Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola Környezetbiológia Doktori Program Egy magyarországi erőmű víztisztító üzemének mikrobiológiai feltérképezése és mikrobamentesítése - doktori értekezés tézisei - KÉKI ZSUZSA Témavezető: Dr. Tóth Erika habilitált egyetemi adjunktus (ELTE TTK Biológiai Intézet Mikrobiológiai Tanszék) A Környezettudományi Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Galácz András egyetemi tanár (ELTE TTK Őslénytani Tanszék) A Környezetbiológia Program vezetője: Prof. Dr. Ács Éva a biológiai tudományok kandidátusa (MTA Duna-kutató Intézet) ELTE Mikrobiológiai Tanszék, Budapest 2014
BEVEZETÉS Nagy tisztaságú, ún. ultratiszta vizet az ipar számos ágazatában állítanak elő, használnak fel (gyógyszeriparban, analitikai kémiában, laboratóriumi berendezésekhez, műszaki alkalmazásokhoz, valamint erőművi rendszerekben). Noha az ultratiszta víz és annak előállítási, felhasználási környezete erősen tápanyaghiányos közeg, a mikroorganizmusok nagyfokú túlélő képességük és metabolikus flexibilitásuk révén még az ilyen oligotróf környezetekben is képesek fennmaradni, szaporodni és az adott rendszerben komoly károkat eredményező folyamatokat elindítani. A túlélést és a szaporodást ezen szervezetek számára a legtöbb esetben az élőbevonatokba vagy más néven biofilmekbe szerveződés biztosítja. A biofilm képzés a külső fizikai, valamint kémiai hatásokkal szemben ellenállóvá teszi a benne élő szervezeteket, így teljes körű eltávolításuk szinte lehetetlen. Okozhatják többek között egy adott üzem működési egységeinek eltömődését (biofouling), vagy különböző anyagok korrózióját (MIC - microbiologically influenced corrosion). Ma már számos kémiai és fizikai módszer ismert, melyeket több-kevesebb sikerrel alkalmaznak a mikrobiális szennyeződések elkerülése, illetve a már meglévők eltávolítása céljából. Ezen módszerek alkalmazása, kombinálása azonban az egyes iparágakkal, az ultratiszta víz felhasználási területeinek változatos sajátságaival együtt módosul. A jelen doktori munka alkalmával tanulmányozott erőmű pótvíz előkészítő üzemében - amely feladata ultratiszta víz előállítása az erőmű egyéb vízrendszerei számára - gyakran felléptek üzemeltetési problémák. Az ott dolgozó munkatársak több technológiai egységben komoly korróziós jelenségeket tapasztaltak, amelyekre a víz helyszínen mért kémiai és fizikai paraméterei nem adtak magyarázatot. Ismerve a mikrobák széles körű elterjedését hasonló rendszerekben, feltételezhető volt, hogy a csőrendszerben fellépő károsodásokért és a tapasztalt vízminőség romlásért a rendszer mikrobiális szennyeződése és az ennek következtében kialakuló biofilm bevonatok felelősek. A kérdés tisztázására az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén először 2005-ben kezdődtek vizsgálatok az elsődleges és másodlagos vízkörök, valamint az azokat ellátó pótvíz előkészítő üzem csőrendszereinek, egyéb működési egységeinek, továbbá az alkalmazott vegyszerek mikrobiológiai állapotának meghatározására. Az erőmű több pontjáról származó víz és biofilm minták mikrobaközösségeinek feltárása tenyésztéses és tenyésztéstől független, DNS alapú módszerekkel történt. A 2005-től 2008-ig tartó vizsgálatok eredményeinek tükrében a további kutatások az erőmű pótvíz előkészítő üzemére összpontosítottak. Ezek során az üzem részletes feltérképezésre került, mely alapján meghatároztuk a mikrobiológiai szempontból 2
leginkább fertőzött (kritikus) szerkezeti egységét, majd a kapott eredményeknek megfelelően kidolgoztunk egy, az adott üzemre biztonságosan alkalmazható mikrobamentesítési eljárást. 1. Sorozatmintavétel és kritikus pont elemzés CÉLKITŰZÉSEK Az erőművi pótvíz előkészítő üzem mikrobafertőzöttség szempontjából kritikus pontjainak feltérképezése (csíraszám becsléssel, sejtszámlálással, és tenyésztéstől független, DNS alapú vizsgálatokkal), figyelembe véve az üzemviteli beavatkozások hatásait (kavicsszűrő ágyak üzembe vételekor a rendszerre hirtelen ráengedett, nagy mennyiségű víz; tartályok az egyes víztisztítási műveleti lépéseken átjutott víz ideiglenes tárolására; vegyszerek használata az ioncserélő gyanták regenerálására, stb.). 2. Biocidos kezelések Különböző biocidok tesztelése, azok megfelelő hatóidejének, koncentrációjának meghatározása, szem előtt tartva az üzemi körülmények között történő biztonságos alkalmazhatóságot. A vegyszeres beavatkozás üzemi körülményeinek részletes előkészítése. 3. Speciális tenyésztéses vizsgálatok A tanulmányozott üzemben előállított ultratiszta víz mikrobaközösségének feltérképezése újonnan kidolgozott, speciális táptalajokon történő tenyésztéssel. 4. Polifázikus taxonómiai vizsgálatok, új taxon(ok) leírása A pótvíz előkészítő üzemben előállított ultratiszta vízből izolált, a tudomány számára új baktériumok polifázikus taxonómiai vizsgálata és leírása. 1. Mintavétel KUTATÁSUNK SORÁN ALKALMAZOTT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A pótvíz előkészítő üzem összesen 12 pontjáról vettünk vízmintákat későbbi tenyésztéses, valamint tenyésztéstől független vizsgálatok céljából. A Duna vizét (nyersvíz) egyszer, a nyersvíz-tartályt, a meszes lágyítóról, valamint a kavicsszűrőről elfolyó vizet pedig egy héten át napi rendszerességgel mintáztuk. Ezzel párhuzamosan az ioncserélő gyantáknak egy-egy teljes kimerülési ciklusát nyomon követtük. Az alapsótalanító blokk esetén ez a ciklus 16-20 3
órát jelentett 4 óránkénti, a kevertágyas ioncserélő gyanta esetében pedig 4-5 hetet, heti egyszeri mintavétellel. Ezeken felül az egyik éppen kimerült kevertágyas ioncserélő (összesen 4 ilyen típusú gyantaoszlop van) lazítóvizét öt héten át heti rendszerességgel mintáztuk. A sorozatmintavétellel célunk tehát az volt, hogy meghatározzuk a pótvíz előkészítő üzem állapotát, mikrobafertőzöttség szempontjából kritikus pontjait. Ezalatt figyelembe vettük az üzemviteli beavatkozások esetleges mikrobiális kontaminációra gyakorolt hatásait. Az elvégzett vizsgálatok további célja a jövőbeli mikrobamentesítésre irányuló beavatkozások pontos helyeinek meghatározása, valamint a beavatkozás körülményeinek (vegyszer, hatóidő, hatókoncentráció) megfelelő előkészítése, megalapozása volt. 2. Kritikus pont elemzés vizsgálatai Heterotróf csíraszám becslés A pótvíz előkészítő üzem különböző pontjairól vett vízminták heterotróf csíraszámait R2A táptalajon határoztuk meg. Sejtszámbecslés epifluoreszcens mikroszkópia segítségével A vízmintákból szűrt (0,2 µm pórusátmérőjű polikarbonát membrán), fixált sejteket DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindol) festékkel (1mg*ml -1 ) festettük meg, majd az egyes minták sejtszámait Nikon80i epifluoreszcens mikroszkóp segítségével, ImageProPlus programcsomag felhasználásával meghatároztuk. Biofilm és gyantaminták pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálata A vizsgált vízelőkészítő üzemben alkalmazott összes gyantatípust, valamint a kevertágyas ioncserélő oszlopra rámenő, illetve onnan kifutó vezetékekből és a kevertágy utáni összekötő csőből és szűrőből vett biofilm mintákat pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatnak vetettük alá, az egyes ioncserélő oszlopok mikrobiális fertőzöttségének meghatározása érdekében. A későbbiekben a biociddal kezelt gyanták felszíneit is ezzel a módszerrel vizsgáltuk. Molekuláris vizsgálat (DGGE-Denaturáló Grádiens Gél Elektroforézis) Az üzemben használt ioncserélő gyantaoszlopokról elfolyó vízminták bakteriális közösségeit DGGE vizsgálat segítségével hasonlítottuk össze. (Összesen 25 minta, melyek a 4 ioncserélő gyantáról - szervesanyagkötő, anion-, kationcserélő, valamint kevertágyas ioncserélő -, különböző időpontokból származtak.) A későbbiekben, a laboratóriumi modellrendszerben vegyszerrel kezelt gyantákról származó víz, valamint az üzemi körülmények között kezelt (Kathon WT biocid) kevertágyas ioncserélő oszlopokból vett gyanta- és vízminták baktériumközösségeit szintén DGGE módszer 4
segítségével vetettük össze, eredményeink alapján hasonlósági fákat készítettünk. 3. Biocidos kezelések A korábbi vizsgálatok során, illetve a speciális táptalajokról izolált baktériumtörzsek biocidokkal szembeni érzékenységének felmérése A baktériumtörzsek érzékenységét három biociddal szemben teszteltük, ezek a ProClin 150 (Supelco), Kathon WT (Rohm and Haas), valamint Bronopol (Sigma) voltak. A törzsek 24 órás tenyészeteiből sűrű szuszpenziót készítettünk, optikai denzitásukat standard értékekre állítottuk, majd a különböző hatókoncentrációjú (0,1-250 mg*l -1 ) biocid oldatokat a 96 lyukú mikrotitráló lemezek csöveibe elosztott baktérium szuszpenziókhoz adagoltuk. A sejtszám változást (a baktériumok szaporodását, az optikai denzitás változását) 24 óránként mértük 5 napon át, 620 nm hullámhosszon, Tecan Sunrise (Tecan Austria GmbH) készülékkel. Gyanták biocidos kezelése laboratóriumi modellrendszerben A baktériumtörzseken elvégzett eredményeinkre alapozva a Kathon WT biocidet ítéltük az ioncserélő gyanták kezelésére legalkalmasabbnak. Olyan laboratóriumi modellrendszert építettünk fel, melyben lehetőségünk volt nagyobb térfogatban vizsgálni a biocidok gyantákra (összes üzemben használt gyantatípus) és a gyanták felszínén kialakult biofilmekre gyakorolt hatását. A kísérlet alkalmával a biocid kezelést követően (eltérő hatóidőkkel és koncentrációkkal dolgozva) a gyanták felülúszóját a baktériumtörzsekből készült szuszpenzióhoz hasonlóan mikrotiter lemezeken tanulmányoztuk, a sejtszám változásokat a fent leírtakkal megegyezően ellenőriztük. Ebben az esetben a 25 és mg*l -1 -es biocid koncentrációkat teszteltünk részletesen, figyelve, hogy a mikrobaölő hatás növelhető-e a biocid koncentráció további emelésével. Gyanták biocidos kezelése üzemi körülmények között Előzetes kísérleteink eredményeire alapozva, az üzem dolgozóival egyeztetve végül a pótvíz előkészítő üzem mind a négy kevertágyas ioncserélő gyantaoszlopának kezelését elvégeztük. A biocidos kezelést 25 mg*l -1 koncentrációjú, Kathon WT oldattal hajtottuk végre. A kezelések alkalmával minden esetben az üzem dolgozói által engedélyeztetett szigorú szabályok betartásával jártunk el. Megjegyzendő, hogy a vegyszeres kezelést követően az üzem minden esetben toxikológiai vizsgálatokat végeztetett a gyantaoszlopokról elfolyó vegyszeres víz csatornára, illetve élővízbe bocsátása előtt. 5
Gyanták ioncserekapacitásának vizsgálata Mind a laboratóriumi, mind az üzemi kezelések előtt és után vett gyantaminták ioncserekapacitás vizsgálatát elvégeztük, a vegyszeres kezelés gyantákra gyakorolt hatásának nyomon követése céljából. 4. Speciális tenyésztéses vizsgálatok, baktériumtörzsek meghatározása A pótvíz előkészítő üzem finomsótalanvíz-tartályából származó vízmintákban fellelhető baktériumok felszaporítására 5 féle speciális összetételű táplevest dolgozunk ki. Az újonnan kidolgozott (szintetikus és komplex) táptalajok összetételénél igyekeztünk a finomsótalanvíztartályban uralkodó erőteljesen oligotróf környezet reprodukálására. Komplex táptalajként olyan médiumot alkalmaztunk, mely ugyanebből az üzemből, korábbi vizsgálatok alkalmával nyert mintákból izolált baktériumtörzsek kivonatát tartalmazta. A dúsított mintákat a megfelelő táptalajokra szélesztettük, ezeket 1 héten át 28 C-on inkubáltuk. A táptalajokról random módon izoláltunk baktériumtörzseket, melyeket a mikrobiológia szabályainak megfelelően tisztítottunk, majd R2A táptalajon tartottunk fenn a további vizsgálatok elvégzése céljából. Az izolált baktériumtörzsek faji szintű meghatározása A törzsekből DNS-t izoláltunk G-spin Genomic DNA Extraction Kit (intron Biotechnology, Inc.) segítségével, ezt követően a bakteriális DNS 16S rrns génszakaszát felszaporítottuk 27F és 1492R primerekkel, GeneAmp PCR System 2700 berendezés (Applied Biosystems) használatával. Az amplifikált 16S rrns génszakaszokat ARDRA (Amplifikált Riboszómális DNS Restrikciós Analízis) módszerrel csoportosítottuk. A csoportreprezentáns és a csoportokon kívül eső törzseket 16S rrns gén szekvencia analízisnek vetettük alá és elvégeztük azok faji szintű meghatározását NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Program és EzTaxon Identification service használatával. 5. Polifázikus taxonómiai vizsgálatok, a tudomány számára új baktérium taxon leírása Az általunk vizsgált pótvíz előkészítő üzem finomsótalanvíz-tartályából a speciális tenyésztés alkalmával sikerült a tudomány számára új baktérium taxon képviselőit tenyésztésbe vonni. A polifázikus taxonómiai vizsgálatok alkalmával meghatároztuk az általunk izolált baktériumtörzsek (PI_21 T, PI_31, PI_25), valamint a 16S rrns gén alapján a legközelebbi rokon fajok morfológiai, biokémiai és fiziológiai jellemzőit, továbbá elvégeztük a baktériumtörzsek kemotaxonómiai markereinek meghatározását. Ezen felül API gyorsdiagnosztikai teszteket és DNS alapú vizsgálatokat végeztünk törzseinkkel. 6
AZ ÉRTEKEZÉS EREDMÉNYEI ÉS KÖVETKEZTETÉSEINK 1. Az általunk vizsgált pótvíz előkészítő üzemben végzett kritikus pont elemzés eredményei szerint megállapítottuk, hogy az üzem számos pontja mikrobákkal erősen fertőzött. A heterotróf csíraszám becslés, valamint a mikroszkópos sejtszámolás eredményei is azt mutatták, hogy a rendszer két leginkább szennyezett pontja a kavicsszűrő, illetve a kevertágyas ioncserélő gyanta töltetek. Ezen pontoknál a rendszer felépítéséből és működésének sajátosságaiból kifolyólag gyakorta kialakulnak pangó vizes terek, amik kedveznek az erőteljes mikrobanövekedésnek. 2. A kezeletlen gyantaminták felszíneinek SEM vizsgálatai azt mutatták, hogy azok némelyike (szervesanyagkötő, kevertágyas ioncserélő gyanták) erősen szennyezett, olykor biofilmekkel átszőtt (1. kép). 1. kép. A kevertágyas ioncserélő gyanta SEM fotója kezelés előtt Fejlett biofilm látható a gyantaszemcsék felszínén és a köztük lévő térben. 3. A tenyésztéstől független DGGE módszeren alapuló vizsgálatok eredményeiről elmondható, hogy az alapsótalanító blokk oszlopainak gyantatöltetei egyaránt diverz mikrobaközösséggel rendelkeznek. Az újonnan regenerált és a beindításhoz közeli kevertágyas gyantatöltet nagyon hasonló mikrobaközösségekkel jellemezhető, ugyanakkor, amint a kevertágyas ioncserélő közelít a kimerüléshez, közössége átrendeződik: a gyanta használata során egy szukcesszió figyelhető meg a baktériumközösségek összetételében. A hosszan használatban lévő kevertágyas oszlop mikrobiális összetétele a kevertágy lazítóvíz elvezetéséből származó vízmintával együtt elkülönülést mutat a többi mintához képest. Mindezen előzetes vizsgálatok eredményeit tekintve a leginkább szennyezett, kevertágyas ioncserélő gyantaoszlopok vegyszeres kezelését céloztuk meg. 7
4. A pótvíz előkészítő üzem finomsótalanvíz-tartályából származó baktériumtörzsek érzékenységének vizsgálatakor a ProClin és a Kathon WT minden esetben eredményesnek bizonyult, a Kathon WT már egészen alacsony (5 mg*l -1 ) koncentrációban hatásos volt a baktériumok szaporodásának visszaszorításában. Megjegyzendő azonban, hogy a tesztelt Mycobacterium törzsek sejtfaluk felépítésének köszönhetően még a legnagyobb ( mg*l -1 ) koncentrációban alkalmazott biocid kezelésekkel szemben is ellenállónak bizonyultak és a kezelés ellenére, ugyan lassabban, de továbbra is sejtszám növekedést mutattak. A mikroorganizmusok teljes mértékű eltávolítása a már szennyezett rendszerből nem valósítható meg, azonban mennyiségük jelentős csökkentése az alkalmazott biocidokkal lehetségesnek bizonyult. 5. Laboratóriumi modellrendszerünk alkalmasnak bizonyult az általunk választott (25 mg*l -1 ) koncentrációban a Kathon WT biocid tesztelésére. 6. Mind a kis térfogatban, mind a laboratóriumi modellrendszerben végzett kísérletek utáni ioncserekapacitás vizsgálatok eredményei kielégítőek voltak. A vegyszer még a legmagasabb alkalmazott koncentráció ( mg*l -1 ) esetén sem okozott jelentős ioncserekapacitás eltolódást egyik gyantatípusnál sem. A baktériumok szaporodásának sikeres visszaszorítását, továbbá az alkalmazott vegyszer ioncserekapacitásra gyakorolt hatásának ellenőrző vizsgálatait figyelembe véve sor kerülhetett a kiválasztott Kathon WT biocid üzemi körülmények között történő alkalmazására. 7. Az üzemben zajló vegyszeres mikrobamentesítés hatékonyságát ellenőrző SEM vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a kezelés előtt erősen szennyezett, olykor a biofilmekkel átszőtt gyantaszemcsék felszíne a kezelések és a többszöri finomsótalanvizes mosások hatására teljes mértékben feltisztult, mikrobasejtek sokszor már nyomokban sem voltak kimutathatóak (2. kép). A kezelt kevertágyas gyantatöltetek ioncserekapacitása visszaállt csaknem az eredeti szintre, a biofilmektől felszabadított, megnövekedett szabad gyantafelszínnek köszönhetően. A kezelés hatására olyan kevertágyas ioncserélő gyantaoszlopot is sikerült újonnan üzembe helyezni, és arról, a korábbiakhoz képest 2-3- szoros mennyiségű, jó minőségű ultra tiszta vizet nyerni, amit már több mint másfél éve üzemen kívül helyeztek, mert az arról termelt víz mennyisége és minősége nem bizonyult megfelelőnek. A sikeres mikrobamentesítés ellenére a gyantatöltet idővel visszafertőződött, 3 hónap után már ismét számos sejtet figyeltünk meg a gyanták felszínén, bár kompakt biofilm kialakulás még nem volt kimutatható. Ezért javasoltuk a gyantatöltetek időszakos (3-6 havonta történő) vegyszeres fertőtlenítő kezelését és gyakori finomsótalanvizes mosását. 8
2. kép. A kevertágyas ioncserélő a vegyszeres kezelést, többszöri finomsótalanvizes öblítést és levegővel történő bolygatást követően A gyantaszemcsék felszíne töredezett, sérült, de mikrobák már nem mutathatóak ki rajtuk. 8. A finomsótalanvíz-tartályból származó vízminta speciális táptalajokon történő vizsgálatai a tenyészthető diverzitás egy új szeletét tárták fel a korábbi, ugyanezen üzemből származó mintákkal elvégzett, tenyésztésen alapuló vizsgálatokhoz képest. Több olyan baktériumtörzset sikerült tenyésztésbe vonnunk, melyek irodalmi adatok alapján vizes környezetekben általánosan előfordulnak és ott biofilmek képzésének kulcsfontosságú szervezetei, valamint a változatos anyagcsere utakkal jellemezhető baktériumtörzsek közül több képes lehet a csőrendszerek gumibevonatának bontására, fémek korróziójára, korróziós folyamatok elősegítésére. A speciális táptalajokról a korábban megismert közösségektől eltérő baktériumokat sikerült tenyésztésbe vonni, amely tapasztalat megerősíti, hogy az alkalmazott táptalaj összetétele erősen befolyásolja, hogy milyen szervezeteket sikerül tenyésztéssel feltárni egy adott környezetből. 9. Több általunk izolált szervezet a tudományra nézve új fajt képviselt. Ezek polifázikus taxonómiai vizsgálata és az új taxon tudományos folyóiratban történő publikációja megtörtént. Az új faj Phreatobacter oligotrophus néven került leírásra (1. ábra). 9
64 99 73 73 98 65 98 90 Bosea eneae 34614 T (AF288300) Bosea vestrisii 34635 T (AF288306) 60 Bosea lupini LMG 26383 T (FR774992) Bosea thiooxidans DSM 9653 T (AJ250796) 58 75 60 Bosea minatitlanensis AMX51 T (AF273081) Bosea robiniae LMG 26381 T (FR774994) Bosea massiliensis 63287 T (AF288309) Bosea lathyri LMG 26379 T (FR774993) Methylobacterium komagatae 002-079 T (AB252201) Methylobacterium organophilum ATCC 27886 T (AB175638) Methylobacterium suomiense NCIMB 13778 T (AB175645) Bradyrhizobium pachyrhizi PAC48 T (AY624135) 98 Afipia birgiae 34632 T (AF288304) 97 Afipia broomeae ATCC 49717 T (U87759) 95 65 96 99 Afipia massiliensis CIP 107022 T (AY029562) Oligotropha carboxidovorans ATCC 49405 T (CP002826) Pseudomonas carboxydohydrogena DSM 1083 T (AB021393) Nitrobacter hamburgensis X14 T (CP000319) Nitrobacter vulgaris DSM 10236 T (AM114522) 94 Nitrobacter winogradskyi Nb-255 T (CP000115) PI_25 (HE616166) PI_21 T (HE616165) PI_31 (HE616168) Labrys portucalensis F11 T (AY362040) Labrys miyagiensis G24103 T (AB236170) 99 Labrys okinawensis MAFF210191 T (AB236169) Hansschlegelia zhihuaiae S113 T (DQ916067) Ancalomicrobium adetum DSM 4722 T (AB095950) Prosthecomicrobium pneumaticum ATCC 23633 T (AB017203) Pleomorphomonas oryzae F-7 T (AB159680) Rhizobium huautlense S02 T (AF025852) Rhizobium soli DS-42 T (EF363715) Rhizobium oryzae Alt505 T (EU056823) Mycoplana ramosa DSM 7292 T (EU022308) Sinorhizobium meliloti IAM 12611 T (NR 043399) Ochrobactrum lupini LUP21 T (AY457038) Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 T (CP000758) Ochrobactrum cytisi ESC1 T (AY776289) Sphingomonas paucimobilis ATCC 29837 T (U20776) 0.01 1. ábra. 16S rrns alapján készített Neighbour-joining fa az általunk izolált baktériumtörzsekkel (PI_21 T, PI_25, PI_31) és azok legközelebbi rokonaival A fán az 0 ismétlés alapján számított bootstrap értékeket (csak az 50% fölöttieket) jelöltük. A pontok azokat a helyeket jelölik, melyek minden faszerkesztési móddal ugyanazt az elágazást mutatták. A bar nukleotidonként egy szubsztitúciót jelöl. 10
A TÉZISEK ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK 1. BOHUS, V., KÉKI, ZS., MÁRIALIGETI, K., BARANYI, K., PATEK, G., SCHUNK, J., TÓTH, E. M.: Bacterial communities in an ultrapure water containing storage tank of a power plant. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 58, 371-382 (2011). 2. KÉKI, ZS., GRÉBNER, K., BOHUS, V., MÁRIALIGETI, K., TÓTH, E. M.: Application of special oligotrophic media for cultivation of bacterial communities originated from ultrapure water. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 60, 345-357 (2013). 3. TÓTH, E. M., KÉKI, ZS., BOHUS, V., BORSODI, A. K., MÁRIALIGETI, K., SCHUMANN, P.: Aquipuribacter hungaricus gen. nov., sp. nov., a novel actinobacterium isolated from the ultra-pure water system of a Hungarian power plant. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 62, 556-562 (2012). 4. TÓTH, E. M., VENGRING A., HOMONNAY, Z.G., KÉKI, ZS., SPRÖER, C., BORSODI, A.K., MÁRIALIGETI, K., SCHUMANN, P.: Phreatobacter oligotrophus gen. nov., sp. nov., a novel Alphaproteobacterium isolated from the ultrapure water of a water purification system of a Hungarian power plant. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64, 839-845 (2014). 11