F E H É R J E D I N A M I K A V I Z S G Á L ATA Ú J F O S Z F O R E S Z C E N C I Á N A L A P U L Ó E L J Á R Á S S A L Doktori dolgozat tézisei

F E H É R J E D I N A M I K A V I Z S G Á L ATA Ú J F O S Z F O R E S Z C E N C I Á N A L A P U L Ó E L J Á R Á S S A L Doktori dolgozat tézisei schay gusztáv témavezető: prof. fidy judit d.sc. Biológia doktori Iskola az Iskola vezetője: Prof. Erdei Anna D.Sc. Szerkezeti Biokémia doktori program programvezető: Prof. Gráf László D.Sc. Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet 2013 március

bevezetés Ma már nem kérdéses, hogy a fehérjék működésének megértésében a szerkezeti dinamikának alapvető szerepe van. A mintegy tizenkét időbeli nagyságrendet átfogó mozgások vizsgálatára számos módszert kidolgoztak és alkalmaztak. Természetesen egy-egy módszer a mozgások rendkívül széles időskájának többnyire csak egyegy kisebb szeletét tudja átfogni. Az enzimek ciklus-ideje tipikusan a ms - s időtartományba esik, ezért ennek az időtartománynak a vizsgálata különösen fontos a működés megértéséhez. Sajnálatosan éppen ebben az időtartományban kevés módszer áll a kutatók rendelkezésére, különösen a nagyobb méretű fehérjék vizsgálata okoz problémát. PhD munkám során olyan optikai jelen alapuló méréstechnikát kerestem, amely alkalmas ezen időtartományú mozgások jellemzésére. Az optikai jelek közül a foszforeszcencia-lecsengések élettartama lehet alkalmas ilyen célra. Fiziológiás hőmérsékleteken azonban ezt a jelet a belső mozgásoknál sokkal erősebben befolyásolja a jelen levő oxigén-tartalom, ami a foszforeszcencia igen hatékony kioltója. Ezért a ms-s tartományú dinamika jellemzése ezzel az egyébként igen érzékeny módszerrel csak oxigén-mentes környezetben lehetséges, és csak abban az esetben, ha a vizsgált rendszer nem tartalmaz más erős kioltó molekulákat (pl egyes aminosav oldalláncok sajnálatosan ilyenek). Irodalmi példák és saját tapasztalataink is mutatják, hogy ezt a feltételt igen nehéz reprodukálható módon teljesíteni, amellett, hogy eltér a fiziológiás környezettől. Munkám elsősorban arra irányult, hogy kidolgozzam azokat a mérési feltételeket, amelyek mellett a foszforszecencia lecsengés életidejének dinamikai érzékenysége felhasználhatóvá válik anélkül, hogy a mintát oxigén-mentesíteni kellene. Elképzelésem az volt, hogy éppen a jelen levő oxigén kioltó hatására építve jellemezzem a belső dinamikát. A módszert részletesen humán hemoglobin esetében mutatom be, de célom volt, hogy a módszer alkalmazhatóságát más szerkezetű fehérjék esetében is bemutassam. Példaként a foszfoglicerát kináz (PGK), és dutpáz enzimeket választottam. A fenti módszer kidolgozása és alkalmazása mellett speciális fluoreszcencia módszereket is alkalmaztam a humán hemoglobin alloszterikus effektorai szerkezetmódosító hatásának vizsgálatában. Ezekben a vizsgálatokban egyrészt hangolható lézeres gerjesztést használtam, másrészt speciális mintatartót amelyben a hőmérséklet mellett a hidrosztatikai nyomás is variálható volt. Feladatom volt e speciális módszerek adaptálása a hemoglobin effektor komplexek szerkezeti és dinamikai vizsgálatára, valamint az így nyerhető eredmények összevetése a foszforeszcenciát alkalmazó módszer eredményeivel. Feladatom volt továbbá a mérési adatokhoz kapcsolódóan bizonyos szerkezeti paraméterek (pl. disszociációs állandó) becslése is. Hemoglobin esetében az említett fluoreszcencia módszerek alkalmazásához egy Fe Zn-helyettesített humán hemoglobin változatot alkalmaztam, mivel a Zn-porfirin fluoreszcens, míg a vas-tartalmú eredeti nem. 1

módszerek Foszforeszcencia-spektroszkópia: A vizsgálandó fehérjét annak 10 K-re történő gyorsfagyasztása után sok hőmérsékleti lépcsőben fokozatosan melegítettem fel. Eközben mértem a foszforeszcencia-élettartamot. A méréshez egy átlalkított, saját fejlesztésű adatgyűjtővel ellátott Edinburgh Instruments EAI-FL-900 fluorimétert használtam, mely villanó-xe lámpát tartalmaz gerjesztő fényforrásként. A fehérje-mintát egy 80 mikroliteres kvarccsőbe töltve egy Cryophysics M-22 kriosztát hűtötte, melynek optikai ablakai a fluoriméter mintaterében voltak. A mérés során nagyon alacsony emittált foton-intenzitások mellett kellett az élettartamot meghatározni, a kiértékeléshez stabil paraméterként a súlyozott átlag-élettartamot használtam minden hőmérsékleti pont esetében. UV-VIS abszorpciós és FTIR spektroszkópiai vizsgálatokkal ellenőriztem a minta előkészítés során a minták minőségét. Az FTIR spektroszópiát a hidrosztatikai nyomás hatásának vizsgálatához is alkalmaztam, ehhez egy gyémánt-cellát (diamond anvil cell, Diacell Ltd) használtam, melyet egy Bruker V-40 vákuumozható FTIR spektrométerbe helyeztünk be. Ezzel a módszerrel változtatható hidrosztatikai nyomás alatt lehetett FTIR spektrumokat mérni. Az amid-sáv alakváltozásából a másodlagos szerkezet esetleges megváltozását tudtam nyomon követni. Az UV-VIS abszorpciós spektrumokat egy Varian Cary 4E fotométerrel vettem fel, és elsősorban a porfirin abszorpciós sávjának alakját vizsgáltam vele, hemoglobin esetében ez nagyon érzékeny a harmadlagos szerkezet megváltozására, így alkalmas a szerkezeti integritás ellenőrzésére. Fluoreszcencia-vonalkeskenyedéses spektroszkópia: Ez a mérési eljárás alacsony, legfeljebb 10 K hőmérsékletre hűtött rendszert igényel, segítségével azonban - többek között - tanulmányozható az inhomogén populáció eloszlás függvény (IDF). Az IDF a fluoreszcencia emissziós spektrum tisztán elektron-átmenetekből származó része, tehát a vibronikus járulék nélküli elméleti spektrum. Ez meghatározható több eltérő, és igen keskeny sávú gerjesztés mellett felvett emissziós spektrum sorozatából. Az IDF hullámszám-skálán történő hidrosztatikai nyomástól függő eltolódásának mértéke arányos az izoterm kompresszibilitással. Ezt kihasználtam az alloszterikus effektorok által a hemoglobinban okozott kompresszibilitásváltozás meghatározására. Ez a technika csak a Zn-jelzett hemoglobin esetében volt használható, mivel csak az fluoreszcens. A mintát az M-22 kriosztát hűtötte 8-10 K közötti hőmérsékletre. Gerjesztéshez egy Coherent Ar-ion lézerrel pumpált Coherent 899 festéklézert használtam. A fluoreszcencia emissziót egy Jobin-Yvon M-1000 monokromátor és hozzá kapcsolt Andor CCD segítségével vettem fel, a CCD-t glimmlámpa neon-vonalainak segítségével kalibráltam minden spektrum-felvétel előtt. A lézer hangolását, és a spektrumsorozat kiértékelését saját fejlesztésű programmal végeztem. Nyomás-perturbációs fluoreszcencia-spektroszkópia: Jelen ismereteink szerint nagy (néhány kbar, azaz néhány 100 MPa) hidrosztatikai nyomás a fehérjék szerkezetét két lépcsőben módosítja. Alacsonyabb nyomásértékek (1-2 kbar-ig) esetében vízmolekulák hatolnak be a olyan határrétegekbe, melyeket egymáshoz lazán kapcsolódó láncok alkotnak. Tipikusan ilyenek az intermolekuláris komplexek. Ezzel párhuzamosan az esetleg jelenlévő nagyobb üregek összenyomódnak. Magasabb (általában 3 kbar feletti) nyomások esetében a fenti jelenségek kiterjednek egyedi molekulákra is, és szerkezeti 2

fellazulást, majd denaturációt okoznak. Az alacsonyabb nymás-tartomány használható a határfelületek vizsgálatára. Ezt használtam ki a hemoglobin tetramer esetében is az alloszterikusan kötődő kismolekulák 1 hatásának jellemzésére. A mintát egy 300 mikroliter térfogatú, teflon dugattyúval lezárt kvarccsőben egy SITEK (Svájc) 740.2104 típusú nyomáscellába tettem, melyet egy Jobin-Yvon Fluorolog-3 típusú fluoriméterbe építettünk be. A hidrosztatikai nyomást egy SITEK gyártmányú dugattyús pumpa segítségével a zárt rendszerbe történő víz-benyomással állítottam be, a nyomást elektronikus nyomástávadóval mértem. eredmények A bemutatott eredmények jelentős része megjelent folyóiratcikk formájában is, néhány kézirat még készül, illetve beadás alatt van. Az egyes eredményeket a kísérleti megfigyelések szerint csoportosítottam, és szögletes zárójelben jeleztem hogy melyik közleményem tartozik hozzájuk 2. 1. Foszforszecencia élettartam-mérésen alapuló módszert dolgoztam ki, amely alkalmas a ms-s időtartományú fehérje-dinamika jellemzésére anélkül, hogy a mintát oxigén-mentesíteni kellene. A módszer lényege a következő: az oxigénnel telített oldatban elkészített fehérje-mintát hirtelen (viszonylag gyorsan) lefagyasztjuk 10 K- re, majd fokozatosan, 5-10 K-es lépésekben felmelegítjük, miközben mérjük a fosz foreszcencia élettartamot. Alacsony hőmérsékleten az élettartam a kioltó mechanizmusok befagyása miatt igen hosszú. Feltételeztem, hogy ha a hőmérséklet emelése során a fehérje dinamikai mozgása aktiválódik, lehetővé válik az emisszió leghatékonyabb kioltójának, az oxigénnek a diffúiója, amely kioltáshoz vezet. Így az a hőmérséklet, ahol az élettartam csökkenése megindul, a szerkezeti dinamikára lesz jellemző. - A gyors lefagyasztásra a jelentős mértékű fázisszeparáció, illetve a denaturáció elkerülése miatt volt szükség, ehhez speciális módszert dolgoztam ki a zárt rendszerű kriosztát használata mellett. - A mérési elképzelés megvalósításához nem használhattam semmilyen, az optikai átlátszóságot biztosító segédanyagot (pl. glicerint), mert ez a dinamikát is befolyásolta volna. Az erősen fényszóró mintákon az adatgyűjtés pontonként igen hosszú időt jelentett, meg kellett oldani a mérőműszer stabilizálását és automatizálását is, ehhez egy meglévő EAI-FL-300 moduláris felépítésű fluoriméter alkatrészeit felhasználva egy saját fejlesztésű mérőműszert építettem. Megmutattam, hogy az átlagos foszforeszcencia-élettartam hőmérsékletfüggésében megfigyelhető két, eltérő hőmérsékleten bekövetkező lépcsőszerű élettartam-csökkenés. Ezek közül az első (azaz az alacsonyabb, 180-210 K körül bekövetkező) specifikusan köthető a fehérjében a melegítés során bekövetkező dinamikai változásokhoz. 1 gyakoribb néven alloszterikus effektorok 2 Amennyiben még nem jelent meg, vagy készülőben van, úgy ezt a szám előtti "E jelzi, utalva az Egyéb... publikációk részre. A tézisfüzet eredeti verziójához képest azóta történtek változások. 3

A második, 250 K felett tapasztalható újabb csökkenés azonosítható az oldószer fázisátalakulásával. Ezt direkt kísérletben is ellenőriztem, egy foszforeszcens porfirin-származék jelének segítségével. Az azonosítást az is alátámasztja, hogy ez a hőmérséklet közel esik a fagyott oldat olvadáspontjához. Kimutattam, hogy a hemoglobinban alkalmazott foszforeszcens jelző önmagában nem mutat semmilyen szignifikáns, lépcsőjellegű élettartam-változást a kísérleti hőmérséklet-tartományban. Megmutattam, hogy ha a foszforeszcens porfirin jelzés helyett a hemoglobin triptofánjainak jelét mérjük, az is éppúgy alkalmas a fehérje belső dinamikájának jellemzésére. Követhezésképpen a módszerből nyerhető információ független a spektroszkópiai jelző típusától, és a molekulában lévő pontos helyétől is. FTIR és UV-VIS abszorpciós, illetve fluoreszcencia spektroszkópiai mérésekkel igazoltam, hogy az általam használt gyors hűtés során nem következik be a fehérje denaturációja, vagy szerkezeti torzulása. [3] 2. Kidolgoztam egy egyszerű modellt az első, alacsonyabb hőmérsékleten bekövetkező, fehérjéhez köthető átalakulás leírására. Ebben feltesszük, hogy a rendszer két állapotú, melyből az egyik (kezdeti, 180 K- nál alacsonyabb hőmérsékleten megfigyelhető állapot) dinamikailag inaktív, merev szerkezet. Ebben az állapotban a fehérjében jelenlévő foszforeszcenciát kioltani képes molekulák (pl. O 2 ) diffúziója gátolt, így a kioltási hatásfok elhanyagolhatóan kicsi, következésképpen a mérhető átlagos élettartam hosszú. Amikor a rendszer hőmérsékletét növeljük, ezzel a fehérjében a mozgásokat termikusan aktiváljuk. A meginduló mozgások elősegítik a kioltó molekulák, pl oxigén diffúzióját, ami megnövekedett dinamikus kioltási hatásfokban jelentkezik, és az átlagos élettartam csökkenését okozza. Mivel ez a megfigyelés nem függött a foszforeszcens jelző helyétől, így a mozgások aktivációja szükségképpen kollektív jelenség, és egy adott hőmérsékletet elérve gyakorlatilag egyszerre kell hogy bekövetkezzen az egész fehérje-molekulában. Mivel a foszforeszcencia leginkább a ms - s időskálájú folyamatokra érzékeny, így ennek megfelelően a (kollektív) ms - s időskálájú mozgások aktivációját tudjuk megfigyelni. A modell segítségével meghatároztam a mozgások beindulásához (a kollektív dinamika aktivációjához) szükséges energia és entrópia járulékot. Az így kiszámított paraméterek megfelelnek egy néhány aminosavra kiterjedő átmeneti üreg kialakulásának, melynek létét eddig is feltételezték néhány esetben (pl. mioglobinban nagynyomású Xe atmoszférában történő kristályosításkor). Javasoltam egy kvalitatív leírást, mely szerint a kioltó molekulák diffúziója diszkrét, a kollektív fehérje-dinamikához csatolódó ugrásokban történik. A kiszámított paraméterek érzékenyek a hemoglobinhoz adott alloszterikus effektorok jelenlétére, tehát a fehérje működésének megváltoztatására. Ezzel 4

bizonyítottam, hogy a mérés során megfigyelt kollektív mozgásformák biológiailag releváns folyamatok megfigyelésére is alkalmasak lehetnek. Elképzelhető, hogy az alloszterikus szabályozás egyik mechanizmusa a kollektív mozgásokban kódolt információ megváltoztatása a mozgás-mintázat befolyásolásával, amit a fehérje-molekula egymástól távoli részei is egyszerre érzékelni tudnak. [3], [E1] 3. Speciális fluoreszcencia kísérletek eredményei: A hemoglobin dimereket elválasztó határfelületeket vizsgáló kísérletsorozatban Megmutattam, hogy az alkalmazott 0-3 kbar nyomástartományban nem történik sem denaturáció, sem harmadlagos szerkezetváltozás a kísérlet során. A spektrumokban megfigyelt nyomás-függő átalakulás a hemoglobin tetramer dimerekre történő disszociációjaként értelmezhető. A spektrumok alakját a tetramer és a dimer állapotok spektrumának lineáris kombinációjaként értelmeztem, az alak nyomás-függéséből meghatároztam az atmoszferikus nyomásra vonatkozó a disszociációs állandót. Kimutattam, hogy az így meghatározható disszociációs konstans érzékeny az alloszterikus effektorok hatására a hemoglobin mindkét, irodalomban ismert szerkezete (R és T) esetében. [2] A hidrosztatikai nyomás 0-10 kbar közötti változtatását lehetővé tevő mintatartó és 10 K hőmérsékletet biztosító kriosztát segítségével a fluoreszcencia vonalkeskenyedés (FLN) módszerét alkalmaztam a hemoglobin globális dinamikájának a kompresszibilitási állandón keresztül történő jellemzésére. Meghatároztam a hemoglobin alloszterikus effektorokkal alkotott komplexeire az IDF nyomásfüggését, ami közvetlenül kapcsolatban van a kompresszibilitással. Az egyes komplexekben kapott értékek közötti eltérés sokkal kisebbnek adódott mint a többi kísérletben. Ennek az lehet az oka, hogy a módszer a fehérje-dinamikát alacsony hőmérsékleten jellemzi. [e2] 4. Mind a PGK, mind a dutpáz esetében tapasztalható a hemoglobinban megfigyelthez hasonló dinamikai átalakulás, ami erősíti azt a feltételezést hogy a mérési módszer általános érvényű. PGK esetében meghatároztam több különböző szerkezeti konstrukció esetében az aktivációs energia- és entrópia- értékeket. 5

Kimutattam, hogy a PGK két doménje dinamikai szempontból aszimmetrikusan aktiválható, azonban mindkét domén esetében a szomszédos domén jelenléte jelentősen befolyásolja ezt az aktivációt. Azt találtam, hogy PGK esetében az eddig ismert csuklómozgáson kívül más dinamikai csatolás, kommunikáció is létezik a domének között, ezt az támasztja alá, hogy a dinamikai aktiváció legalább részben megvalósul akkor is, ha a szilárd környezet miatt a csuklómozgás maga nem lehetséges. [4] dutpáz esetében az eddigi adatokból arra tudtam következtetni, hogy a katalízisben fontos szerepet játszó C-terminális kar az apo-enzimben erősebben csatolódik dinamikailag a fehérjét körülvevő oldószerhez mint magához a fehérjéhez, míg ezzel szemben a szubsztrát-kötött szerkezetben a kar dinamikáját a fehérje többi része határozza meg. [ez egyelőre előzetes eredmény] tézisek 1. Kidolgoztam egy adatgyűjtési és minta-előkészítési eljárást, továbbá megmutattam hogy ennek segítségével a foszforeszcencia-kioltás hőmérséklet-függését mérve, az alkalmas a fehérje szerkezet belső dinamikájának jellemzésére, illetve ezen dinamika megváltozásának megfigyelésére. [ebből származtatható a 2-5 tézis] 2. Megmutattam, hogy fehérjék esetében az alacsony, 10 K körüli hőmérsékletekről induló felfűtés során bekövetkező, (a foszforeszcencia-kioltásban megjelenő) első ms-s időskálájú dinamikára vonatkozó aktiváció (vagy dinamikai átalakulás) az oldószertől nagyrészt függetlenül, az oldószer dinamikai aktivációjánál alacsonyabb hőmérsékleten következik be. [3] 3. Glicerin, és néhány egyéb, a fagyasztás során gyakran alkalmazott segédanyag ezt úgy változtatja meg, hogy a fehérje önálló aktivációja nem marad megfigyelhető. [3] 4. A fehérjéhez rendelhető dinamikai aktiváció jellege nagymértékben függ a fehérje típusától. A hemoglobin esetében a vizsgált szerkezet-módosító effektus (az alloszterikus effektorok jelenléte) is befolyásolta az aktivációt, de ez kisebb változás mint pl. a hemoglobin es a mioglobin közötti eltérés. [3,4,E1] 5. A PGK enzim két doménje megfeleltethető két (N és C-vel jelölt), részben önálló dinamikai egységnek, melyek között azonban a ms-s időskálájú dinamikában jelentős, az ismert csuklómozgás gátoltsága esetén is létező csatolás áll fent. Az 6

egyes domének dinamikai aktivációja a PGK-ban csak együtt teljes, az N-domén dinamikai aktivációja csak a C-domén aktivációja után fejeződik be. [4] 6. A hemoglobin tetramer atmoszferikus nyomáson mérhető első (két dimerré) disszociációs lépése meghatározható nyomás-perturbációs fluoreszcencia spektroszkópiai mérésekkel a spektrum alakjának nyomásfüggő megváltozásából. Ez a módszer a szokásos módszereknél lényegesen egyszerűbben kivitelezhető. [2] 7. A hemoglobin disszociációs állandójának megváltozása korrelál a dimerek határrétegében, az alloszterikus effektorok által okozott változásokkal mind az R, mint a T állapotban. Ezzel igazoltam az irodalomban korábban megjelent feltételezést, hogy az alloszterikus effektorok a hemoglobin mindkét állapotában hatással vannak a szerkezetre, illetve a dinamikára. A disszociációs állandó megváltozása azonban az oxigénkötés változásában egymagában nem vezető effektus.[1,2] 8. FLN módszerrel meghatároztam a hemolgobin IDF-jének nyomásfüggő eltolódását, ezen keresztül jellemeztem az alacsony hőmérsékleten jelen lévő szerkezeti dinamikát. Alloszterikus effektorok hatására ennek kismértékű megváltozását mutattam ki. [E2, illetve konferencia-poszterek] az eredményekhez kapcsolódó folyóirat-közlemények 1. I. Kövesi, G. Schay, T. Yonetani, M. Laberge, and J. Fidy. High pressure reveals that the stability of interdimeric contacts in the r- and t-state of HbA is influenced by allosteric effectors: Insights from computational simulations. Biochim Biophys Acta, 1764(3):516 521, 2006. 2. G. Schay, L. Smeller, A. Tsuneshige, T. Yonetani, and J. Fidy. Allosteric effectors influence the tetramer stability of both r-and t-states of hemoglobin A. Journal of Biological Chemistry, 281(36):25972 25983, 2006. 3. G. Schay, L. Herényi, M. Kellermayer, K. Módos, T. Yonetani, and J. Fidy. Millisecond time-scale protein dynamics exists prior to the activation of the bulk solvent matrix. The Journal of Physical Chemistry B, 115 (19):5707 5715, 2011. 4. G. Schay, L. Herényi, J. Fidy, and Sz. Osváth. Role of domain interactions in the collective motion of the Phosphoglycerate Kinase. Biophysical Journal, 104(3):677 682, 2013. egyéb megjelent, illetve készülő publikációk 1. G. Schay, L. Herényi, A. Kaposi, L. Smeller, and J. Fidy. Collective, ms timescale dynamics may play a signifcant role in the allosteric regulation of hemoglobin. (under submission / manuscript in preparation). 7

2. G. Schay, L. Herényi, K. Szigeti, A. Kaposi, L. Smeller, and J. Fidy. Allosteric effectors have an asymmetric influence on the compressibility of hemoglobin subunits - a fluorescence line narrowing study. (under submission / manuscript in preparation). 3. G. Schay, R. Galántai, M. Laberge, and J. Fidy. Protein matrix local fluctuations and substrate binding in HRPC: A proposed dynamic electrostatic sampling method. International Journal of Quantum Chemistry, 84 (2):290 301, 2001. konferenciák 1. Laberge M., Galantai R., Schay G., and Fidy J. Dynamic electrostatic selectivity in the binding of HRPC to small aromatic substrates. Biophysical Society Annual Meeting 2001, feb.18-21, Boston. [poster] 2. Schay G., Laberge M., Szigeti K., Kövesi I., Smeller L., Tsuneshige A., Yonetani T., and Fidy J. Role of dynamics in the influence of allosteric effectors on the oxygen binding of Human Hemoglobin. World Biophysics Congress, 2005.sep.1-4, Montpelier. [poster] 3. Schay G., Kövesi I., Smeller L., Laberge M., Yonetani T., and Fidy J. The interdimeric interface of Human HbA is influenced by the binding of allosteric effectors in both R and T quaternary states. Semmelweis University Faculty of Pharmacy 50 years anniversary int. symposium 2005, oct.12-15, Budapest. [poster] 4. Schay G., Smeller L., Yonetani T., and Fidy J. Allosteric effectors influence the tertiary structure of R and T states of Hemoglobin A : evidence for conformational changes at the interdimeric interface. Biophysical Society Annual Meeting 2006, feb.18-23 Salt Lake City, (int.student travel grant) [poster] 5. Schay G., Smeller L., Yonetani T., and Fidy J. Changes at the intersubunit interface of human Hemoglobin A upon effector binding does not result in a (large 3 ) compressibility change at the heme pocket. XLIV. EHPRG Meeting, 2006, sept. 4-8, Prague. [poster] 6. Schay G., Smeller L., Yonetani T., and Fidy J. Changes at the intersubunit interface of human Hemoglobin A upon effector binding does not result in a (large) compressibility change at the heme pocket. 9th International Summer School on Biophysics SUPRAMOLECULAR STRUCTURE AND FUNCTION 2006, sept. 16-28,Rovinj, Red Island. [presentation] 7. Schay G., Smeller L., Szigeti K., Kaposi A.D., Yonetani T., and Fidy J. Changes at the interdimeric interfaces of Human Hemoglobin A upon effector binding shows the importance of global tertiary structural changes in the regulation of Hb function. Joint meeting of the Hungarian and German Biophysical Societies 2007, may. 17-20, Hünfeld. [presentation] 8. Schay G., Smeller L., Yonetani T., and Fidy J. Changes at the intersubunit interface of human Hemoglobin A upon effector binding does not result in a (large) compressibility change at the heme pocket. COST D30 Meeting 2007, oct. 26-27, Bordeaux. [poster] 9. Schay G., Osváth Sz., Yonetani T., and Fidy J. The role of collective, ms timescale dynamics in the regulation of multi-domain proteins. A phosphorescence approach. Biophysical Society Annual Meeting 2008, feb.17-22, Long Beach. (int.student travel grant) [presentation] 3 Az eredeti címből ez kimaradt 8

10. Schay G., Osvath Sz., Smeller L., Kaposi A.D., and Fidy J. Method to characterize the global dynamics of proteins by temperature dependent phosphorescence lifetime measurements. Application for the allosteric effect in Hemoglobin. Biophysical Society Annual Meeting 2009, feb 28-mar.4, Boston. [presentation] 11. Schay G., Osvath Sz., Herényi L., and Fidy J. Kollektív, ms időskálájú mozgások vizsgálata PGK esetében - domain kölcsönhatások szerepe a dinamika aktivációjában. A Magyar Biofizikai Társaság XXIII. Kongresszusa 2009, aug. 23-26, Pécs. [presentation] 12. Schay G., Fekete M., Kardos J., Kellermayer M., Pongor Cs., and Fidy J. Self-association of the hsrad51 recombinase on ssdna. Studies by combined higy pressure and fluorescence methods. 12 th International Conference on Methods and Applications of Fluorescence 2011, sept. 11-14, Strasbourg. [poster] 13. Fekete M., Schay G., Kardos J., Pongor Cs., Kellermayer M., and Fidy J. Effect of DNA binding on the self-association of the human recombinase protein Rad51. 8 th EBSA European Biophysics Congress 2011, aug. 23-27, Budapest. 14. Schay G., Fekete M., Kardos J., Kellermayer M., Pongor Cs., and Fidy J. Effects on the selfassociation of the human recombinase Rad51. 49 th European high pressure research group conference 2011, aug. 28 - sept. 2, Budapest. [poster] 15. Schay G., Fekete M., Kardos J., Kellermayer M., and Fidy J. Self-Association and DNA Binding of hsrad51 Studied by Pressure Perturbation Spectroscopy Biophysical Society Annual Meeting 2012, feb.24-29, San Diego [poster] 16. Fidy J., Fekete M., Kardos J., Schay G., Vass K., and Wesolowska M. Conditions inducing the helical filament formation of the recombinase hsrad51 in solution and bound to ssdna. Prague protein spring meeting 2012 may 3-6, Prague [poster] 9