NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.
HPLC FELÉPÍTÉSE
Horváth Csaba 1930-2004 Ő építette meg az első nagynyomású folyadékkromatográfot. Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesztésében és elterjesztésében, a HPLC atyjának mégis egyértelműen Horváth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t megalapozó elméleti közleményére csaknem ezer citálást kapott, ez az elválasztástudomány legtöbbször idézett munkája.
OLDÓSZEREK Üveg, vagy műanyag edények. Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O 2 eltávolítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. Gázmentesítés megvalósítása: - melegítés; - vákuum alkalmazása; - ultrahangos szonikálás (rázatás); - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). Szűrés üvegszűrő + vákuum alkalmazása.
SZIVATTYÚK Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás Mechanikus szivattyúk állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). Pulzáláscsillapító
1, tekercs - flexibilis Pulzáláscsillapító 2, membrán hexánnal töltve 1 2
Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm-es saválló acél). Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak kis holttérfogat (keverőedény effektus).
GRADIENSKÉPZŐ 1. Izokratikus elúció változatlan összetételű mozgófázis 2. Gradiens elúció az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrásszerű változtatása. Alacsony nyomású keverő pumpa előtti keverés Nagy nyomású keverő pumpa utáni keverés
Mintainjektáló rendszer Injektált mennyiség (analitikai): 5-100 μl Fajtái: 1. Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). 2. Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).
Kézi injektálás
Automata mintaadagoló
Loop méret alapján Mikro: 0,06 µl - 0,500 µl Analitikai: 1,0 µl - 500,0 µl (5-100 µl) Preparatív: 100 µl - 10 ml
OSZLOP Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. 2 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m 2 /g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmérőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens).
Holt térfogat (Extra-column volume) Csúcsszélesedést okoz (injektor után). Keverőedény effektus. Male nut Holt térfogat Tube Tökéletes illeszkedés Rossz csatlakozás 18
van Deemter görbék különböző szemcseméretű állófázisok esetén Áramlási sebesség ml/min
NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. 1.Szilikagél 2.Aluminium-oxid 3.Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez 500-1000-red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése.
Módosított szilikagél Szabad szilanol csoport (gyenge sav) Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH 2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.
Módosított szilikagél
Mozgófázis Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófázist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása d p Δp = LFηφ (μm) ᴨr 2 d 2 p L = oszlop hossza F = térfogati áramlási sebesség η = viszkozitás φ = az oszlop porozitására jellemző tag r = oszlop sugara; d p = átlagos szemcseméret t R (min) N P (bar) 5 30 25,000 19 3 18 42,000 87 1.5 9 83,000 700
Alkalmazás, előnyök, hátrányok Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). Sztereoizomerek elválasztása királis állófázissal Félpreparatív elválasztás szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok) Víz érzékeny vegyületek analízise Kis viszkozítású eluens nagyobb áramlási sebesség (buborék képződés problémája) Hosszú ekvilibrálási idők, retenciós idők szórása n
FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis 1) Módosított szilikagél 2) Szerves polimer alapú állófázisok 3) Szén alapú állófázisok
Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal). OH CH 3 OH Savas hidrolízis helye CH 3 Si OH + Cl Si C 18 H 37 -HCl Si O Si C 18 H 37 OH CH 3 OH CH 3 Szabad szilanol csoport
monomer polimer Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-szilánnal) módosítás
A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálatlan marad. Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) Használhatóság ph tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < ph < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: ph = 10-11 Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.
NÉV dp Fajlagos felület Szén tartalom Å m 2 /g m/m % Hypersil C4 (e) 300 50 2.0 Supelcosil C8 (e) 100 170 8.5 Spherisorb C8 80 220 6.0 Spherisorb C18 80 220 12.0 Prodigy C18 150 310 18.7 Inertsil C18 150 320 18.5 Hypersil C8 120 170 7.0 Hypersil C18 (e) 120 170 10.0 Selectosil C18 300 110 7.0
Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol<acetonitril<etanol<tetrahidrofurán. Ionizálható minta esetén ph kontroll kell. Alkalmazott pufferek: foszfát/foszforsav, acetát/ecetsav, ammónia/ammóniumklorid. Mozgófázis
Oldószer Funkciós csoportok polaritása: C-H < C-O-C < C-N-C < C N < C=O < HO-C=O < OH Oldószer erősség (ε) NORMÁL! Viszkozitás (cp) UV cut-off (nm) Hexán 0 0,33 200 Széntetraklorid 0,14 0,97 263 Kloroform 0,31 0,57 245 Diklórmetán 0,32 0,44 235 Tetrahidrofurán 0,35 0,55 215 Dietil-éter 0,29 0,23 215 Etilacetát 0,45 0,45 260 Dioxán 0,49 1,54 215 Acetonitril 0,50 0,37 190 2-propanol 0,63 2,3 210 Metanol 0,73 0,60 205 Víz >1,00 1 -
Izokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszere
Gradiens elució A módszer előnyei: Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul. Keskenyebb csúcsok. Nagyobb érzékenység. Izokratikus elució Gradiens elució
Gradiens programozás
ph gradiens, aminosavak enantioszelektív elválasztására OPA IBLC (a) and OPA IBDC (b)
HILIC - Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (HILIC) Poláris állofázis Víz-acetonitril mozgó fázis Magas víztartalmú állófázis, ami poláris (NP) Acetonitril az eluensben (RP), kompatibilis az MS-el Nagyon poláris, ionizálható vegyületek elválasztása (IC)
HILIC állófázisok Kis szénatomszámú karbonsavak, poláris és semleges gyógyszerek, szénhidrátok, peptidek
Szerves módosítok hatása fordított fázisú kromatográfiás rendszerekben Termodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknek V R = vizsgált komponens retenciós térfogata V 0 = holt térfogat G an. = vizsgált komponens adszorpciós energiája x = szerves módosító móltörtje G el. = eluens adszorpciós energiája (~ oldószererősség) Ha x nő V r csökken Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell.
Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében CH 2 n CH 3 O C CH 2 n CH 3 O HO C O CH 2 n CH 3 Szénatom szám
A ph szerepe az elválasztásban 1) Semleges vegyületek nincs ph hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. 2) Savak és bázisok ph változás hatására ionizálódnak 3) Ionos vegyületek ph és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: 1) ph kontroll szupresszió, ionos állapot visszaszorítása 2) Ionpárképzés 3) Ioncsere kromatográfia
Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a ph függvényében RCOOH RCOO - /RCOOH pka RCOO -
A ph és módosító hatása savas vegyület elválasztására tailing
Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a ph függvényében R-NH 2 R-NH 3+ /R-NH 2 pkb R-NH 3 +
A ph hatása bázikus vegyületek elválasztására Bázikus antihisztaminok (ph=11!!!)
A ph hatása fordított fázisú elválasztásra Amitryptiline Naproxen
Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC) A retenció növelése érdekében az eluensbe 1-100 mmol/l ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval. Anionos ionpárképző Alkil-szulfonsavak Kationos ionpárképző Tetrabutil-ammónium sók D- és L- kámfor szulfonát Cetil-trimetil-ammónium sók Alkil-szulfátok Dodecil-oktil-dimetilammónium sók
Surfactants - conventional low molecular weight dispersing agents.
C18 állófázis Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése [Molekula ION]- N +
Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek Ionpárképző koncentrációja (c nő k nő). Ionpárképző jellege (lánc hossz nő k nő, egyenes lánc elágazó lánc). Szerves módosító típusa és mennyisége. Puffer koncentrációja, ph-ja (ionos állapot biztosítása). Idegen só koncentrációja.
A hőmérséklet hatása az elválasztásra H = 2 λdp + 2γDm + 8 k df 2 u u π 2 (1+k) 2 Ds