Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA

Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA 1 lemez - 96 teszt 72556 5 lemez - 480 teszt 72558 SZŰRŐVIZSGÁLATI TESZTKÉSZLET HCV (HEPATITIS C VÍRUS) FERTŐZÖTTSÉG EMBERI VÉRPLAZMÁBÓL/ SZÉRUMBÓL TÖRTÉNŐ KIMUTATÁSÁRA ENZIM- IMMUNASSAY MÓDSZERREL A Bio-Rad által gyártott és forgalomba hozott minden termék minőségellenőrzési rendszer keretén belül készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a forgalmazásig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál.

TARTALOMJEGYZÉK 1. A FELHASZNÁLÁS CÉLJA 2. A TESZT ALAPELVE 3. A TESZTKIT ÖSSZETÉTELE 4. SZÜKSÉGES, DE NEM MELLÉKELT ESZKÖZÖK ÉS ANYAGOK 5. EGÉSZSÉGÜGYI ÉS MUNKAVÉDELMI ELŐÍRÁSOK 6. ELŐVIGYÁZATOSSÁGI INTÉZKEDÉSEK 7. A HASZNÁLHATÓ MINTÁK 8. A REAGENSEK REKONSTITÚCIÓJA- ÉRVÉNYESSÉG - TÁROLÁS 9. A VIZSGÁLAT MENETE 10. A RENDSZER ADAPTÁCIÓJA 11. AZ EREDMÉNYEK SZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE 12. A MINTA ÉS A REAGENS BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA 13. A TESZT MŰKÖDÉSI TELJESÍTMÉNYE 14. A TESZT KORLÁTAI 15. IRODALOMJEGYZÉK 2

1 - A FELHASZNÁLÁS CÉLJA A Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat a HCV fertőzés kimutatására szolgáló kvalitatív enzim immunoassay, melynek alapja a kapszid antigénnek és a hepatitis C vírussal való fertőzöttséghez kapcsolódó antitesteknek a betegek vérszérumából vagy plazmájából történő kimutatása. 2 - A TESZT ALAPELVE A Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA mikrolemez szilárd fázisa a következőkkel van bevonva: a hepatitis C vírus kapszidfehérjéje ellen termeltetett monoklonális antitestek az E. coli NS3 régiója által kódolt két rekombináns fehérje: 1 és 3a genotípus egy rekombináns antigén a nem-strukturális NS4 régióból a hepatitis C vírus strukturális kapszid régiójából származó mutáns peptid A tesztben használt konjugátumok a következők: 1. sz. konjugátum (R6): a hepatitis C kapszid ellen egérben termeltetett biotinilált monoklonális antitestek. A monoklonális ellenanyag nem reagál a mikrolemez bevonására szolgáló mutáns C kapszid peptiddel. 2. sz. konjugátum (R7): humán IgG ellen egérben termeltetett antitestek és peroxidázzal jelölt streptavidin A teszt kivitelezése a következő reakciólépéseket foglalja magában: 1) Az 1. sz. konjugátumot, a vizsgálandó mintákat és a kontroll-szérumokat bemérjük a tesztlyukakba. A HCV elleni antitestek ha jelen vannak kötődni fognak a szilárd fázison rögzített antigénekhez. Ha a hepatitis C vírus kapszid antigén jelen van, ezt az antigént mind a mikrolemezre felvitt monoklonális antitestek, mind a hepatitis C kapszid antigén ellen termeltetett biotinilált monoklonális antitestek (1. sz. konjugátum) megkötik. 2) 37 ºC-on 90 percig tartó inkubálást és egy mosási lépést követően bemérésre kerül a peroxidázzal jelölt, anti-humán IgG ellenanyag és a streptavidinperoxidáz (2. sz. konjugátum). A streptavidin-peroxidáz konjugátum reakcióba lép a hepatitis C kapszid antigén elleni biotinilált monoklonális antitestekkel, ha azok jelen vannak. A peroxidázzal jelölt, anti-humán IgG antitestkonjugátum reakcióba lép az anti-hcv antitestekkel, amennyiben azok jelen vannak. 3) 37 ºC-on 30 percig végzett inkubálást követően a nem kötött enzimes konjugátumot egy mosási lépésben eltávolítjuk és az antigén-antitest komplexet a szubsztrát hozzáadásával azonosítjuk. 4) 30 perc múlva a reakciót leállítjuk és az abszorbancia-értékeket spektrofotométer segítségével 450/620-700 nm-en leolvassuk. A minták esetén mért abszorbancia-értékek lehetővé teszik a HCV elleni antitest és/vagy a HCV kapszid antigén jelenlétének vagy hiányának kimutatását. A kapott szín intenzitása arányos a szilárd fázison megkötött HCV-antitest vagy HCV-antigén mennyiségével. 3

3 - A TESZT KOMPONENSEI CÍMKE R1 R2 R3 R4 R5a R5b R6 R7 R8 R9 R10 A REAGENS TÍPUSA MIKROLEMEZ 12 db, egyenként 8 db, a hepatitis C vírus kapszid régiója, tisztított rekombináns antigének és a hepatitis C vírusra specifikus kapszid mutáns peptid ellen termeltetett monoklonális antitestekkel bevont tesztlyukat tartalmazó csík. MOSÓOLDAT 20x koncentrált Tris NaCl puffer, ph 7,4 Tartósítószer: 0,04% Proclin NEGATÍV KONTROLL BSA-tartalmú Tris HCl puffer Tartósítószer: 0,1% Proclin TM 300 POZITÍV KONTROLL HCV ellen termeltetett antitesteket tartalmazó humán szérum, HBs antigénre illetve anti-hiv1 és anti-hiv2 antitestekre negatív; BSA-t tartalmazó Tris HCl pufferban hígítva, fotokémiai úton inaktivált formában Tartósítószer: 0,1% Proclin TM 300 ANTIGÉN POZITÍV KONTROLL Antigén pozitív kontroll (kapszid szintetikus fehérje), liofilizált állapotban. ANTIGÉN HÍGÍTÓ Antigén hígító az R5a reagenshez. Proclin TM 300 tartalmú (0,5%) víz. 1. SZ. KONJUGÁTUM Kapszid HCV antigén ellen egérben termeltetett, biotinilált monoklonális antitestek. Lila színnel jelölve. Tartósítószer: < 0,1% nátrium-azid; 0,025% Cosmocil 2. SZ. KONJUGÁTUM Humán IgG/peroxidáz ellen egérben termeltetett antitest és streptavidin/peroxidáz. Zöld színnel jelölve. Tartósítószer: 0,5% Proclin TM 300 PEROXIDÁZ SZUBSZTRÁT PUFFER Citromsav és nátrium-acetát oldata, ph 4,0; 0,015% hidrogén-peroxidot és 4% DMSO-t tartalmaz KROMOGÉN Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat. LEÁLLÍTÓ OLDAT 1 N kénsav-oldat. KISZERELÉS 1 lemez 5 lemez 1 db 5 db 70 ml 1 ml 1,5 ml 1ml qsp 1ml 15 ml 15 ml 60 ml 5 ml 28 ml 2 fiola 235 ml 1 ml 3 ml 1 ml qsp 1 ml 2 fiola 2 x 30 ml 2 fiola 2 x 30 ml 2 fiola 2 x 60 ml 2 fiola 2 x 5 ml 3 fiola 3x28 ml 4

4 - SZÜKSÉGES, DE NEM MELLÉKELT ESZKÖZÖK ÉS ANYAGOK desztillált vagy teljesen ioncserélt víz nátrium-hipoklorit (háztartási hypo) és nátrium-bikarbonát (szódabikarbóna) szűrőpapír egyszerhasználatos gumikesztyűk védőszemüveg eldobható kémcsövek automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl és 1 ml térfogat bemérésére 10 ml-es, 200 ml-es és 1000 ml-es kapacitással rendelkező osztott mérőhengerek vortex típusú keverő automata*, félautomata* vagy manuális mikrolemez-mosó rendszer termosztatikusan 37 ± 1 C-ra beállított vízfürdő vagy száraz inkubátor* szennyezett maradványokat befogadó hulladékgyűjtő mikro-tesztlemez leolvasó 490, 620, 450/620-tól 700 nm-ig szűrőkkel felszerelve (*) A Technikai Osztályunk által támogatott felszereléseket illetően helyi képviselőnk szívesen ad felvilágosítást. 5 - EGÉSZSÉGÜGYI ÉS MUNKAVÉDELMI ELŐÍRÁSOK A teszkitben található összes reagens kizárólag in vitro diagnosztikai, professzionális célra használható. Ezt a tesztet kizárólag laboratóriumi szakképzésben részesült személyzet használhatja, aki tisztában van a potenciális veszélyekkel. Viseljen megfelelő védőruházatot, amely laboratóriumi köpenyből, szem/arcvédő maszkból és egyszer használatos védıkesztyűből (szintetikus, nem-latex kesztyű ajánlott) áll, valamint a Good Laboratory Practise Megfelelő Laboratóriumi Gyakorlat szerint kezeli a reagenseket és a páciens mintákat. A teszt elvégzése után alaposan mosson kezet. Ne pipettázzunk szájjal. Az R4 jelű pozitív kontroll fotokémiai úton inaktivált formában van. A pozitív kontroll (R4) készítéséhez használt humán eredetű anyagok ellenőrzésük során nem mutattak reaktivitást a hepatitis B vírus felszíni antigénjével és a humán immundeficiencia vírusok ellen termelt antitestekkel (HIV-1 és HIV-2 Ab). Mivel az ismert tesztmódszerek nem zárhatják ki teljes biztonsággal a fertőző ágensek jelenlétét, kezeljük a reagenseket és betegmintákat úgy, mintha képesek lennének fertőző betegségek átadására. A mintákkal és humán eredetű reagensekkel közvetlenül érintkező eszközöket és anyagokat, valamint a mosóoldatokat fertőzőnek kell tekinteni, és ennek megfelelően kell kezelni. Kerüljük el a minták vagy a mintákat tartalmazó oldatok kiömlését. A kiömléseket 10%-ra hígított háztartási hypoval kell feltörölni. Ha a szennyező folyadék sav, akkor a kiömlést először szódabikarbónával semlegesíteni kell, majd a hypoval történt tisztítást követően szűrőpapírral fel kell itatni. A tisztításhoz használt anyagokat szennyezett maradványokat gyűjtő tartályban kell elhelyezni. A mintákat, humán eredetű reagenseket, valamint a szennyezett anyagokat és termékeket a végső elhelyezés előtt fertőtleníteni kell az alábbi módszerek valamelyikével: 5

- 5% nátrium-hipoklorit végső koncentrációjú (1 térfogat hypot számítva 10 térfogat szennyezett folyadékra vagy vízre) hypoba merítéssel 30 percen át vagy - legalább két órán át 121 C-on történő autoklávozással. FIGYELMEZTETÉS: Ne helyezzünk nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatot az autoklávba! Kerüljük el a szubsztrát puffer, a kromogén és a leállító oldat bőrrel vagy nyálkahártyával történő érintkezését. Az anyagok biztonsági adatlapjai kérés esetén hozzáférhetőek cégünknél. Ne feledkezzünk meg az oldatok, mosási hulladékok vagy bármilyen, biológiai mintát tartalmazó folyadék neutralizálásáról és/vagy autoklávozásáról a lefolyóba kiöntés előtt! A tesztkit több komponense nátrium-azidot tartalmaz. Ez a vegyület a rézből vagy ólomből készült vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, mely igen robbanásveszélyes fém-azidok képződésével jár. Az ily módon keletkező azidok felhalmozódásának elkerülésére, amennyiben ezen reagenseket a lefolyóba távolítjuk el, semlegesítsük a reagenseket és bő vízzel öblítsük át a mosdókagylót. Néhány reagens 0,04%, 0,1%, ill. 0,5% ProClin 300-at tartalmaz. IRRITÁLÓ ANYAG R 43: Bőrrel érintkezésbe lépve irritációt okoz. S 28/37: Bőrrel érintkezés esetén az érintett területet azonnal nagy mennyiségű vízzel és szappannal kell mosni Használjunk megfelelő védőkesztyűt. Az anyag Munkavédelmi Adatlapja kérésre cégünknél hozzáférhető. 6 - ELŐVIGYÁZATOSSÁGI INTÉZKEDÉSEK Az eredmények minősége függ az alábbi jó laboratóriumi gyakorlat követésétől: Minden mikrotiter lemez keretén fel van tüntetve a teszt neve, valamint egyedi azonosítószáma. Ugyanez az azonosítószám megtalálható minden egyes tesztcsíkon is. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA: egyedi azonosítószám = 55 Használat előtt ellenőrizzük az egyedi azonosítószámot. Amennyiben az azonosítószám hiányzik, vagy az a fentitől eltérő, a tesztcsíkot nem szabad felhasználni. Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Ne keverjünk különböző gyártási sorozatokból származó reagenseket egy adott futtatáson belül. Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB 11x, bíbor színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. A mosóoldat (R2, címke felirata: 20x, zöld színű) készítésekor továbbá felhasználhatunk különböző Bio-Rad reagenskészleteból származó mosófolyadékokat (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), ha azokat megfelelően hígítjuk és egy vizsgálatsorozaton belül azonos keveréket használunk. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. 6

Használat előtt várjunk 30 percet arra, hogy a reagensek elérjék a szobahőmérsékletet. A reagensek rekonstitúcióját óvatosan, szennyezésmentesen végezzük. Ne végezzük el a tesztet a konjugált enzimaktivitását potenciálisan megváltoztatni képes reaktív (savas, alkáli vagy aldehid) gőzök vagy por jelenlétében. Használjunk alaposan elmosott és ioncserélt vízzel jól átöblített üvegedényeket vagy lehetőség szerint egyszerhasználatos eszközöket. Ne hagyjuk a tesztlemezt kiszáradni a mosási művelet vége és a reagensek bemérés között. Az enzimreakció igen érzékeny bármilyen fémre vagy fémionra. Következésképpen, a konjugáltat vagy a szubsztrátot tartalmazó különféle oldatoknak nem szabad fémes elemekkel érintkezniük. A színelőhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) rózsaszínűnek kell lennie. A rózsaszín árnyalatnak a rekonstitúciót követő néhány percen belüli megváltozása azt jelzi, hogy a reagens nem használható és azt ki kell cserélni. A színelőhívó oldatot olyan eldobható egyszerhasználatos műanyag tálcán vagy üvegedényben kell elkészíteni, melyet először 1N sósavval előre elmostunk és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. Ezt a reagenst fénytől elzárva kell tárolni. Minden mintához használjunk új pipettahegyet. A tesztlyukak mosása kritikus lépés ezen eljárásban, ezért tartsuk be a mosási ciklusok ajánlott számát és bizonyosodjunk meg arról, hogy minden tesztlyukat teljesen feltöltöttünk illetve később teljesen kiürítettünk. A helytelen mosás pontatlan eredményekhez vezethet. Soha ne használjuk ugyanazt az edényt a konjugált, illetve az előhívó oldat bemérésére. 7 - A HASZNÁLHATÓ MINTÁK A vérmintát a szokásos gyakorlatnak megfelelően vegyük le. A teszt EDTA, heparin vagy citrát-alapú antikoagulánsokkal gyűjtött, hígítatlan szérum vagy plazma mintákon végezhető el. A hemolízis elkerülése érdekében minél hamarabb különítsük el a szérumot vagy plazmát a véralvadéktól vagy vörös vértestektől. A részecskéket tartalmazó mintákat centrifugálással tisztítani kell a tesztelés előtt. A szuszpendált fibrin-aggregátumok vagy részecskék hamis pozitív eredményekhez vezethetnek. A mintákat +2 és 8 C között lehet tárolni, amennyiben a szűrést hét napon belül elvégezzük, ellenkező esetben a minták -20 C-on mélyfagyasztva tarthatók. Kerüljük el az ismételt lefagyasztást és felolvasztást. Ha a mintákat szállítani kell, a csomagolást az etiológiai ágensek szállítására vonatkozó hatályos szabályok alapján kell végezni, lehetőség szerint fagyasztva szállítással. NE HASZNÁLJUNK SZENNYEZETT, HIPERLIPÉMIÁS VAGY HIPERHEMOLIZÁLT SZÉRUMOT! MEGJEGYZÉS: Az eredményeket nem befolyásolja, ha a minták 90 g/l-nél kevesebb albumint, 50 µg/l-nél kevesebb biotint vagy 100 mg/l-nél kevesebb bilirubint tartalmaznak, illetve ha a lipémiás minták 36 g/l-nél kevesebb triglicerid ekvivalenst vagy a hemolizált minták 87 g/l-nél kevesebb hemoglobint tartalmaznak. A negatív mintákat, a HCV antitestre pozitív és a HCV antigénre pozitív mintákat 56 ºC-on 30 percen át végzett hőkezelést és három fagyasztási/felolvasztási 7

ciklust megelőzően és azt követően teszteltük. A HCV Ab kimutatását egyik kezelés sem befolyásolta. Ezzel ellentétben azonban a hőkezelés szignifikánsan csökkentette a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálatban mért abszorbanciát az antigén kimutatása esetén. 8 - A REAGENSEK REKONSTITÚCIÓJA - ÉRVÉNYESSÉG - TÁROLÁS A Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat tesztkit reagenseinek használat előtt el kell érniük a szobahőmérsékletet. 1) Használatra kész reagensek Tesztlemez (R1) Minden keret 12 tesztcsíkot tartalmaz, és visszazárható tasakba van csomagolva. Ollóval vagy szikével nyissuk fel a csomagolást 0.5-1 cm-rel a visszazárható csík fölött. Nyissuk ki a tasakot és vegyük ki a lemezt. A fel nem használt tesztcsíkokat tegyük vissza a tasakba. Gondosan zárjuk vissza a tasakot, és helyezzük +2-8 C-os hőmérsékletű helyre. 1. sz. konjugátum (R6): használatra kész formában van. Használat előtt felfordítással keverjük össze. 2. sz. konjugátum (R7): használatra kész formában van. Használat előtt felfordítással keverjük össze. 2) Rekonstituálandó reagensek R2 reagens: mosófolyadék (20x töménységű) 1:20 arányban hígítsuk desztillált vízzel, a felhasználásra kész oldat előállításához. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t készítsünk. Hígított szubsztrát munkaoldat (R8 + R9) Hígítsuk az R9 jelű reagenst 1:11 arányban az R8 jelű reagenssel (példa: 1 ml R9-es reagens 10 ml Rb-as reagensben). 10 ml elegendő 1-től 12-ig terjedő számú tesztcsíkra. Keverjük össze. Antigén pozitív kontroll munkaoldat (R5a + R5b) Öntsük az R5b hígító tartalmát a liofilizált Ag R5 reagenst tartalmazó fiolába. Zárjuk vissza a fiolát és hagyjuk állni 10 percig, eközben gyengén rázogassuk és néhányszor fordítsuk fejjel lefelé az oldódás elősegítésére. 3) Szavatosság A tesztkitet +2 és 8 ºC között kell tárolni. A kitet +2-8 C között kell tárolni. Ezen a hőmérsékleten a készletben található minden reagens felhasználható a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig a felnyitás után is, kivéve a speciális eseteket: R1: A visszazárható tasak felbontása után a tesztcsíkok a tasakban, gondosan visszazárva, +2-8 C -on tárolva 1 hónapig felhasználhatók. R2: A kihígított mosóoldat +2-30 C 2 hétig felhasználható. A koncentrált mosóoldat +2-30 C-on tárolható. R5a + R5b: az pozitív antigén kontroll munkaoldata +2-8 C-on 1 hónapig, -20 Con 2 hónapig felhasználható (legfeljebb 5 alkalommal felolvasztva). 8

R8 + R9: feloldás után a reagens szobahőmérsékleten, sötétben tárolva 6 órán át felhasználható. 9 A VIZSGÁLAT MENETE Szigorúan kövessük a protokollt. Minden tesztben használjunk negatív és pozitív kontrollokat a teszt minőségének és érvényességének megállapítása céljából. Alkalmazzuk a jó laboratóriumi gyakorlat alapelveket. Módszerek 1) Alaposan dolgozzuk ki a minták beosztásának és azonosításának tervét. 2) Készítsük el a hígított mosóoldatot (hígított R2) és az antigén pozitív kontroll munkaoldatot (R5a + R5b). 3) Vegyük elő a tesztlemez-keretet és a tesztcsíkokat (R1) a védőcsomagolásból. 4) Egymás után, a tesztlemez előzetes mosása nélkül közvetlenül mérjük be a következőket: 4.1. 100 µl 1. sz. konjugált (R6) minden tesztlyukba. 4.2. 50 µl negatív kontroll szérum (R3) az A1 jelű tesztlyukba, 50 µl antitest pozitív kontroll szérum (R4) a B1, C1, D1 jelű tesztlyukakba, 50 µl antigén pozitív kontroll munkaoldat (R5a + R5b) az E1 jelű tesztlyukba, 50 µl az első vizsgálandó mintából az F1 jelű tesztlyukba, 50 µl a második mintából a G1 jelű tesztlyukba stb. Az alkalmazott készüléktől függően a kontrollok helye és a bemérések sorrendje megváltoztatható. Keverjük össze a reakcióelegyet (minimum háromszori aspirációval vagy tesztlemez-rázóval 5 másodpercig). Ha a minták bemérése 10 percnél hosszabb időt vesz igénybe, ajánljuk, hogy a negatív és pozitív kontrollok hozzáadása a minták bemérése után történjen. MEGJ.: A minták bemérése után a mintát (vagy kontrollt) tartalmazó tesztlyuk színe liláról kékre változik. Ekkor lehetségessé válik a minták és az 1. sz. konjugált jelenlétének kimutatása 620 nm-en történő spektrofotometriás leolvasással (ld. még a 12. szakaszt: A MINTA ÉS A REAGENS PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA). 5) Amennyiben lehetséges, borítsuk be a tesztlyukakat öntapadó filmmel oly módon, hogy az egész felületen nyomást alkalmazunk a szoros záródás érdekében. 6) Inkubáljuk a tesztlemezt termosztáttal vezérelt vízfürdőn vagy száraz tesztlemez-inkubátorban 37 ºC ± 1 ºC-on 90 ± 5 percig. 7) Távolítsuk el az öntapadó filmet. Távolítsuk el minden tesztlyuk tartalmát folyékonyhulladék-tartályba történő leszívással és mérjünk be minimum 0.370 ml mosóoldatot minden tesztlyukba. Aspiráljuk ismét. Ismételjük meg a mosási lépést négyszer (azaz összesen 5 mosást végzünk). A maradék térfogatnak 10 µl-nél kevesebbnek kell lennie (ha szükséges, szárítsuk le a tesztlemezt szűrőpapíron fejjel lefelé történő fordítással). 8) Gyors ütemben mérjünk be 100 µl-t a 2. sz. konjugáltból (R7) minden tesztlyukba. A konjugáltat használat előtt gyengén fel kell rázni. Ha 9

lehetséges, borítsuk be egy új öntapadó filmmel és inkubáljuk 37 ºC ± 1 ºC-on 30 ± 5 percig. MEGJ.: A konjugált színe zöld. A konjugált jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő spektrofotometriás leolvasással lehet igazolni (ld. még a 12. szakaszt: A MINTA ÉS A REAGENS BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA). 9) Távolítsuk el az öntapadó filmet, aspirációval ürítsünk ki minden tesztlyukat és mossuk 5 alkalommal a fentebb ismertetett módon. 10) Készítsük el az enzimes előhívó oldatot (ld. 8. fejezet, reagens (R8 + R9)). 11) Gyors ütemben mérjünk be minden tesztlyukba 80 µl-t az előbbi lépésben frissen elkészített előhívó oldatból (R8 + R9). Hagyjuk az előhívási reakciót lezajlani sötétben, szobahőmérsékleten (18-30 ºC) 30 ± 5 percen át. Ne használjunk öntapadó filmet ezen inkubálás alatt. MEGJ.: A rózsaszín színű előhívó oldat bemérését a vizsgálat ezen lépésében vizuálisan ellenőrizhetjük: jól látható színezetbeli különbség van az üres és a rózsaszínű szubsztrátoldatot tartalmazó tesztlyukak között (ld. még a 12. szakaszt: A MINTA ÉS A REAGENS PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA). 12) A szubsztrátoldat-bemérés sorrendjének és sebességének megfelelő ütemezésben adjunk 100 µl leállító oldatot (R10) a tesztlyukakba. Keverjük össze a reakcióelegyet. MEGJ.: A színtelen leállító oldat bemérését a vizsgálat ezen lépésében vizuálisan ellenőrizhetjük. A leállító oldat hozzáadását követően a szubsztrát rózsaszín színezete eltűnik (a negatív minták esetén) vagy kékről sárgára változik (a pozitív minták esetén). jól látható színezetbeli különbség van az üres és a rózsaszínű szubsztrátoldatot tartalmazó tesztlyukak között (ld. még a 12. szakaszt: A MINTA ÉS A REAGENS PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA). 13) Óvatosan töröljük le a tesztlemez alját. Olvassuk le az optikai denzitást 450/620-700 nm-en lemezleolvasóval legalább 4 perccel a leállító oldat hozzáadását követően és a reakció leállítását követő 30 percen belül. 14) Az eredmények rögzítése előtt ellenőrizzük a megfelelést a leolvasás és a tesztlemez illetve a mintabemérési és azonosítási terv között. 10 A RENDSZER ADAPTÁCIÓJA MOSÁS: A teszt működési teljesítményének maximalizálása érdekében gondosan kövessük a fentebb ismertetett mosási eljárásokat. Egyes eszközök esetén azonban lehetséges, hogy szükségessé válik a mosási lépések számának növelése az elfogadható negatív háttér elérése érdekében. 11 - AZ EREDMÉNYEK SZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE A HCV elleni antitestek és/vagy a HCV kapszid antigén jelenlétének vagy hiányának meghatározása minden minta esetén a mért abszorbancia érték és a számított cut-off-érték összehasonlításával történik. 1. A pozitív kontroll szérum esetén mért abszorbancia-értékek (OD R4) átlagának kiszámítása Példa: R4 jelű pozitív kontroll Minta Optikai denzitás B1 1,636 C1 1,704 10

D1 1,650 Összesen: 4,990 Optikai denzitások összege 4,990 Átlag OD R4 = = = 1,663 3 3 2. A cut-off-érték (CO) kiszámítása Átlag OD R4 CO = 4 Példa: Átlag OD R4 = 1,663 1,663 CO = = 0,415 4 3. A teszt érvényességének kritériumai a következők: a) Az R3 jelű negatív kontroll esetén: a mért abszorbancia-értéknek kisebbnek kell lennie, mint a cut-off OD értéke x 0,6 b) Az R4 jelű antitest pozitív kontroll esetén: Az átlagos mért abszorbancia-értéknek egyenlőnek vagy nagyobbnak kell lennie 0,800-nál, és egyenlőnek vagy kisebbnek kell lennie 2,400-nél. Ha az R4 jelű antitest pozitív kontrollok valamelyik egyedi értéke az átlagos értéktől 30%-nál nagyobb mértékben különbözik, az értéket figyelmen kívül kell hagyni és a számítást a maradék két kontroll-érték használatával kell újból elvégezni. c) Az (R5a + R5b) jelű antigén pozitív kontroll munkaoldat esetén: A mért abszorbancia-értéknek 0,500-nél nagyobbnak kell lennie. A tesztet érvénytelennek kell tekinteni akkor, ha az R3 jelű negatív kontroll, az (R5a + R5b) jelű antigén pozitív kontroll munkaoldat és/vagy egynél több R4 jelű pozitív kontroll a fenti értéktartományokon kívül esik. 4. Az eredmények értelmezése A cut-off-értéknél kisebb optikai denzitással rendelkező mintákat negatívnak tekintjük a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA tesztvizsgálattal. A cut-off-értéket megközelítő eredményeket (cut-off OD 10% < minta OD < cutoff OD) azonban óvatosan kell értelmezni (amennyiben a készülék és a laboratóriumi eljárásrend ezt lehetővé teszi, javasolt az ilyen mintákat két párhuzamos tesztben újravizsgálni). A cut-off-értékkel egyenlő vagy azt meghaladó optikai denzitással rendelkező mintákat kezdetben pozitívként kell tekinteni és két párhuzamos tesztben újra kell vizsgálni a végleges értelmezéshez. Az ismételt teszteket követően egy mintát akkor tekintünk a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA tesztvizsgálattal pozitívnak, ha a második vagy a harmadik mérés is pozitív, azaz a cut-off-értékkel egyenlő vagy annál magasabb értéket kapunk. A mintát negatívnak tekintjük akkor, ha mindkét érték kisebb, mint a cut-off-érték. 11

12 - A MINTA ÉS A REAGENS BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA (OPCIONÁLIS) AZ ELSŐ LÉPÉS IGAZOLÁSA: AZ 1. SZ. KONJUGÁLT (R6) ÉS A MINTA JELENLÉTE Az 1. sz. konjugált (R6) és a minta jelenlétét a tesztlyukban 620 nm-en történő leolvasással lehet igazolni. A mintát és az 1. sz. konjugáltat (R6) tartalmazó minták OD értékének 0,800-nál nagyobbnak kell lennie. MEGJEGYZÉS: a minta hozzáadását követően az 1. sz. konjugált (R6) liláról kékre változik. A MÁSODIK LÉPÉS IGAZOLÁSA: A 2. SZ. KONJUGÁLT (R7) ÉS A MINTA JELENLÉTE A 2. sz. konjugált (R7) zöld színű. A 2. sz. konjugált (R7) jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük: minden tesztlyuk OD értékének 0,300-nál nagyobbnak kell lennie (ennél a normánál alacsonyabb érték a konjugált elégtelen bemérését jelzi). AZ ELŐHÍVÓ OLDAT PIPETTÁZÁSÁNAK IGAZOLÁSA A rózsaszín színű előhívó oldat jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással lehet igazolni: az előhívó oldatot tartalmazó tesztlyuk esetén az optikai denzitásnak 0,100-nél magasabbnak kell lennie (az ennél alacsonyabb OD érték az előhívó oldat elégtelen bemérését jelzi). Az elkészített szubsztrát kromogén oldat hozzáadását követően látványos színváltozás, az üres tesztlyukakban színtelenből rózsaszínűre változás történik. 13 - A TESZT MŰKÖDÉSI TELJESÍTMÉNYE A - SPECIFICITÁSI VIZSGÁLATOK Váradóktól és betegektől származó mintákat teszteltünk a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal valamint egy jelenleg használatos vizsgálattal különböző helyeken végzett rutintesztelésben a vizsgálat specificitásának megállapítása céljából. Specificitás véradók esetén A vizsgálatokat három különböző helyszínen végeztük. A tesztelt szérumminták nyilvántartott véradóktól vagy új donoroktól származtak. Helyszín Tesztelt minták száma Ismételten reaktív minták száma Rungis, B.B., Franciaország Bordeaux, B.B., Franciaország Véradók Montpellier-ből, Franciaország Összes 2410 2503 2248 7161 5 3 4 12 A 7161 véradó-mintából 12 bizonyult reaktívnak a használati utasítás szerint végzett Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal, míg a HCV PCR vagy HCV PLUS Deciscan immunblot-teszttel egyik minta HCV-pozitivitása sem került megerősítésre. A véradók esetén a specificitás 99,83% volt (95%-os konfidencia-intervallum: 99,71% - 99,91%). Specificitás kórházi betegek esetén Két helyszínen összesen 469 kórházi betegtől levett prospektív szérumot vizsgáltunk. A rutin HCV Ab EU- regisztrált vizsgálattal és a Monolisa HCV Ag - 12

Ab ULTRA vizsgálattal 440 minta bizonyult negatívnak. A rutinvizsgálattal és a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal 22 minta volt pozitív, melyből 21 megerősített pozitív, míg egy lehetséges pozitív volt a Deciscan vizsgálat alapján. Hét minta esetén a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat, a HCV PLUS Deciscan Immunblot vizsgálat és a HCV PCR vizsgálat ellentétes eredményeket adott. Ezen hét minta esetén az eredmények a következők voltak: A rutinvizsgálatban pozitívnak (de a HCV PCR vizsgálatban és a HCV PLUS Deciscan immunblot vizsgálatban negatívnak) bizonyult két minta a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal szintén negatívnak mutatkozott, azaz a rutinvizsgálat hamis pozitív eredményt adott. Két minta esetén nem lehetett következtetéseket levonni, mert a HCV PCR eredménye nem volt értelmezhető. Ezeket a mintákat a további számításokból kizártuk. Egy minta a rutinvizsgálattal pozitívnak, a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal negatívnak, a HCV PLUS Deciscan immunblot vizsgálattal határozatlannak és a PCR vizsgálattal negatívnak bizonyult. Mindössze két, a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal pozitívnak (1,7 alatti alacsony aránnyal) mutatkozó minta és a rutin HCV Ab vizsgálattal pozitívnak mutatkozó minta volt negatív a HCV PCR vizsgálattal és határozatlan a HCV Deciscan immunblot vizsgálattal (NS4 gyenge pozitív sáv). Ezen vizsgálat alapján, ha a két utóbbi mintát hamis pozitívnak tekintjük, a specificitás 99,5% (443/445) volt. A specificitás 100%-os, ha a két utóbbi mintát valós pozitívnak tekintjük, mely az esetleges előző fertőzést követően visszamaradt antitestek jelenlétének tulajdonítható (immunblottal határozatlan adatokat kaptunk). Specificitás a tesztet potenciálisan zavaró minták esetén Az immunvizsgálatokon alapuló tesztelésben valószínűleg keresztreakciókat indukáló 429 további mintát tanulmányoztunk, melyek származása a következő volt: különböző fertőző betegségekben szenvedő betegek, pl. hepatitis B és A, rubeola, toxoplasmózis, mumpsz, kanyaró, CMV, HSV, EBV, VZV, HTLV I, HIV, Chagas-szindróma, flavivírus, influenza elen beoltott betegek rheumatoid tényezőre pozitív betegek, auto-immun betegségekben szenvedő betegek, pl. SLE, myloma, HAMA- és ANA-pozitív minták terhes nők, cirrhotikus, krónikus veseelégtelenségben (CRF) szenvedők és dialízisben részesülő betegek. Ezen 429 minta közül egy bizonyult reaktívnak a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal és HCV pozitívnak a HCV Ab EC-elismert vizsgálattal. Ezen trükkös minták esetén a továbbiakban végzett vizsgálati specificitás 100%- ot ért el. B ÉRZÉKENYSÉGI VIZSGÁLAT A vizsgálat érzékenységét kereskedelemben forgalmazott szerokonverziós panelekből, cégünktől vagy szakgyűjteményekből származó HCV pozitív minták nagy terjedelmű sorozatának tesztelésével mértük fel. A következőkben az ennek során felgyűlt eredményeket összegezzük: 13

Szenzitivitás verifikált HCV pozitív minták esetén E vizsgálatban összesen 646 HCV-pozitív, többnyire krónikusan fertőzött (anti HCV antitestek jelenlétével jellemezhető) betegektől származó mintát teszteltünk, melyből 405 esetén a HCV genotípus is ismert volt. E minták mindegyike erősen reaktív volt a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal, mely így100%-os szenzitivitást mutatott. 25 további frissen fertőzött, pozitív minta (1 napon belül a vérvételt követően) lett tesztelve és pozitívnak találtuk. Szenzitivitás az ismert genotípusú HCV-pozitív minták esetén Összesen 405 ismert genotípusú minta került tesztelésre: 133 genotipizált minta különböző eredetű, míg 272 minta kórházi laboratóriumokból származott. A tesztelt genotípusok további megoszlása a következő volt: E minták midegyike pozitívnak bizonyult, azaz a szenzitivitás 100% volt. Szenzitivitás akut fertőzött betegek esetén Az érzékenységet a HCV fertőzés akut fázisából (a fertőzés kezdeti szakaszából) származó mintákon értékeltük. Összesen 53 szerokonverziós panelt mely 421 mintának felelt meg teszteltünk a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálattal, összehasonlítva azt egy EU-ban regisztrált, anti-hcv antitest-kimutatásra szolgáló tesztkittel. A Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat gyakorlatilag minden panelen korábban mutatta ki a fertőzöttséget: a másik vizsgált anti-hcv antitest kimutatásra szolgáló tesztkithez (anti-hcv tesztkit) képest 119 további mintánál mutatott ki fertőzöttséget. 53 szerokonverziós panel (421 minta) anti-hcv tesztkit Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA A pozitív minták száma 152 271 Ezen 53 szerokonverziós panelből 11 nem-virémiás mintával kezdődik, mely lehetővé teszi az anti-hcv ellenanyagok nélküli szerológiai ablak-fázis pontosabb becslését is. Panel A pozitív eredmény kimutatásáig szükséges idő az első vérvételtől számítva (napokban) HCV RNA** Genotípus 1a 1b 1c 1d 1a/b 2 2a 2b 2c 2i 2a/c 3 3a 3b Szám 53 83 2 3 3 31 7 18 4 1 17 25 77 1 Ösz- Genotípus 2a/2 2a/c 1b, 1a/b 3a/b 4 4a 4c 4d 4h 4k 4f 4c/d 5a 6a 6d sze- sen Szám 2 10 21 6 5 2 2 3 1 24 1 1 1 1 405 Genotípus anti- HCV tesztkit Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA Az anti-hcv tesztkit és a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA közötti különbség (napokban) BCP-6211 1a 140 186 140 46 BCP-6213 1a 11 43 30 13 BCP-6222 1a 17 40 17 23 14

BCP-6225 1a 45 78 45 33 BCP-6227 1a 42 74 46 28 BCP-9041 1a 24 62 24 38 BBI-PHV919 1a 25 28 28 0 BCP-9054 3a 52 60 52 8 BCP-9055 NG* 31 68 33 35 BCP-6216 NG* 23 23 23 0 NABI-SC90 NG* 10 52 10 42 Átlag napokban 38,2 64,9 40,7 24,2 * Nem genotipizált. ** Az RNS-teszt eredményei a panel forgalmazója által megadott eredmények. Ezen 11 panel esetén a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat a HCV fertőzést átlagosan 24 nappal korábban mutatja ki, mint az anti-hcv tesztkit. Ez az előny lényegében annak tulajdonítható, hogy a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat a kapszid antigén kimutatását használja. 15

Antigén szenzitivitás További tesztekben a HCV antigén kimutatási érzékenysége főként valamelyik szerokonverziós panel, például a BBI 918 jelű panel tesztelésével került értékelésre. A következő grafikon a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA vizsgálat érzékenységét hasonlítja össze egy kompetitor cég HCV Ab EIA vizsgálatával. BBI PHV 917 sz. HCV szerokonverziós panel Minta OD / cut-off arány Vérvétel dátuma (napok) Az ismételhetőség vizsgálata A vizsgálaton belüli és vizsgálatok közötti ismételhetőség tanulmányozását hét minta használatával végeztük, melyek közül egy nem-reaktív, három HCV Ab reaktív és három antigén-reaktív volt. A vizsgálaton belüli ismételhetőség esetén a mintákat 30 alkalommal teszteltük ugyanabban a vizsgálatban. A vizsgálatok között ismételhetőség esetén a mintákat két technikus tesztelte 20 napon át (az NCCLS EP5 eljárás menetét követve). Az átlagok aránya, a szórások és a variációs koefficiensek kerültek kiszámításra és alább vannak feltüntetve: 1. táblázat. A vizsgálaton belüli ismételhetőség. Minták Átlagok SD CV% aránya Negatív 0,14 0,01 6,10 HCV Ab alacsony 1,12 0,04 3,65 pozitív HCV Ab közepes 2,39 0,08 3,39 pozitív HCV Ab magas pozitív 4,88 0,18 3,70 Ag alacsony pozitív 1,14 0,03 3,04 Ag közepes pozitív 1,97 0,06 3,02 Ag magas pozitív 5,86 0,14 2,38 A hat pozitív mintával kapott CV értékek 10% alatt vannak. 16

2. táblázat. A vizsgálatok közütti ismételhetőség. Minták Átlagok SD CV% aránya Negatív 0,16 0,02 12,4 HCV Ab gyengén pozitív 1,20 0,08 6,65 HCV Ab közepesen 2,39 0,13 5,38 pozitív HCV Ab erősen pozitív 4,77 0,17 3,58 Ag gyengén pozitív 1,13 0,09 7,97 Ag közepesen pozitív 2,00 0,15 7,73 Ag erősen pozitív 5,99 0,37 6,20 A hat pozitív mintával kapott CV értékek 15% alatt vannak. 14 - A TESZT KORLÁTAI A hepatitis C vírussal fertőzött betegek által mutatott immunológiai reakciók változatosságából adódóan (különösen szerokonverziók idején) a tesztek között a kimutatásban kisebb különbségek lehetnek a használt antigén-fehérjék fajtájától függően. Egy szűrőteszttel kapott negatív eredmény nem zárja ki a hepatitis C vírusnak való kitettség vagy az általa történt fertőzöttség lehetőségét. Minden ELISA eljárás közös hibája, hogy hamis pozitív reakciókat mutathatnak. Minden ismételten pozitívként mutatkozó minta esetén ezért javasolt a reakció specificitásának igazolása a Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA tesztkitben megadott értelmezési kritériumok alapján, a megfelelő módszer alkalmazásával, pl. a HCV ellen termelt antitestek jelenlétének bizonyításával ELISA anti-hcv antitest szűrőteszt használatával vagy immunblottoláson alapuló anti-hcv antitest-kimutatási teszt használatával. Ha szükséges, alkalmazzunk HCV vírusgenom-kimutatási tesztet vagy specifikus, neutralizációs vizsgálattal kombinált HCV antigén tesztet. A minták, konjugáltak és előhívó oldat bemérésének igazolására szolgáló kolorimetriás módszer nem teszi lehetővé a bemért térfogatok pontosságának igazolását. E módszer csupán a minta, a konjugált és az előhívó oldat tesztlyukakban jelenlétét mutatja. Ezzel az eljárással a hibás válaszok aránya szorosan összefügg az alkalmazott rendszer pontosságától (a bemérés és leolvasás 10%-nál magasabb kumulatív variációs koefficiense lényeges mértékben csökkenti az igazolás minőségét). 15 - IRODALOMJEGYZÉK Busch MP, Kleinman SH. Committee report: nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40: 143-159. Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289: 959-962. Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36: 211-218. Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729. 17

18 Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay: Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3): 61-62. Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez- Montreuil M, Levayer T, Zappitelli JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43: 958-962. Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1045. Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of Medical Virology. 1998, 55: 1-6. Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36: 565-573. Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusion-transmitted viral infections in France between 1992 and 2000. Transfusion. 2002, 42: 980-988. Simmonds P. HCV heterogeneity: the science and the practice. In Hepatitis C. 1998. Yanamouchi Europe BV Ed. p 3-10. Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: 1147-1171. Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003, 52: RR-3. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology. 1999, 30: 956-961. NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C: 2002. NIH Consensus and State-of-the-Science Statements. 2002, 19 N 3. 46p.

- CE jelzés (Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről) - Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra! - Katalógusszám - Gyártó - Meghatalmazott Képviselet - Gyártási szám - Szavatossági idő - Tárolási hőmérsékleti határok - Lásd a használati utasítást 19