10 - Fotoszintézis Bevezetés Anövényi anyagcsere egyik legjellemz bb vonása, hogy a növények képesek afényenergiát szerves anyagok el állítására felhasználni. Azon folyamatok összességét, melyek során a növényi szervezetek afényenergiát hasznosítják szerves anyagok szintézisére, fotoszintézisnek nevezzük. A fotoszintézisnek az ad rendkívüli jelent séget, hogy az egész él világ számára az energiát végs soron a fotoszintézis során átalakított fényenergia szolgáltatja. A Föld atmoszféráját évente elér 56 10 23 Jfényenergiának, csak kb. negyede hasznosulhatna fotoszintetikus folyamatokban, de a fotoszintetizáló szervezetek ebb l csak mintegy 0,2 %-ot hasznosítanak. A fotoszintézisre való képesség mind a prokarióta, mind az eukarióta szervezetek között megtalálható. A fotoszintézisre képes prokarióták között említhetjük a zöld-, kékes-zöld, és bíbor baktériumokat. Az eukarióták között nemcsak a magasabb rend növények, hanem alacsonyabb rend szervezetek, mint az egysejt algák és a többsejt zöld-, barna- és vörösmoszatok is képesek fotoszintézisre. Tekintettel arra, hogy a fotoszintézis igen különböz szervezetekben képes végbemenni, akonkrét reakció utak is eltér ek lehetnek. A fotoszintézis redox-folyamat, melybe valamilyen elektrondonorról úgy jut át az elektron egy akceptorra, hogy az ahhoz szükséges energiát a fény szolgáltatja. A reakcióegyenlet általános formában: H 2 D + A! hν H 2 A + D; ahol H 2 D az elektrondonor, A pedig az akceptor. A fotoszintetizáló szervezetek dönt többsége a zöld- és bíbor baktériumokat kivéve a vizet használja elektrondonorként, és pl. szén-dioxidot redukál. A víz oxidációjakor oxigén szabadul fel: 2nH 2 O + nco 2 hν! n(ch 2 O)+nH 2 O + no 2 : A felszabaduló oxigén a vízb l képz dik, amit 18 O izotóppal jelölt víz alkalmazásával igazoltak. Az oxigént termel fotoszintetizáló szervezetek a Föld eredetileg reduktív atmoszféráját oxidatívvá alakították át. Ma alégkörben 21 V/V% az O 2 és 0,03 V/V% a CO 2 koncentrációja, ami a fotoszintetikus produktivitás egy lassító tényez je. Legtöbb fotoszintetizáló baktériumban nem a víz (hanem pl. kénhidrogén) tölti be az elektrondonor szerepét, ilyen szervezetek fotoszintézise során oxigén nem termel dik. A CO 2 mellett szulfát-, nitrát- és hidrogénion is betöltheti az elektronakceptor szerepét. F. F. Blackman (1905-1911) volt az els kutató, aki részletesen megvizsgálta, hogyan függ a fotoszintetikus aktiviás a képletben szerepl paraméterekt l. Azt tapasztalta, hogy magas CO 2 -koncentráció mellett a fotoszintézis sebessége alacsony fényintenzitáson lineáris függést mutat, és független a h mérséklett l. Amikor a CO 2 -koncentrációt a változtatta, akkor azt tapasztalta, hogy a produktivitás lineárisan változott, de függött a h mérséklett l
is. E vizsgálatokkal sikerült kimutatni, hogy a fotoszintézis két típusú folyamatot foglal magába, melyeket fényszakasz és sötétszakasz néven szoktunk említeni. A fotoszintézis mechanizmusának megismerése szempontjából fontos lépés volt a Hillreakció megismerése is (1937): izolált kloroplasztiszok mesterséges elektronakceptorok és fény hatására oxigént termeltek, azaz az oxigéntermelés és a széndioxid-redukció szétválasztható folyamatok. Kés bb sikerült kimutatni, hogy a Hill-reakcióban az elektronakceptor szerepét a NADP + is betöltheti, és a végterméke, a NADPH a CO 2 redukciójára használható fel: 2H 2 O +2NADP +! hν 2NADPH +2H + + O 2 : Azt is sikerült kimutatni, hogy a fényszakaszban ATP-szintézis is végbemegy, amit fotofoszforilációnak nevezünk. A sötétszakaszban történik a szén-dioxid fixációja, és szénhidráttá történ redukciója a fényszakaszban termelt NADPH és ATP segítségével. A fotoszintetikus apparátus szerkezete A fotoszintetikus folyamatok erre specializált sejtorganellumokban kloroplasztiszokban mennek végbe. A legtöbb magasabb magasabb rend n vény kloroplasztiszai lencse alakúak, melyek átmér je μm nagyságrendbe esik, számuk eltér, vannak algák, amikben sejtenként egy kloroplasztisz van, a magasabb rend növényekben eléri a 10 7 darabot is. A kloroplasztiszokat (1/a. ábra) kett s membrán határolja, melyen belül a teret a sztróma tölti ki. A sztrómába ágyazva helyezkedik el a kloroplasztisz bels membránrendszere, melyet tilakoidmembránok alkotnak. A tilakoidmembránok helyenként szorosan egymáshoz tapadva hozzák létre a gránumokat. Egy-egy gránumhoz több sztrómatilakoid is csatlakozik spirociklikus elrendez désben. A kloroplasztisz tilakoidjai összefügg üregrendszert képeznek, melyet lumennek nevezünk. A küls és bels borítómembrán 6 nm vastagságú, köztük 10-20 nm széles rés található. A bels borítómembrán szabályozza a metabolitok () transzportját, míg a küls borítómembrán er sen permeábilis kis molekulatömeg anyagokra nézve. A sztróma tartalmazza a szén-dioxid redukciós ciklus enzimeit. Itt található a kloroplasztisz DNS is kb. 30 kópiában, a riboszómák, a fehérjeszintézishez szükséges komponensek valamint keményít szemcsék és plasztoglobulusok (). Morfológiai és biokémiai vizsgálatokkal (pl. fagyasztva tört kloroplasztisz elektronmikroszkópos elemzésével), kimutatták, hogy a gránumtilakoidok és a sztrómatilakoidok struktúrája és összetétele különböz. A második fotokémiai rendszer (PS II), és a hozzá kapcsolódó fénygy jt klorofill-protein komplex (LHC II) alapvet en a gránumban található, míg a PS I és az ATP-szintáz a sztrómatilakoidban lokalizált. Megalkották a tilakoidmembrán szupramolekuláris modelljét (1/b. ábra). A cianobaktériumok tilakoidjainak szerkezete ett l eltér. Bennük a tilakoidok nem tapadnak egymáshoz, felszínükön fikobiliszómák találhatók, amik nagyjából 60 nm átmér j félgömb alakú struktúrát mutatnak. A fikobiliszómák fikobiliproteinek és köt proteinek szupramolekuláris komplexei. 2
sztróma gránum sztrómatilakoid belsõ membrán kulsõ membrán 1. ábra. a./ egy kloroplasztisz sematikus képe. b./ magasabb rend növények kloroplasztisz tilakoidjának modellje. A fotoszintetikus pigmentek Ahhoz, hogy a fotoszintetizáló szervezetekben fotokémiai folyamatok játszódhassanak le, szükség van a fény abszorpciójára. Minden fotoszintetizáló szervezetben megtalálhatók a klorofillok, amelyek mellett különböz kísér pigmentek is el fordulnak, a karotinoidok és egyes szervezetekben a fikobilinek. A fotoszintetikus pigmentek e három csoportja lefedi a teljes látható spektrumtartományt. 2. ábra. A fotoszintetikus pigmentek szerkezeti képletei, és abszorpciós spektrumuk: a./ klorofillok, b./ fikobilinek, c./karotinoidok. 3
A klorofillok A magasabb rend növények kloroplasztiszaiból acetonnal könnyen kioldott klorofillok kromatográfiás eljárással két frakcióra válnak szét: klorofill-a-ra és klorofill-b-re. A klorofillok szerkezetileg (2/a. ábra) négy pirolgy r t tartalmaznak, melyek egymással porfirinvázat alkotnak. A porfiringy r közepén egy Mg-atom helyezkedik el. A pirrolgy r höz egy ciklopentanon gy r is kapcsolódik. A klorofill-a és klorofill-b között csak az a különbség, hogy az utóbbinál a II. pirrolgy r 3. C-atomjához nem metil-, hanem formilcsoport kapcsolódik. A klorofill-a és klorofill-b molekuláknak két abszorpciós sávrendszere van, az egyik a kék, a másik a vörös spektrumtartományban. E pigmentek mindig megtalálhatók a magasabb rend növényekben, és a zöldalgákban, általában 3 : 1 arányban. A klorofill-a savas közegben könnyen leadja a Mg-ot, ami helyett két H lép be a molekulába (feofitin-a), ami kis mennyiségben szintén megtalálható a növényi szervezetekben. A barna- és kovamoszatokban a klorofill-a mellett klorofill-b helyett kiorofill-c 1 és klorofill-c 2, a vörös algákban a kiorofill-a helyett klorofill-d található. A cianobaktériumokban csak kiorofill-a fordul el. Az oxigént nem termel fotoszintetikus prokarióták különböz bakterioklorofilleket tartalmaznak. Az utóbbi id ben feltételezik, hogy a klorofill-a nagy kémiai heterogenitást mutat, több formája is létezik, melyek feltehet en különböz biokémiai úton szintetizálódnak. A klorofillok a kloroplasztiszok tilakoidjaiban nem szabadon, hanem klorofill-protein komplexek formájában fordulnak el. A fikobilinek A fikobilinek a fikobiliproteinekhez kovalensen köt d kromoforok. A fikobiliproteinekben alapvet en két fikobilin kromofor fordul el, a fikocianobilin és a fikoeretrobilin. A fikobilinek (2/b. ábra) is négy pirrolgy r t tartalmaznak, de nem alkotnak porfirinvázat és nem tartalmaznak fématomot. A karotinoidok A karotinoidok (2/c. ábra) minden fotoszintetizáló szervezetben megtalálható kísér pigmentek. 40 szén atomos poliizoprének, melyek konjugált kett s kötéseket tartalmaznak. A legtöbb végén gy r vé záródik a molekula (ff- és fi-ionon gy r k). A karotinoidoknak két nagy csoportja van, a karotinok csoportja, amelyek szénhidrogének, és a xantofillok, amelyek oxigént is tartalmaznak. Legismertebb karotinok az ff-karotin, a fi-karotin és a likopin, a xantofillok közül pedig a lutein, violaxantin, neoxantin, zeaxantin a leggyakoribbak. A karotinoidok többsége sárga szín, mivel a spektrum kék tartományában abszorbeálnak, de sok piros és narancsszín karotinoid is ismeretes. Szerepük a fotoszintézisben els sorban az elnyelt fényenergiának a klorofillok felé történ továbbításában van, ezen kívül védik a fotoszintetikus apparátust a fotooxidatív hatásoktól. 4
Klorofillformák és pigment-protein komplexek Ha összehasonlítjuk a klorofillok abszorpciós spektrumát oldott állapotban és in vivo, azt tapasztaljuk, hogy az abszorpciós maximum in vivo a hosszabb hullámhosszak felé van tolódva és nagyobb a félértékszélesség is. Ennek egyrészt az az oka, hogy a klorofillmolekulák a fotoszintetikus apparátus membránrendszerének fehérjéihez kötöttek, másrészt, hogy a nagy lokális klorofillkoncentráció miatt a porfirinek kölcsönhatásba léphetnek egymással (aggregátumok keletkeznek: pl. a Mg-atom és a ciklopentanon karbonilcsoportja révén). A pigment asszociátumok abszorpciós sávja mindig nagyobb hullámhosszaknál van, mint a monomer pigmenteké. A fotoszintetizáló objektumok abszorpciós- és fluoreszcencia-spektrumainak analízise azt mutatja, hogy több klorofill-a és -b forma is jelen van in vivo. Az egyes klorofillformák között szerkezeti és spektroszkópiai különbség van, aminek okait ma is kutatják. A megvizsgált klorofill-a formák közül csak kett tud részt venni a fotoszintézis folyamataiban, melyeket abszorpciós maximumuk alapján P 680 és P 700 névvel illetünk. A többi formának a fény abszorpciójában és az energiaátadási reakciókban van szerepe. (A klorofill-b formák abszorpciós maximuma jellemz en 650 nm-nél van.) Klorofill-protein komplexek A kloroplasztiszok tilakoidjainak detergensekkel történ oldásával, majd azt követ gélelektroforézis segítségével történ elválasztással többféle klorofill-(karotinoid-)protein komplexet sikerült kimutatni. Egy részükben kizárólag a klorofill-a fordul el, ezek a komplexek a reakciócentrumok felépítésében vesznek részt, illetve azok bels antennarendszerét alkotják. Ezen fehérjék szintézise a kloroplasztiszokban történik, genetikai kódjuk a kloroplasztisz DNS-ben lokalizált. A komplexek egy másik részében a klorofill-b is megtalálható, ezek az ún. klorofill-a/b proteinek a reakciócentrumok körüli antennarendszerek felépítésében vesznek részt. A klorofill-a/b proteinek a citoplazmában szintetizálódnak és innen jutnak be a kloroplasztiszokba, ahol utólag kerülnek rá a klorofill-a és -b molekulák, e fehérjék genetikai kódja a sejtmagban van (a fotoszintetikus apparátus evolúciójának kés bbi termékei, mint areakciócentrumok). Általában négy f csoportot szoktak megkülönböztetni: ffl CC I (Core complex I), ami az els fotokémiai rendszer (PS I) reakciócentrumát tartalmazza. A komplexben mintegy 80 klorofill-a molekula, 1-2 fi-karotin és egy P 700 klorofill-a található. Sikerült kimutatni, hogy a kloroplasztisz genom két, egymástól kissé különböz gént tartalmaz a CC I apoproteinre. A komplex tulajdonképpen heterodimer, melyek egyenként kb. 40-50 db. klorofill-a molekulát tartalmaznak, de csak az egyikben található meg a P 700 kiorofill-a. ffl LHC I (Light harvesting complex I), amely a PS I fénygy jt klorofill-protein komplexe, amiben klorofill-b is van (a klorofill-a és klorofill-b egymáshoz viszonyított aránya kb. 3; 5 : 1). Magasabb rend növényekben eddig tízféle klorofill-a/b proteint sikerült kimutatni. A klorofill-a/b apoproteinek genetikai kódja a sejtmagban van. 5
Az LHC I és a CC I együtt az összklorofill mennyiségének mintegy 30%-át tartalmazza. ffl CC II (Core complex II), amely a PS II reakciócentrumát tartalmazza, a hozzá tartozó antennákkal. (A CC II komplexben hét olyan fehérje található, melyekhez klorofill kapcsolódik.) A PS II reakciócentrumában helyezkedik el a D 1 és D 2 heterodimer fehérje, ami tartalmazza a P 680 klorofill-a-t és további 4-5 klorofill-a molekulát, valamint 1-2 fi-karotint. Ezen kívül mindkett n 1-1 feofitin-a is megtalálható. A további fehérjék a hozzá kapcsolódó klorofill-a molekulákkal (kb. 20-25 db, és 1-2 db fi-karotinnal) alkotják a PS II bels fénygy jt antennáját. A CC II tartalmazza az összklorofill-tartalomnak mintegy 20 %-át. A reakciócentrum apoproteinjeinek genetikai kódja a kloroplasztiszban van, míg az antennarendszert képez klorofill-a/b proteinek genetikai kódja a sejtmagban található. ffl LHC II (Light harvesting complex II), ami a PS II fénygy jt klorofill-protein komplexe. Ez tartalmazza az összklorofill és a tilakoidproteinek felét. Az LHC II komplexek a tilakoidokban valószín leg trimer formákba szervez dnek, melyek egy része, az ún. mobilis LHC II bizonyos körülmények között ledisszociál a PS II-r l, és a tilakoidmembránban migrál. Ezzel megosztja az általa abszorbeált fényenergiát a PS II és a PS I között. Szerepe nemcsak a fény begy jtésében és a reakciócentrum felé történ továbbításában van, hanem a tilakoidok gránumokká való összetapadásában is. A kiorofill-a és -b arány ebben a komplexben kb. 1:1, és fehérjemolekulánként átlagosan 12 klorofillmolekula található rajta. (A klorofillokon kívül xantofillmolekulákat is tartalmaznak.) AZ LHC II apoproteinek genetikai kódja a mag DNS-ben van, a citoplazmában szintetizálódnak, majd onnan kerülnek be a kloroplasztiszokba, az LHC I proteinekhez és az egyéb klorofill-a/b proteinekhez hasonlóan. Fikobiliproteinek A fikobiliproteineknek a fikobiliszómák felépítésében van szerepe, három f csoportba sorolhatók: ffl Allofikocianinok (650 nm): Két alegységb l épülnek fel, kromoforként egy-egy fikocianobilin van bennük. ffl Fikocianinok (620 nm): Szintén két alegységb l állnak, bennük fikocianobilin és/vagy fikoeritrobilin a kromofor. ffl Fikoeritrinek (560 nm): Két vagy három alegységb l állnak, kromoforja a fikoeritrobilin. A fény abszorpciója Tisztáztuk, hogy a fotoszintézisnek fény- és sötét szakasza van, és megismerkedtünk a fényenergiát elnyel pigmentekkel. Hogyan alakul kémiai energiává a fényenergia? 6
A fényenergia kémiai energiává történ konverziójának els lépése a fény abszorpciója. A Nap által kisugárzott fény spektruma folytonos. Az ultraibolya fénynek csak kis része jut el a Földfelszínre, mivel a 300 nm alatti hullámhosszakat az oxigénmolekulák er sen abszorbeálják, és ózon képz dik, ami a 300-350 nm hullámhossz közé es fényt nyeli el. Az infravörös fény energetikai okokból nem alkalmas a fotoszintézisre (valamint a víz elnyeli). Az abszorbeált foton energiájának nem szabad olyan nagynak lennie, hogy az abszorbeáló molekulát atomjaira bontsa, a foton a molekulát csak gerjesztett állapotba hozza. Az abszorbeált fotonok energiája elegend ahhoz, hogy egy kémiai kötést fellazítsanak, és így reakcióképes állapotba hozzák a molekulát. 3. ábra. cim. Fényabszorpciókor a molekula a foton teljes energiáját felveszi, és az alapállapotból gerjesztett állapotba kerül. Az elektronok energiája kvantált, ezért nem vehetnek fel akármilyen értéket. Azonban abszorbeáló molekula kvantált vibrációs és rotációs spektrummal rendelkezik, és nincs mindegyik molekula ugyanolyan állapotban. Az összetett molekuláknál ezek a szintek egymáshoz közel vannak, nem adnak különálló abszorpciós vonalat, széles abszorpciós sáv jelenik meg. A foton abszorpciójakor a molekulának egy elektronja a ß-köt pályáról ß Λ -lazító pályára lép át. Klorofilloknál a porfirinváz konjugált kett s kötés rendszerét alkotó delokalizált elektronok egyike ugrik lazító pályára. Alapállapotban a klorofillmolekulák szinglet állapotban vannak. Egy foton abszorpciója után a molekula több szinglet gerjesztett vagy több triplet állapotba kerülhet. A szinglet-szinglet átmenetek (S 0! S i )gyors folyamatok (10 15 s). A molekula a magasabb szinglet gerjesztett állapotokból (S 2 ;S 3 stb.) vibrációs kaszkádokon és bels konverziókon keresztül gyorsan fénykisugárzás nélkül S 1 állapotba kerül, melynek közepes élettartama 10 9 s, ez az energia gyakorlatilag h vé alakul. Az S 1 állapot legalacsonyabb vibrációs szintjér l a molekula sorsa különböz lehet. A molekula visszatérhet az S 0 valamelyik vibrációs alszintjére úgy, hogyközben az energiakülönbséget fény formájában adja le, ami ha fénykibocsátással jár együtt, fluoreszcenciáról beszélünk. A fluoreszcencia mindig hosszabb hullámhosszaknál jelentkezik, mint az abszorpciós sáv, mivel az S 0! S 1! S 0 átalakulás során az energia egy része h vé alakul. Az S 1 állapotból a molekula fénykisugárzás nélkül is visszatérhet alapállapotba, az energia teljes mértékben h vé alakul (bels konverzió). További lehet ség az S 1! T 1 átmenet, amikoris az S 1 és T 1 állapotok vibrációs alszintjei azonos energiaértéket képviselnek. Ezután a vibrációs 7
energia tovább csökken, mígnem a molekula legalacsonyabb T 1 vibrációs alszintre kerül. A triplet állapot közepes élettartama több nagyságrenddel nagyobb, mint a szinglet állapoté: 10 3 s-tól akár 10 s-ig is terjedhet. A triplet állapotból az alapállapotba való átmenet (T 1! S 0 ) tiltott, ezért csak kis valószín séggel történik meg. Ha fénykisugárzással jár az a foszforeszencia. T 1 kisebb energiaállapotot képvisel, mint azs 1, ezért a foszforeszencia még a fluoreszcenciánál is hosszabb hullámhosszú fény kisugárzásával jár, és intenzitása is kisebb. T 1! S 1 átmenet után lehetséges a késleltetett fluoreszcencia. A gerjesztett állapotokból fénykisugárzással vagy bels konverzióval való alapállapotba való visszatérés olyan folyamatok, amelyek során az abszorbeált fényenergia a fotoszintézis számára elvész. A fotoszintézis számára akkor hasznosul a gerjesztési energia, ha a gerjesztett klorofill-molekulák kémiai reakcióba lépnek, ami csak S 1 és T 1 állapotú molekuláknál teljesülhet. A fotoszintézisben a fotokémiai reakció lényege, hogy a lazítópályára juttatott elektront a klorofillmolekula átadja egy a környezetében lév elektronakceptornak. Majd egy a környezetében lév elektrondonor redukálja: D + Kl-a + A hν! D + Kl-a Λ + A; D + Kl-a Λ + A! D + Kl-a + + A ; D + Kl-a + + A! D + + Kl-a + A : Afolyamat során lényegében a donorról az akceptorra jut egy elektron a klorofill-a molekula közvetítésével. Mivel A redoxpotenciálja negatívabb, mint a D redoxpotenciálja, így csak energia befektetésével mehet végbe a reakció, amit a fényenergia biztosít. Sötétben ez nem mehet végbe, ez a fotoszenzibilis reakció. E reakcióban csak két klorofill-a forma tud részt venni, ap 680 és ap 700. A gerjesztési energia átadása Ahhoz, hogy a klorofillmolekula fotoszenzibilizált elektrontranszferben vegyen részt szükséges, hogy közvetlen kapcsolatban legyen mind az elektrondonor, mind az akceptor molekulával. Ez csak a reakciócentrumok kevés klorofill molekulájára teljesül. A T 1 és S 1 szinteken tartózkodó molekula gerjesztési energiáját át is adhatja egy másik, alapállapotú molekulának. Ezt a jelenséget energiatranszfernek nevezzük. Az energiatranszfer kémiailag különböz és azonos molekulák között (energiamigráció) is lejátszódhat. A molekulák közötti energiatranszfer csak akkor mehet végbe, ha az energiáját leadó molekula fluoreszenciaspektruma átfedi az energiát felvev molekula abszorpciós spektruma. A transzfer hatásfoka annál nagyobb, minél nagyobb mérték a spektrumok átfedése. A kémiailag különböz molekulák között lejátszódó energiatranszfer bizonyítéka a szenzibilizált fluoreszcencia. Ennek az a lényege, hogy ha a rendszerünkben kétféle molekula van, a gerjeszt fény hullámhosszát úgy választjuk meg, hogy az kizárólag csak az egyik 8
molekulát gerjeszthesse. Amennyiben energiaátadás zajlott le közöttük megjelenik a másik molekula fluoreszcenciája is. Az energia átadása a rövidebb hullámhossznál abszorbeáló molekuláról a hosszabb hullámhossznál abszorbeáló molekula irányába történik. Megvizsgálva a pigmentek abszorpciós és emissziós spektrumait, azt tapasztaljuk, hogy az energiatranszferhez szükséges spektrumátfedés teljesül. Valamint a fotoszintetikus apparátusban olyan nagy a pigmentek koncentrációja, hogy a molekulák elegend en közel is vannak egymáshoz, hogy a folyamat végbemenjen. A reakciócentrumokban lév klorofill-a formák (P 680 és P 700 ) energiacsapdaként viselkednek, mivel abszorpciós spektrumuk maximuma hosszabb hullámhossznál van, mint a közvetlen környezetükben található kísér pigmenteké. Közönséges fényintenzitásoknál rendkívül nagy jelent sége van az energiatranszfernek, csaknem két nagyságrenddel növeli meg a fotokémiai reakciók gyakoriságát. A fotoszintézis akcióspektruma és a két fotokémiai rendszer Ha egy fotoszintetizáló objektum abszorpciós spektrumát fölvesszük, megtudjuk, hogy milyen pigmentek vannak jelen a rendszerben. Azt azonban, hogy a fényenergia hasznosul-e a fotoszintézisben, és ha igen, milyen mértékben, csak az akcióspektrumból tudjuk meg. Az akcióspektrumot úgy vehetjük fel, hogy a reakció sebességét mérjük a megvilágító fény hullámhosszának függvényében. Mérjük az oxigéntermelés sebességét különböz hullámhosszú azonos intenzitású fénnyel való megvilágításkor. Az akcióspektrum választ ad arra, hogy a pigmentek közül az adott reakcióban melyek vesznek részt. Ha az akcióspektrumot összehasonlítjuk az abszorpciós spektrummal, akkor az is kiderül, hogy az egyes pigmentekben abszorbeált fényenergia milyen mértékben hasznosul a folyamatban. Különböz algák akcióspektrumát vizsgálva R. Emerson (1943) azt tapasztalta, hogy a 685 nm-nél hosszabb hullámhosszú fény, bár jól abszorbeálódik a klorofillokban, az oxigéntermelés szempontjából mégsem bizonyult elég hatásosnak, az akcióspektrum 685 nm után igen meredeken csökken ( vörös esés effektus red drop, 4. ábra). 4. ábra. A Chlorella abszorpciós és kcióspektruma. Egy másik megfigyelés során azt tapasztalták, hogy ha a 685 nm-nél hosszabb hullám- 9
hosszú fény mellett rövidebb (pl. 650 nm) hullámhosszú megvilágítást is alkalmaznak, akkor az oxigénprodukció nagyobb, mint ha a két fény melletti produktivitás összegét vennénk (Emerson-féle er sítési effektus). Az Emerson-effektusok arra engedtek következtetni, hogy a rövidebb és a hosszabb hullámhosszaknál abszorbeáló klorofillok között funkcionális különbségek vannak. Ezt a feltételezést meger sítette az L. R. Blinks (1950) által észrevett kromatikus átmenetek is, aminek lényege, hogy ha pl. 650 és 700 nm-es fényforrások intenzitását úgy állítjuk be, hogy mindkét hullámhossznál külön-külön megvilágítva az algákat, azonos oxigéntermelést kapjunk, akkor fényforrások között kapcsolgatva jellegzetes oxigénprodukciót detektálhatunk (5 ábra). Ha csupán egyféle fotokémiai rendszer létezne, akkor ilyen változásoknak nem szabadna bekövetkezniük. 5. ábra. Blinks-féle kromatikus átmenetek. Ezek a vizsgálatok rámutattak arra, hogy a fotoszintézis folyamatában két fotokémiai rendszer m ködik, kooperatív kapcsolatban. Azóta sikerült a két fotokémiai rendszert aktív formában izolálni, molekuláris felépítésükr l is egyre többet tudunk. A fotoszintetikus elektrontranszportlánc Arra a kérdésre, hogy a két fotokémiai rendszer és az elektrontranszportlánc egyes tagjai milyen sorrendben helyezkednek el, a redoxpotenciálmérésekb l, és az indukált abszorpcióváltozásokból lehet következtetni. A kloroplasztiszokban többféle citokrómot sikerült kimutatni. Ilyen például a citokrómf, ami különböz hullámhosszúságú fény hatására oxidálódik vagy redukálódik, ami azt bizonyítja, hogy az elektrontranszportláncban a két fotokémiai rendszer között helyezkedik el. A PS II (rövidebb hullámhossz) redukálja, a PS I (hosszabb hullámhossz) oxidálja. R. Hill és F. Bendall megalkották a fotoszintetikus elektrontranszportlánc ún. Z - sémáját (6. ábra). A fotoszintetikus elektrontranszportlánc m ködését célszer PS II-t l kiindulva áttekinteni. A gerjesztett állapotú P 680 redoxpotenciálja negatívabb, mint alapállapotban, ezért képes egy elektront átadni. Spektroszkópiai vizsgálatokkal kimutatták, hogy a P 680 primer elektronakceptora feofitin-a. A P + 680 elektrondonora a víz, aminek oxidációjával oxigén 10
6. ábra. A fotoszintetikus elektrontranszportlánc Z -sémája. szabadul fel. A feofitin-a-ról az elektron energiabefektetés nélkül egy plasztokinonra (QA-ra) tev dik át, majd egy másodlagos kinon akceptorra (QB-re). QB két elektront felvétele után két H + -t köt meg, QBH 2 -vé alakul. QB, a mobilis plasztokinon pool (PQ) kötött formája, ami ezután leválik PS II-r l: QA + QB! hν QA + QB! QA + QB hν! QA + QB 2 2H+! QA + QB! QA + QBH 2 : Afolyamat két fotoaktust igényel. A QB 2 -ra kerül hidrogénionok a sztrómából származnak. A redukált plasztokinonról a két elektron az elektrontranszportlánc következ komponensére, a citokróm-b6/f komplexre kerül, ezzel egy id ben leváló két H + a lumenbe lép be, ami hidrogénion-transzportot eredményez a sztrómából a lumenbe. Az egyik elektron a citokróm-b6/f komplexben lév Rieske-féle vas-kén proteinen keresztül a citokróm-f-re kerül, a másik elektron a citokróm-b6-ra tev dik át, amiben két hem van. A citokróm-f-r l az elektron a plasztocianinra (mobilis réztartalmú fehérje) kerül, ami azt a PS I-felé szállítja, és egy oxidált P + 700-nak adja át. A citokróm-b6-ról az elektron visszajuthat a plasztokinonra vagy egy szemikinonra. Tekintettel arra, hogy a PS II a gránumokban, a PS I pedig a sztrómatilakoidokban lokalizált, ezeket a mobilis elemek kötik össze: a plasztokinon pool és a plasztocianin. AP 700 elektronakceptorát A 0 -nak nevezzük, ami úgy t nik, hogy a klorofill-a monomer formája. Ezután az elektron A 1 -re (a K-vitaminra), ezután A 2 -re (vas-kén proteinekre ferredoxinokra), majd egy a sztrómában található mobilis ferredoxinra kerül. Innen egyik lehet ség, hogy ez a ferredoxin az elektront átadja a ferredoxin-nadp-oxidoreduktáznak, amely NADPH-t készít, vagy visszaadja a citokróm-b6/f komplexnek. Ez utóbbi egy ciklikus elektrontranszport folyamat, amiben csak PS I vesz részt, ekkor a folyamat H + transzportot eredményez. (Ez utóbbi jelenség magyarázza a vörös-esés -t is.) 11
A PS II felépítése és m ködése A PS II képes fény abszorpciójára, a víz bontására, a plasztokinon redukálására és transzmembrán potenciál létrehozására: 2H 2 O +2PQ +4H + (sztróma) A PS II négy funkcionális részre osztható: 4 foton! O 2 +2PQH 2 +4H + (lumen) : ffl A reakciócentrum: a fotokémiai reakció komponensei, a vízbontó rendszer, a PQ redukciójához szükséges anyagok. A D 1 és D 2 fehérjedimer egy P 680 -nal, és további klorofill-a-kkal, egy fi-karotin, két feofitin (a D 1 -hez kapcsolódó az elektronakceptor). AD 1 -en van a tirozin oldallánc, ami a donor. Genetikai kódja a kloroplasztiszban van. A reakciócentrum Mn-atomokat is tartalmaz, melyeknek a vízbontásban van fontos szerepük. A reakciócentrumban található intrinsic fehérjék szerepe nem tisztázott. ffl Reguláló sapka : hidrofil fehérjékb l áll, a lumen felöl kapcsolódik a rendszerhez. A reguláló sapka feltételezhet en, a vízbontáshoz szükséges kalcium- és kloridionokat biztosítja. (A Ca 2+ valószín leg a molekulák térbeli helyzetét állítja be.) ffl Proximális antenna: két klorofill-protein komplexet tartalmaz, hét transzmembrán szegmenssel és hisztidin oldalláncokkal, melyekhez klorofill tud köt dni. F abszorpciós sávjuk 669 nm-nél van, (fluoreszcenciás sávja 685 nm-nél mutat maximumot). Feladata az energiatranszport biztosítása. ffl Disztális antenna: kissé távolabb helyezkedik el a reakciócentrumtól, két f részb61 áll: LHC II és az ún. járulékos klorofill-proteinekb l. Az LHC II mintegy 30 %-a foszforilálódhat egy membránhoz kötött kináz segítségével, amit a PQH 2 aktivál. A foszforilált LHC II ledisszociál a PS ll-r l, a gránumok és a sztrómatilakoidok találkozásainál a sztrómatilakoidokba kerül, az energiát a PS I felé továbbítja. A foszforilált LHC II egy foszfatáz reakcióban, amit a PQ stimulál, defoszforilálódhat, és vissza tud köt dni a PS ll-höz. Egy oxigénmolekula keletkezéséhez két vízmolekuláról összesen 4 fotokémiai lépést igényel, ezért a töltéseket valamilyen formában tárolni szükséges, amit kísérleti úton P. Joliot és B. Kok bizonyított. Folytonos megvilágítás esetén kimérhet a telítési intenzitás, ami felett nem n az oxigéntermelés sebessége. Impulzusmegvilágítás esetén egy sötétadaptált növény az els felvillanásra sohasem termel oxigént. A második felvillanás kis mennyiség oxigéntermelést eredményez, a harmadik felvillanásra felülmúlja a telítési intenzitás mellett mért produkciót. További felvillanásokra csillapodó oszcillációt mutat az oxigénprodukció, négyes periódusban (3., 7., 11., stb., 7. ábra). Kb. 25 felvillanás után az oxigéntermelés besimul a folytonos fény esetén kapott értékhez. A négyes periódus alapján feltételezhet, hogy PS II vízbontó komponense négyféle állapotot vehet fel, ami valójában 5 állapotú, de S 4! S 0 gyors, és nem kell fotonabszorpció hozzá. A kísérlet akkor magyarázható az 5 állapotú modellel, ha: 12
7. ábra. Oxigéntermelés impulzusmegvilágítás hatására, és a vízbontó enzim állapotai. ffl a vízbontó enzimek egymástól függetlenül m ködnek, ffl egy foton kell S i! S i +1átmenethez, ffl sötétadoptált állapotban több (S 0 : S 1 = 25 : 75) állapot is stabil (3. felvillanásra sok lesz S 4 állapotban), ffl egy felvillanásnál van olyan enzim, ami nem változtat állapotot. Az egyes S i állapotok egymásba való átalakulása nem azonos id tartam alatt megy végbe (30-50 μs, 40-110 μs, 100-350 μs, 1-1,5 ms). A PS I felépítése APSIképes fényenergia abszorpciójára, a lumenben elhelyezked plasztocianin oxidálására és a sztrómában a ferredoxin redukálására. Felépítésében szintén egy heterodimer fehérje vesz részt, a P 700 -zal, és elektronakceptoraival, A 0 -lal, A 1 -gyel, 40 klorofill-a-val 1-2 fi-karotinnal. A heterodimer génjei a plasztiszban vannak. A fotoszintetikus elektrontranszportlánc további komponensei ffl A citokróm-b6/f komplex: Ez a komplex funkcionálisan a plasztokinol oxidációját és a plasztocianin redukcióját végzi, részt vesz a hidrogénionok transzlokációjában. Képes oxidálni a sztrómában lokalizált ferredoxint is, ami szintén H + transzportot eredményez. Felépítésében négy nagyobb és három kisebb polipeptid vesz részt: citokróm-f alegység (hemmel), a citokróm- b6 (2 hemmel), a Rieske-féle vas-kén protein (ennek nukleáris genomja van). ffl Ferredoxin-NADP + -oxidoreduktáz (FNR): Ez az enzim katalizálja a nem ciklikus elektrontranszportlánc utolsó lépését, a NADP + redukcióját, redukált ferredoxin segítségével. Genetikai kódja a sejtmagban lokalizált, s a citoplazmában szintetizálódik, 13
a plasztiszba kerülve érik. Az enzim két elektront juttat a NADP+ számára, amihez két ferredoxint kell oxidálnia, melyet két H+ felvétele követ. ffl Az elektrontranszportlánc mobilis komponensei 1. Plasztokinon: a PS II és a citokróm-b6/f komplex között a lipidmembránban mozog. 2. Plasztocianin: a citokrórn-b6/f komplex és a PS I között a lumináris térben mozog. 3. Ferredoxin: a PS I és az FNR vagy a citokróm-b6/f komplex között a sztrómában mozog. A fotoszintetikus foszforiláció A fotoszintézis fényreakciójának igen fontos mozzanata, hogy ATP is képz dik. Az elektrontranszportlánc m ködése során hidrogén-ionok akkumulálódnak a lumenben, a kialakuló ph és potenciál különbség biztosítja az ATP képz déséhez szükséges energiát. (P. Mitchell-féle kemioszintézis elmélet.) Kísérletekkel bebizonyították, hogy a foszforilációhoz a fény csak a ph-gradiens kiépítése miatt van szükség, a reakció akkor is lejátszódik, ha sötétben mesterségesen tartjuk fenn a ph-gradienst. Az ATP-szintézis egy protontranszlokáló enzime két f részb l áll: CF 0, hidrofób fehérjékb l, épül fel a tilakoidmembránban a protoncsatorna szerepét játssza, és a CF 1,amiaz ATP-szintáz aktív helyeit tartalmazza, a membrán sztróma felöli oldalán helyezkedik el. A CF1 ötféle alegységb l áll 3 ff, 3 fi, 1 fl, 1 ffi, 1 ffl. Érdekes, hogy a fl és a ffi alegységek nukleárisan a többi a kloroplasztiszban van kódolva. A CF 1 szubsztrátjai a fém-nukieotid komplexek és a P i.afémionok az ATP-szintézist katalizálják: Mg 2+. Mérések alapján ATP molekulánként három proton halad át a csatornán. Nemciklikus foszforilációnál a protont a víz biztosítja, ciklikus foszforilációnál semmilyen anyag nem oxidálódik, hanem a fény PS I részvételével körbehajtja az elektronokat a sztróma és a lumináris tér között. Az elektrontranszportlánc és a foszforiláció között szoros a kapcsolat, természetes körülmények között csak egymással együtt m ködhetnek. A CO 2 -fixáció és -redukció mechanizmusa A fotoszintézis fényszakaszában létrejön CO 2 redukciójához szükséges energetikai feltétel, ATP és redukáló anyag (NADPH) képz dik. E két anyag szükséges a sötétreakció végbemeneteléhez. A CO 2 -fixáció és -redukció mechanizmusával el ször M. Calvin foglalkoztak (1948-1953). Azóta más utakat is sikerült feltárni, kiderült, hogy az egyes növények között különbségek vannak e tekintetben. A primer termékek alapján a Calvin típusú növényeket C 3 -asnak nevezzük, léteznek C 4 -es, és olyan növények is, amikben a két alternatíva is jelentkezhet. Ezek között biológiai és strukturális eltérés van. 14
8. ábra. A CO 2 fixáció C 3, C 4 és CAM növényekben. A CO 2 -fixáció C 3 -as útja (a Calvin-ciklus) A reakcióutat kísérletesen vizsgálták. H 14 CO 3 felhasználásával egysejt zöldalgákat rövid ideig megvilágították, majd forró metanollal fixálták azokat. A jelölt termékeket kioldották, majd kétdimenziós papírkromatografálás után autoradiogramot készítettek. Egészen rövid idej megvilágítás után kimutatták, hogy a CO 2 -fixáció els stabil terméke a glicerinsav-3-foszfát. További kísérletekkel belátták, hogy a CO 2 a ribulóz-1,5- biszfoszfát molekulákhoz köt dik, ami nem igényel fényt. Az így kialakult hat szén atomos intermedier termék bomlik 2 molekula glicerinsav-3-foszfáttá. A reakciót arubiscoenzim (ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz- oxigenáz) katalizálja. A Rubisco kett s enzimaktivitással rendelkezik: karboxiláz és oxigenáz: ribulóz-1,5-biszfoszfát + CO 2! 2glicerinsav-3-foszfát; ribulóz-1,5-biszfoszfát + O 2! glicerinsav-3-foszfát + glikolsav-2-foszfát: E két folyamat kompetitív, a természetben a karboxiláz út a gyakoribb. A karboxilációt megel z en a Rubisco enzimet egy CO 2 és Mg 2+ aktiválja. Egy megvilágított kloroplasztisz sztrómájában a CO 2 és HCO 3 közötti egyensúlyt akarboanhidráz enzim tartja fenn. Bár a HCO van túlsúlyban a Rubisco CO 3 2-t köt meg. A Rubisco enzim aktivitásának ph-optimuma a lúgos tartományba esik, ezért a kloroplasztiszok megvilágításakor, lejátszódó lumen felé történ protontranszport is növeli a karboxiláz reakció sebességét. A Rubisco a levelek oldható fehérjéinek csaknem felét teszi ki, így a bioszféra legnagyobb mennyiségben el forduló enzime. Az enzim két alegységb l áll (a nagyobbik a kloroplasztiszban, a kisebbik a citoplazmában szintetizálódik), és nyolc katalitikus hely van rajta. Sikerült kimutatni, hogy a Rubisco-nak van egy természetes inhibitora, amely képes tartósan hozzákötni, és ezzel gátolni a karboxiláz aktivitást. Az nem ismert, hogy ez az inhibitor milyen hatással van az oxigenáz aktivitásra. A Calvin-ciklus második lépésében a glicerinsav-3-foszfát glicerinsav-1,3-biszfoszfáttá 15
alakul ATP felhasználásával. Ezt az egyensúlyi folyamatot a 3-foszfoglicerát-kináz katalizálja. A glicerinsav-1,3-biszfoszfát glicerinaldehid-3-foszfáttá redukálódik (a NADP-dependens glicerinaldehid-3-foszfát- dehidrogenáz enzim segítségével), miközben P i szabadul fel. A glicerinaldehid-3-foszfát egyensúlyt tart fenn izomerjével, a dihidroxi-aceton-foszfáttal (katalizátor: trióz-foszfát- izomeráz). Következ lépésben a fenti két izomer összekapcsolódik hat szénatomos fruktóz-1,6- biszfoszfáttá. Ezután a fruktóz-1,6-biszfoszfátról az egyik foszfátcsoport lehidrolizál és fruktóz-6- foszfát keletkezik (katalizátor: fruktóz-1,6-biszfoszfatáz a kloroplasztiszokban, fény- és ferredoxinregulált). A Calvin-ciklus következ lépéseiben különböz cukorfoszfátok alakulnak át egymásba. A reakciókat enzimek katalizálják, amiket bonyolult regulációs folyamatok aktiválnak. Majd a Calvin-ciklus zárlépéseként a ribulóz-5-foszfát foszforilál, és regenerálódik a CO 2 akceptora. A reakció ATP-igényes. A CO 2 -fixáció C 4 -es útja Más objektumokban, mint pl. a kukorica vagy a cukornád, Karpilov és Kortsack azonban azt tapasztalta, hogy a CO 2 fixáció korai termékeként a négy C-atomos oxálecetsav, almasav és aszparaginsav jelenik meg. A C 4 -es növények az alábbi f bb jellegzetességeket mutatják: ffl A primer fixációs termékek az oxálecetsav, almasav és az aszparaginsav, ffl A CO 2 fixáció fényen történik, ffl Anégyszénatomos termékekb l szénátadás történik a C 3 -as ciklus felé, ffl Kétféle fotoszintetikus sejttípus van bennük, a mezofill- és a hüvely parenchima- (más néven Kianz-) sejtek. A hüvelyparenchima-sejtek a szállító edénnyalábokat veszik körül és kommunikációjuk a mezofillsejtek közötti gáztérrel nem ideális a CO 2 fixáció szempontjából. A mezofillsejtek a szivacsos parenchimát alkotják. ffl A C 4 -es növényekben a CO 2 primer fixációja a mezofillsejtek citoplazmájában történik. A szén-dioxid- akceptor ebben az esetben a foszfoenolpiruvát. A karboxilációt katalizáló enzim a foszfoenol-piruvát-karboxiláz, aminek HCO a szubsztrátja. 3 ffl A primer termék ezután almasavvá vagy aszparaginsavvá alakul át, ami a mezofill sejtekb l a hüvelyparenchima sejtekbe jut, ahol dekarboxilálódik (pl. pirosz l sav, CO 2 ill. NADPH keletkezik, a CO 2 a újrafixálódik, és C 3 -as ciklusba kerül.). 16
CO 2 fixáció a CAM növényekben El ször a Crassulaceae családba tartozó fajoknál figyelték meg, hogy a fotoszintetizáló szövetekben az almasav tartalom érdekes napszakos változásokat mutat. Az éjszaka folyamán mennyisége jelent sen megnövekszik, majd nappal lecsökken. A CAM növényeket úgy tekinthetjük, mint amelyekben a fotoszintetikus CO 2 -fixációban egy fontos élettani és biokémiai adaptáció alakult ki a szárazságt réshez. Ha nincs elegend víz, akkor szünetel a CO 2 és a víz felvétele és leadása a küls környezet és a növény között. Ilyenkor a sztrómák bezárásával jelent s mértékben visszatartják a vizet, és a légzésben keletkez szén-dioxidot reciklizálják, amivel aktív állapotban tudják tartani fotoszintetikus rendszerüket. A primer CO 2 -akceptor a CAM növényekben a foszfoenol-piruvát, melyet a keményító'bó'1 annak lebontása után a glikolízis hoz létre. A több lépés után keletkez almasav kijut a citoplazmába, és vakuólumokban halmozódik fel. A fényperiódusban a vakuólumban tárolt almasav visszajut a citolazmába, ahol dekarboxilációt szenved. A CAM növények CO 2 -fixációját összehasonlítva a C 3 - as és C 4 -es növényekével azt látjuk, hogy míg a C 3 -as növényekben a CO 2 gyakorlatig közvetlenül a Calvin-ciklusban asszimilálódik, addig a C 4 -es és CAM növényeknél el ször almasavba épül be. A C 4 -es növényekben az almasav nem akkumulálódik nagy koncentrációban, hanem a mezofill sejtek1 a hüvelyparenchima-sejtekbe transzlokálódik. Ott szabadul fel bel le CO 2, amely másodlagosan fixálódik a Calvin-ciklusban és így épül be a szénhidrátokba. A C 4 -es növényeknél tehát a primer CO 2 fixáció és a szénhidrátokba történ beépülés térben elválasztott folyamatok. Fotorespiráció (glikolát-ciklus) A 14 CO 2 kísérletekben nemcsak glicerinsav-3-fosyfat és cukor-foszfátok jelöl dnek, hanem glikolsav, glicin és szerin keletkezik, ami egy másik anyagcsereút létezését bizonyítja, amiben a kloroplasztisz, a peroxiszóma és a mitokondrium vesz részt. A glikolsav a Rubisco-enzim oxigenáz viselkedésekor keletkezik. (El ször glikolsav-foszfát keletkezik, amir l következ lépésben lehasad egy foszfát csoport.) A reakció(ka)t a magas fényintenzitás, a nagy O 2 és alacsony CO 2 koncentráció segíti el. A glikolsav a peroxiszómában alakul glioxálsavvá, ami a kloroplasztiszban visszaalakulhat glikolsavvá vagy a peroxiszómában transzamilációs reakcióban glicinné alakul. E folyamatokban több helyen is O 2 felvétel van, ezért nevezik fotorespirációnak. A fotorespiráció f leg a C 3 -as növényekre jellemz, ezért ezek fotoszintetikus produktivitása szélesebb h mérséklettartományban alacsonyabb. 17
9. ábra. A fotorespiráció és a Calvin-ciklus kapcsolata. A fotoszintézis intenzitásfüggése küls tényez kt l A telsesség igénye nélkül csak ábrákat teszek ide: 10. ábra. Az ábrákon a fotoszintetikus aktivitás függése látható különböz paraméterek mellett: a./ fényintenzitás, b./ levélh mérséklet, c./ CO 2 koncentráció, d./ CO 2 és fény, d./ O 2 koncentráció (ez csak C 3 -as növényre). 18