II. GENOMIKA: TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN

Genomika Strukturális Funkcionális Integratív

Strukturális genomika Genomkönyvtárak DNS szekvenálás Genom programok Polimorfizmusok RFLP

DNS könyvtár készítés humán genom 1. Emésztés RE-kal Emberi duplaszálú (ds) DNS (genomi) DNS fragmensek milliói DNS fragment plazmidba építése Plazmidok baktériumba juttatása Rekombináns DNS molekulák Génkönyvtár

Genomkönyvtár készítés 2. 2.: 1.: ligálás emésztés plazmid restrikciós vektorba endonukleázzal 2 5 3 4 6 1 2 5 3 1 2 3 4 5 6 1 4 6

Genomkönyvtár készítés 2 5 3. 3.: 2.: transzformáció ligálás plazmid vektorba Escherichia coli-ba 3 2 5 1 4 6

Génkönyvtárak 4. Genom könyvtár: klóngyűjtemény, amelyben megtalálható egy adott organizmus genomjának minden darabja (genom projektek) Felhasználása: szekvenálás, gének izolálása cdns könyvtár: egy organizmus összes mrns-ének másolatait tartalmazza Felhasználás: génszerkezet megállapítása, cdns-ek izolálása (intron-mentes gének). A transzkriptomot hivatott reprezentálni. EST könyvtár: expressed sequence tag, a transzkriptomot reprezentálja, de a cdns-eknek csak valamelyik végét (5 vagy 3 ) tartalmazza. Felhasználás: egy sejttípus vagy szövettípus transzkriptom gyors meghatározása (értsd: Milyen gének fejeződnek ki ebben a sejtben?). Az aktív genom gyors szekvenálására is használták.

cdns-könyvtár készítés 5. Hogyan készítünk cdns-t? mrns cdns 5 GGGGG 5 második cdns 3 CCCCC 3 első szál szál AAAAAAAAA 3 3 TTTTTTTTT 5 1. RNS (mrns) tisztítás: használhatunk teljes, vagy mrns preparátumot 2. Reverz transzkripció: oligo-dt primerrel és reverz transzkriptázzal (RNS-függő DNS polimeráz) elkészítjük a cdns első szálát 3. RNáz kezelés 4. Linker szintézis: terminális dezoxinukleotidil transzferázzal (DNS polimeráz, amely nem igényel templátot) oligo G linkert szintetizálunk 5. Második szál szintézis: oligo dc primerrel és DNS polimerázzal készül el a cdns második szála.

DNS szekvenálás A Sanger módszer 6. v Didezoxi-nukleotid módszer Stop-nukleotid módszer Láncterminációs módszer AUTOMATIZÁLHATÓ

DNS szekvenálás A Sanger módszer 7. (A) A DNS szál szintézis kezdete Primer 5 3 Templát DNS (B) Didezoxinukleotid 3 5 5 3 T T T Bázis 3 5 5 3 T T T T T T 3 5 (D) Az autoradiogram eredménye A T G C DNS szekvencia GAATTGGCGCG GAATTGGCGC GAATTGGCG GAATTGGC GAATTGG GAATTG GAATT GAAT GAA GA G Az A család dda dda (C) Amikor egy ddntp (a példában ddatp) kapcsolódik, a szál szintézise leáll dda dda T T T dda T T T dda T T T

Templát: 3 DNS szekvenálás A Sanger módszer 8. CCGGTAGCAACT 5 Primer : 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT n A C G T 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 A3 G T T G C T A C C5 A templát DNS-sel komplementer szekvencia

9. Automatizált DNS szekvenálás fluoreszcens ddntp-kel (A) dda ddt ddc ddg ddntp-k mindegyik típus más-más színű fluoreszcens festékkel megjelölve Szekvenálási reakció, a termékek frakciói ddt dda dda ddg ddc ddc ddg Detektor Képalkotó rendszer (B) CACCGCATCGAAATTAACTTCCAAAGTTAAGCTTGG

Valódi egymolekulás szekvenálás tsms 100-200bp-os DNS szálak szekvenálása 100 milliós nagyságrendben, egyidőben Naponta több milliárd bázis megszekvenálása

Humán Genom Program 10.

A módszerek 11. Hierarchikus módszer vs. Shotgun szekvenálás Kromoszómák (HGP) (Celera) Nagy BAC klónok készítése, végeik megszekvenálása Teljes genom feldarabolás és azonnali szekvenálás BAC klónok darabolása, szubklónozás

Ki a megszekvenált genom gazdája? 2001 A humán genom program eredményeként a haploid humán genom nyers szekvenciája 50 férfi és nő etnikailag diverz csoportja (HGP) 8 ismeretlen etnikumú férfi 21 férfi és nő etnikailag diverz csoportja (Celera) 2 férfi, 3 nő, 1-1 ázsiai, afrikai, latin.-amerikai 2 kaukázusi 12. 2003 Az első teljes emberi genom 2006 Az teljes genom kiegészítése az 1-es kromoszómával 2007 Az első 2 diploid genom: Venter & Watson 2008 Egy han kínai és egy yoruba férfi diploid genomja

Genom programok 13.

Polimorfizmusok/molekuláris markerek 14. a humán genomban Polimorfizmus SNP Single Nucleotide Polymorphisms Alap szekvencia (bp) 1 STR: mikroszatellit 2-20 (?) VNTR: miniszatellit 15-100 RFLP - Polimorfizmus: többalakúság (görög) Polimorf DNS lokusz: amelyen két vagy több eltérő allél figyelhető meg egy adott népességben

VNTR és STR analízis 15. 1. Amplifikálás PCR-rel A PCR primerek azon DNS szekvenciáknak komplementerei, amelyek közvetlenül a ripít szomszédságában vannak. A PCR termék hossza függ: a ripítben ismétlődő egység hosszától a kópiák számától VNTRek: 3 személy 4 pár homológ kromoszómája A B C

VNTR és STR analízis 16. 2. Gélelektroforézis Az egység DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete alapján meghatározható a kópiák száma. Adott emberre jellemző mintázatot kapunk. Anya Apa Lányok Fiúk Apasági vizsgálat, személyazonosítás DNS ujjlenyomat Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp alapján elvégezhető

SNP-k 17. Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban ACGGCTAA Egy variáció SNP, ha a populáción belül valamennyi allélja minimum 1% gyakorisággal előfordul. Az SNP-k 66,6%-ban C--->T cserét jelentenek.

SNP-k 17. Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban ATGGCTAA Egy variáció SNP, ha a populáción belül valamennyi allélja minimum 1% gyakorisággal előfordul. Az SNP-k 66,6%-ban C--->T cserét jelentenek.

SNP-k vizsgálata: ASA 18. PCR termékek Primerek Normál allél A polimorf specifikus oligo hosszabb Polimorf allél PCR reakció Közös primer 3 vége fluoreszcensen jelölt Homozigóta normál genotípus Heterozigóta genotípus Homozigóta polimorf genotípus Elektroforézis méret

RFLP 19. Restriction Fragment Length Polymorphism restrikciós fragment hosszúság-polimorfizmus Restrikciós emésztést követő PCR Agaróz gél elektroforézis Ha egy báziscsere létrehoz vagy megszüntet egy restrikciós enzim felismerési helyet, akkor a hasítás mintázata megváltozik: a PCR során felsokszorozott DNS szakaszok emésztése során keletkező fragmentumok száma és mérete alapján a genotípus meghatározható.

RFLP 20. RFLP markerek öröklődése Szülők Gyerekek Genotípusok

Funkcionális genomika 21. Microchip Microarray scanner

A Chip (microarray) technológia 22. Strukturális genomika GENOM - szekvencia megállapítása - mutációk felderítése - egy nukleotid eltérések (SNP) - deléció inszerció - metilációs mintázat DNS chip-ek CITOPLAZMA DNS Funkcionális genomika TRANSZKRIPTOM - gén expresszió megváltozása, - splice-variánsok kimutatása - szabályozó RNS-ek (mirns) kimutatása transzkripció SEJTMAG transzláció pre-mrns protein trns Fehérje chip-ek PROTEOM mrns riboszóma - kifejeződés - módosítások - kölcsönhatások

A DNS chip 23. DNS-chipen több ezer gén aktivitását nyomon tudjuk követni. Minden pont egy génre jellemző szekvenciát tartalmaz. A biológiai mintából kinyert, fluoreszcensen megjelölt RNS a gén aktivitásával arányos fluoreszcens jelet ad. - a működés alapja: DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció - nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározása - egy chip 6-10,000 gén vizsgálatára alkalmas. - cdns chipek - oligonukleotid chip-ek

1. Chip elkészítése: - nyomtatás kontrol 2. Szövetminták begyűjtése beteg 24. 3. RNS tisztítás 4. Reverz transzkripció (fluoreszcens jelölés) 5. Hibridizálás 6. Detektálás

1. RNS izolálás. cdns szintézis. Microarray analízis - összefoglalás 25. minta 4. Adatelemzés 2. Jelölt próbák és a microarray hibridizálása 8x4x2 2x4x8 3. Szkennelés

ChIP (kromatin immunprecipitáció) Az antitest a specifikus transzkripciós faktorhoz köt 26. Formaldehiddel kezelt sejtek DNS fragmentek kinyerése szonikálással Antitestekkel való tisztítás A kromatin/antitest komplex összegyűjtése DNS tisztítás A fragmentek és a transzkripciós faktorok között keresztkötések létesülnek Specifikus transzkripciós faktor kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia

Real-Time PCR 27. alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában A fluoreszcencia intenzitása arányos a PCR termék mennyiségével a reakció végén nincs szükség gél-alapú kiértékelésre analízis: szoftver alapú

29. mrns expresszió vizsgálata lépések: RNS tisztítás (totál RNS, mrns; sejt, szövet) reverz transzkripció (RNS cdns) Real-Time PCR Fogalmak Real-Time PCR = qpcr (kvantitatív) RT2-PCR = qrt-pcr RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR

30. allél-specifikus Real-Time PCR TaqMan próbával az egyik primer 3 - vége az SNP-re kell, hogy essen a DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3 -vége az SNP-vel komplementer ebben az esetben detektálható a riporter fluoreszcenciája

fluoreszcencia 31. kezelt-kezeletlen egészséges-beteg érzékenyebb a DNS chipeknél kevesebb minta egyidejű analízise Relatív kópiaszám meghatározás: Ct tumor egészséges ciklusszám

32. 1. Na-biszulfitos kezelés Met CpG CpG Na-Biszulfit Met CpG UpG 2a. MetilC-Seq PCR Klónozás Szekvenálás 2b. Real-Time PCR