncsatorna - nikotinerg acetylcholin (Ach) receptor ionotróp receptor: a receptor fehérje egyben ioncsatorna is (motoros véglemez, vegetatív ganglion) Példa II.: feszültségfüggő ioncsatorna TTX (tetrodotoxin) érzékeny Na+-csatorna (axolemma, izomrostok) 5
Példa III: g-fehérje (receptor) kapcsolt ioncsatorna: muszkarinerg Ach receptor (szív, zsigeri simaizomsejtek, szekretoros hámsejtek) Metabotróp receptor: a ligand kötés másodlagos hírvivőket aktivál Példa IV.: Hőmérséklet függő ioncsatornák A hőmérséklet hatására aktiválódó ioncsatornák Fájdalmas meleg (>43 C) receptor ( capsaicin is aktiválja paprika hatóanyaga) hideg (<25 C) receptor (menthol is aktiválja borsmenta) elsődleges érző neuronok, fájdalom és hőérzékelés Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 Nagy und Rang J.Neusci. 2002 Az ioncsatornák (ionáramok) jellemzése A kation csatornák kombinatórikus evolúciója Farmakológiai módszerek agonisták (aktivátor anyagok) vagy antagonisták (gátlószerek: nyitás gátlása, refrakteritás stabilizálása) Tetrodotoxin (TTX) (fugu vernicularis) Feszültségfüggő Na + csatorna gátlása Skorpió toxin: számos K + csatorna gátlószere 6
A feszültségfüggő Ca 2+ csatornák családfája (új nómenklatúra) http://www.iuphar-db.org/index.jsp Molekuláris biológiai módszerek: Heterológ expresszió sejtkultúrákban (Xenopus oocyta, inmortalizált sejtvonalak) Knock-out egér modellek, antiszenz RNS, RNS-interferencia: a vizsgált csatornák expressziójának célzott gátlása Karrier-mediált transzport : Enzim analógia: S (IC) S+karrier S (EC) Transzport sebessége: <10 4 (pumpák 10 2 ) ion(molekula)/s Passzív trp. (facilitált diffúzió): csak az elektrokémai grádiensnek megfelelő irányba lehetséges Aktív trp. (primer, szekunder, tercier): az elektrokémai grádienssel szemben is folyhat metabolikus energia (ATP) felhasználásával Primer aktív trp.: pumpák, ATPáz aktivitással Szekunder/tercier aktív trp.: passzív transzporterek és ionpumpák kapcsolt transzport rendszert képeznek Uniporter: 1 molekula transzportja (pl. GLUT1-5: glukóz transzporter család) Szimporter: több ion/molekula egyirányú transzportja Antiporter: több ion/molekula ellentétes irányú transzportja Példa : primer aktív transzport Na+/K+ ATPáz (pumpa) elektrogén antiport ECF ICF A transzportált anyagok sztöchiometrikus aránya ionok transzportja esetén: Elektrogén transzport: nettó töltésáramlás egy irányba (pl. Na/K ATPáz: 3 Na + vs. 2 K + ) Elektroneutrális transzport: nincs nettó töltésáramlás (pl.: H + /K + pumpa: 1:1 arány) Szelektív gátlóanyag: szívglikozidok (Digoxin, Ouabain) Digitalis lanata gyapjas gyűszűvirág ATP hiány hatása a sejtek Na+ transzportjára (DNP: dinitro-fenol) Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997 7
A vezikuláris monoamin transzporter (VMAT) szekunder (H+ kapcsolt) aktív transzport Cytoplasm SERT: szeroteonin transzporter (reuptake): Na + ; Cl - kapcsolt transzport Extracellular fluid Transzmembrán potenciál (E m ) Nyugalmi potenciál (E 0 ): (Bernstein 1900 évek sértési pot.; Young: óriás axon) Elektromos szempontból nyugalomban lévő sejt membránján mért potenciál különbség (a membránpotenciált befolyásoló külső és belső ingerek hiánya) Mértéke sejttípustól függ: -90 - -50 mv Az ionkoncentrációk és az iontranszport determinálják Mérése: mikroelektróda + erősítő + voltméter direkt elektromos kontaktus szükséges Élettani szerepe: Ingerület képzés és ingerület továbbítás Transzportfolyamatok hajtóereje A sejttérfogat szabályozásának faktora A sejtek többsége stabil, negatív membrán potenciállal rendelkezik a stabilitást folyamatos ATP felhasználás biztosítja (akár az ATP 70%-át is felemészti) Bizonyos sejtek nem rendelkeznek stabil E 0 -lal: pacemaker (ritmusgenerátor) sejtek Ionok diffúziós egyensúlya - töltésszétválasztás - a Nernst potenciál Az extracelluláris és az intracelluláris folyadéktér aszimmetrikus ioneloszlása ECF (mmol/l) (intersticiális folyadék) ICF (mmol/l) (sejtplazma) A kémiai (koncentráció grádiens) és az elektromos (elektrosztatikus erőtér) hajtóerők egyensúlya következtében a nettó ionáramlás megszűnik diffúziós egyensúly Nernst potenciál megadja a vizsgált ion diffúziós egyensúlyi állapotában mért feszültséget (Nernst v. reversal potential) Kiindulási állapot diffúziós egyensúly - + 0.00004 (ph=7.4) Plazmamembrán Szelektív K + permeábilis membrán Negatív Pozitív 8
A Nernst egyenlet: megadja az adott ion egyensúlyi potenciálját az adott ECF és ICF koncentráció értékek mellett: Z = ionok töltése R = gáz konstans F = Faraday konstans T = hőmérséklet T=37 ºC Az egyes ionokra számított egyensúlyi potenciál értékek (ld. korábbi adatok): Problémák: A különböző ionoknak eltérő egyensúlyi potenciáljuk van Ezek az értékek eltérnek a tapasztalati E 0 értékétől is Egyensúlyon alapuló tartós membránpotenciál feltétele, hogy a figyelembe vett ionok (K+, Na+, Cl) nettó diffúziója (ionáram) nulla legyen. Ohm törvénye: R = U / I I = U / R és I = U x g (g=vezetőképesség) Mekkora az egyes ionokra ható elektrokémiai hajtóerő (E i ) =?? - Az aktuális membránpotenciál (Em) és az ion egyensúlyi potenciáljának (E Nernst ) a különbsége: E i = E Nernst E m Pl. A kálium áram (I K+ ) nagysága: I K+ =Ei K+ x gk + =(E K+ - E m ) x gk + ΣI net = 0 = I K+ + I Na+ + I Cl- = g K+ x Ei K+ + g Na+ x Ei Na+ + g Cl- x Ei Cl- Goldmann-Hodgkin-Katz (GHK) egyenlet: Megadja az egyensúlyi membránpotenciál értéket az adott ionkoncentráció és ion permeabilitás (konduktancia) értékek esetén: A sejtmembrán nyugalmi permeabilitás (konduktancia) értékeinek aránya: P K : P Na : P Cl = 1 : 0,04 : 0,45 Magas K+ permeabilitás - a nyugalmi potenciál közel van a K + egyensúlyi potenciáljához. A fenti paraméterekben bekövetkező változások az E m (E 0 ) változását okozzák! E m negatív irányba tér el: hiperpolarizáció E m pozitív irányba tér el: depolarizáció Az ionkoncentrációk megváltozása: [K + ] az ECF-ban megnő (hyperkalémia): depolarizáció (transzmitter release kísérletek) [K + ] az ECF-ben lecsökken (hypokalémia): hiperpolarizáció (arrhythmiák, idegi zavarok A konduktancia változik meg (pl. ioncsatornák aktiválódása/zárása): fázikus (gyors) változások: akciós potenciál feszültség függő csatornák öngerjesztő ak tónusos (lassú) változások: posztszinaptikus potenciál, szenzoros (generátor) potenciál Újabb probléma: az ionok folyamatos egyirányú áramlása (A. ábra) hamar megszüntetné a koncentráció grádienst végül az E m 0 mv körül stabilizálódna! Az élő sejtekben egy elektrogén transzport a passzívan diffundáló Na + és K + ionokat visszajuttatja az ECF-be illetve ICF-ba, és stabilizálja a membrán potenciált (B. ábra) Na + -K + ATPáz A sztöhiometrikus arány: 3 Na + kifelé 2 K + befelé (nettó 1+ kifelé/ciklus) Az ATPáz elektrogén hatása eltolja a GHK egyenletből számított egyensúlyi potenciál értékét még kb. 5 mv-tal a negatív irányba - hiperpolarizáló pumpa potenciál Következmények: A Na-K ATPáz gátlása (pl.: ouabain, hypoxia) depolarizálja a membránt. Az E m csökkenése Cl - (és Na + ) beáramlást okoz, ami sejtduzzadáshoz vezet (pl.: az agyban ödéma alakul ki) Na + -K + ATPáz részt vesz a sejttérfogat szabályozásában! A) passzív diffúzió B) Em=-70mV passzív diffúzió Em=-65mV Na + Na + K + IC EC K + IC Na + K + aktív transzport EC 9
A membrán kapacitás jelentősége A plazmamembrán kondenzátorként is viselkedik (a lipid kettősréteg a szigetelő réteg, a szomszédos folyadék réteg a vezető). Nyugalmi állapotban a membrán kapacitása határozza meg az E m feszültségű elektromos erőteret fenntartó ionok mennyiségét C=Q/U Q=C m x U m (U m =E m ) C m nagyságát a membrán felszíne, vastagsága és a dielektromos állandó határozzák meg Példa: Gömb alakú, 50 µm átmérőjű sejtnél E m =- 60 mv, a membrán kapacitása Cm= 1 µf/cm 2 A számítás szerint 30 x 10 6 töltés (ion) tartja fenn a membránpotenciált. Azonban ez csak 1/200 000 része a teljes intracelluláris ionmennyiségnek! A membránpotenciál passzív változásai: elektrotónus A sejt (membrán) ingerlése intracelluláris elektródával A potenciál változás lefutása: membrán kapacitás gyors kisülése (kezdeti gyors depolarizáció) kationok kompenzáló kiáramlása fokozódik (késői lassú depolarizáció és steady state) Befelé irányuló áram (+ töltések) depolarizáció Kifelé irányuló áram (+ töltések) hyperpolarizáció Az elektromos ingerléssel kiváltott passzív potenciál változást elektrotónusos potenciál változásnak vagy elektrotónusnak nevezzük. E m (E max ) arányos a stimuláló áram intenzításával és a membrán ellenállásával. E 0 Stimuláló áram electrotónusos potenciál sejt A membrán kapacitás hatása a passzív membránpotenciál változás időfüggésére A passzív membrán tulajdonságok szerepe az ingerület szummációban - temporális szummáció (repetitív ingerlés depolarizáció hatása összeadódik) Ohmikus komp. Kapacitív komponens τ = time constant (63% Vm) 10
Az elektrotónusos potenciál terjedése elongált struktúrákban (rostokban) Az áramsűrűség térbeli alakulása az ingerlés környezetében Az EP amplitúdója a távolsággal exponenciálisan csökken - dekrementum Ok: a depolarizáló áram a stimulus helyétől folyamatosan csökken (inhomogén árameloszlás) lokális áramkörök modell (kábelteória) R m membránellenállás R a axon (hossz) ellenállás Hossz konstans (37% E max ): - R m : egyenesen arányos - R a : fordítottan arányos 37% E max R a = axon (hossz) ellenállás az axon vastagsága befolyásolja R m = transzmembrán ellenállás ioncsatornák konduktivitása bef. (közel) egyidejű de eltérő lokalizációjú ingerlés hatásai összeadódnak: Térbeli (spatialis) szummáció A membránpotenciál változás passzív terjedése elektromosan kapcsolt sejtek között (gap junctions) 11
Extracelluláris ingerlés: Katód membrán depolarizáció (katelektrotónus) Anód membrán hiperpolarizációja (anelektrotónus) katód ECF membrán ICF anód Felhasználás a gyógyászatban: Kamrai tachycardia (életveszély!!) elektrokardioverzió és defibrilláció Pacemaker therápia (szív, rekeszizom, KIR) Elektrokonvulzív therápia (Psychotikus állapot) Endocochlearis implantáció ( mesterséges belső fül) TENS: Transdermal Electric Nerve Stimulation (fájdalomkezelés) Nem külső ingerléssel kiváltott elektrotónusos potenciálok: Posztszinaptikus potenciál (ligandfüggő ioncsatornák, transzmitter receptor szignalizáci Receptor- (generator) potenciál: érzőneuron és érzékhámsejtek Az akciós potenciál terjedése Pacemaker potenciálok (a pacemaker sejtek spontán depolarizációja) 12