Folyadékkromatográfiás állófázisok

Folyadékkromatográfiás állófázisok Kromatográfia: kvázi-egyensúlyon alapuló elválasztási módszerek álló- és mozgófázis között eltérı megoszlás eltérı vándorlási sebesség: ELVÁLASZTÁS elválasztást befolyásolja: minden, ami megváltoztatja a vándorlási sebességet álló- és mozgófázisban bekövetkezı változások Klasszikus felosztás: normál fázisú (NP) LC fordított fázisú (RP) LC ioncserés méretkizárásos

Szilikagél alapú állófázisok és jellemzésük HPLC-ben alkalmazásuk 80-90% (M w < 10000) a porózus szilikagél termodinamikailag nem stabil stabilis egyensúlyi szerkezet: a kristályos kvarc eltérı módon elıállított és utókezelt szilikagélek messze az egyensúlyi állapottól kromatográfiás tulajdonságok eltérıek Az Si O Si- kötés kevésbé polarizált, felületen OH (szilanol) csoportok állnak a mozgófázis felé

Szilikagél állófázisok felületi sajátságai: H H dezaktivált H-hidas (vicinális) izolált (szabad) O H H H H OH OH O O O O HO diol OH Si Si Si Si Si Si Si O O O O O O szilanolcsoportok helyzete a szilikagél felülete energetikailag inhomogén fémionok beépülése: erıs komplexképzı és ioncserélı centrumok harmadik generációs szilikagél: ppm-nyi fémszennyezés

HPLC-ben használt szilikagélek jellemzése Alak, geometria: gömb, szabálytalan Átlagos szemcseátmérı, d p, 3-10 µm Szemcseméret eloszlás: ±20% Pórusátmérı: 6-30 nm (60 300 Å) Fajlagos felület: A s, 50-400 m 2 /g Fajlagos pórus térfogat: 0,5-1,0 cm 3 /g

Gömb és szabálytalan alakú szemcsék

Szabálytalan alakú szemcsék porlódása szabályos szemcsék: ellenállnak a nyomásterhelésnek kevésbé porlódnak térkitöltésük egyenletes

Szemcseátmérı szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlıtlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlıtlenségek Szők szemcseátmérı eloszlás fontossága: Kisebb szemcsék beékelıdnek a nagyok közé (beton effektus), eltömik a kolonnát Jelentısen nı a zónaszélesedés, ha nı a szemcseméret eloszlás

Átlagos pórusátmérı: d p d p < 2 nm (20 Å) mikropórus 2 < d p < 50 mezopórus d p > 50 nm (500 Å) makropórus hagyományos töltetek: az anyag diffúzióval jut be a pórusokba kis átmérı: gátolt diffúzió: kiszélesedés

Pórusátmérı eloszlás: normális eloszlás: Gauss-görbe maximuma kettıs vagy szabálytalan eloszlás gyakoriság [%] gyakoriság [%] d p d p [nm] d p [nm] Nemcsak a pórusátmérı (d p ) a pórusok alakja is eltérı: legjobb az átmenı pórusú szilikagél

Átmenı pórusú szilikagél gyorsabb anyagátmenet az álló és a mozgófázis között: zónaszélesedés kisebb pórusátmérı>>molekula geometriai átmérıje

Fajlagos felület: A s megszabja a molekula tartózkodási valószínőségét az állófázison: RETENCIÓ Szemcse belsı és külsı felülete együtt határozza meg! ha gömb: 10 µm és d p = 10 nm külsı felület: 0,3 m 2 /g belsı felület: 200-300 m 2 /g A fajlagos felületet (A s ) a belsı felület szabja meg! A szemcseátmérı változásával (ırlés) a fajlagos felületet nem változik számottevıen! A pórusátmérı változása a belsı felület és ezáltal a fajlagos felület változását okozza: hıkezelés (kalcinálás) hatása! Nagy fajlagos felület: A s = 500-1000 m 2 /g (mikropórusok jelenléte)

Fajlagos felület mérés N 2 adszorpciója: BET izoterma N 2 kis molekula, a mikropórusokba is behatol, a teljes fizikai felületet megadja BET izoterma alapján azonos fajlagos felület nem minden esetben jelent azonos retenciót. Csak akkor, ha: a pórusszerkezet és ezen belül a póruseloszlás is egyezı

Fajlagos pórustérfogat: V p Pórustérfogat (V p ): az a folyadék térfogat, amellyel a pórusok a pórusfalat nedvesítı folyadékkal feltölthetık. (Közvetlenül mérhetı.) azonos szemcseátmérı, különbözı: pórusátmérı fajlagos felület porozitás: pórustérfogat porozitás mérés mikropórusok esetén: higanyos porozitás mérı Washburn: az a nyomás, mely ahhoz szükséges, hogy a higanyt a pórusokba préseljük: p ( bar) 14,708 p w ( µm) ε ahol p w : átlagos pórusátmérı p = V V p szemcse Minél kisebb a pórusátmérı, annál nagyobb Hg nyomás szükséges a pórusokba hatoláshoz. Felvilágosítást ad a póruseloszlásról is

p Higanynyomás változása a porozitás vizsgálatokban 2 1. Pórusátmérı szők tartományú 1 2. Eltérı pórusátmérıjő töltet d p A mikropórusok jelenléte (anyagátadási gát) csúcsszélesedés

Na 2 SiO 4 ; SiCl 4 ; Si(OR) 4 Hidrolízis Szilika szol stabilizálás ph, T, só Szilikagél elıállítása lúg, só ph, só, T A szilikagél porozitása és felületi tulajdonságai nagyban függnek az elıállítás módjától! gömb alak, nemporózus A s : 50-400 m 2 /g Szol-gél átalakítás Utóérlelés Mosás Szárítás, hevítés Hidrotermikus utókezelés ph T (t) T háromdimenziós aggregátum: porózus szerkezet létrejötte sziloxán kötések: hidrogél stabilitása nı víz eltávozik, újabb sziloxán kötések, térfogatcsökkenés, gél stabilitása nı mikropórusok mezopórusokká alakítása: hı vagy vízgız kezelés

Szol-gél átalakulás: porózus szerkezet kialakulása HO HO HO OH OH OH OH OH HO OH OH HO OH HO OH OH HO OH HO HO OH OH O HO HO OH OH O OH OH HO HO OH HO OH HO OH 5-100 nm HO HO HO OH OH OH OH OH HO HO HO OH O OH OH OH HO HO HO OH OH OH OH n db Nem pórus Pórus

Kromatográfiás minıségő szilikagél elıállítása Hasonló pórusszerkezető és szennyezettségő szilikagél elıállítása Szilika szolt nem vizes közegen engedik át: kis átmérıjő cseppek képzıdnek hidrogéllé alakulnak Szilikahidrogélt szárítják végsı pórusszerkezet 673-1073 K-en hevítik (kalcinálják) Két paraméter befolyásolja a pórusszerkezetet: Szilika szol NaOH tartalma: nehéz kimosni (ez okozza a vizes zagy lúgos ph-ját) Kalcinálás hımérséklete Nincs két egyforma szilikagél, legfeljebb azonos gyártó esetén!

Különbözı pórusmérető Lichrosorb szilikagélek adatai Pórusátmérı Fajlagos felület Fajlagos pórustérfogat Kizárási molekulatömeg [Å] [m 2 /g] [ml/g] [dalton] Si 40 800 0,6 4000 Si 60 500 0,7 20000 Si 100 300 1,0 40000 A pórusméret csökkenésével nı a fajlagos felület, de jelentısen csökken az ún. kizárási tömeg: a molekula nagyobb, mint a pórusátmérı, nem fér be a pórusba

Alumínium-oxid alapú kolonnák Lúgosan kezelt ill. közel semleges Felület függ: a kezelés ph-jától a kezelés hımérsékletétıl fajlagos felülete kisebb: 50-200 m 2 /g gyengébb adszorpciós kölcsönhatások Az alumínium-oxid pórusai inkább téglatest alakúak, mint hengeresek: alakszelektív elválasztás Snyder: az oldószererısség kb. 10%-kal kisebb Vízre érzékeny: felületi OH csoportok Hasznosítás: - savérzékeny vegyületek - alakszelektív elválasztás ε 0 szilikagél 1,1ε 0 alumínium oxid

Normál fázisú kromatográfia Zwett: klorofillokat választott el krétaporon petroléter segítségével Poláris(abb) állófázison apoláris(abb) mozgófázissal (közepesen) poláris vegyületeket választunk el. állófázisokkal szemben támasztott követelmények: mechanikai stabilitás kis szemcseátmérı, szők szemcseméret-eloszlás energetikai homogenitás: visszatartásért felelıs helyek hasonló kölcsönhatási energiával rendelkeznek ismert pórusátmérı, pórusalak, pórusméret-eloszlás szilikagél: kémiai inertség jó mechanikai ellenállóképesség (1000 bar) ph stabilitás: 2 < ph < 7 (9)

normál fázisú kromatográfia állófázisai: szilikagél (80-90%) szilikagélhez kémiailag kötött poláris csoportot tartalmazó fázisok (bonded phase): amino, ciano, diol, nitro stb. (5-10%) alumínium-oxid (5-10%) Kémiailag módosított poláris adszorbensek a fejlesztés oka: víz okozta dezaktiváló hatás csökkentése szelektivitás növelése a kölcsönhatás csökkentése energetikailag homogénebb felület kialakítása

víz okozta dezaktiváló hatás Ha az eluens nem tartalmaz vizet, a víz jelentısen befolyásolja a felületet: a legnagyobb energiájú adszorpciós helyeken kötıdik meg: retenció csökkenése Aktiválás mosás egyre apolárisabb oldószerrel: alkohol-éter-kloroform-hexán aktiválás 150-200 C-on, N 2 áramban

Legelterjedtebb: -Si-O-Si- kötéső módosított fázisok árnyékoló csoport: távol tartja a mintát a felülettıl szilanolcsoportok hatásának csökkentése távtartó csoport: aktív csoport eltávolítása a szilikagél felületétıl CH 3 árnyékoló Si-O Si CH 2 -CH 2 -CH 2 -NH 2 kölcsönható CH 3 leggyakoribb módosítók: amino (NH 2 ) ciano (CN) diol (OH) távtartó (spacer) fordított fázisban is alkalmazhatóak Szilanolcsoportok maximum 60%-a alakítható át.

Fordított fázisú kromatográfia A mozgófázis polárisabb az állófázisnál fordított fázisú állófázisokkal szemben támasztott követelmények: mechanikai stabilitás energetikai homogenitás: visszatartásért felelıs helyek hasonló kölcsönhatási energiával rendelkeznek jó pórusszerkezet apoláris felület leggyakrabban alkalmazott állófázis (hordozó): Szilikagél

alkalmazható ph tartomány: Felsı határ: szilikagél oldhatósága (ph: 8-9, utószilanizálással növelhetı) Alsó határ: módosító csoportok hidrolízise (ph: 1-2, fém szennyezık jelenléte gyorsítja)

HPLC fordított fázisok csoportosítása: 1. Monomer módosítású fázis 2. Átmeneti módosítású fázis 3. Polimer módosítású fázis 1. Monomer fázisok monofunkciós klór-szilánokkal történı felületmódosítás CH 3 Si-OH + Cl Si R CH 3 CH 3 Si-O Si R CH 3 + HCl A reakció után 50-60% szabad szilanolcsoport marad a CH 3 csoportok árnyékolása miatt (teljesen borított felület nincs)

Szabad szilanolcsoportok hozzáférhetısége függ: pórusszerkezettıl: a reakció hatására a pórusokban létrejött réteg szőkíti a pórusokat mozgófázis összetételétıl: -nagy víz tartalmú eluens: az alkillánc (pl. C 18 ) a felületre borul, elfedi a szabad szilanolcsoportokat -nagy szerves oldószer tartalmú eluens: C 18 láncok kinyílnak, lobognak, szabad szilanolok hozzáférhetıvé válnak a mintakomponensekre. Megoldás: árnyékolás szilanizálószer nagyobb, pl. 2-propil-csoportot tartalmaz (metilcsoportnál magasabb sztérikus gát)

MeOH felületre borulva lobognak

A fordított fázisú töltet jellemezhetı a hidrofób/hidrofil felület arányával Hidrofób felület (C 18 ): gyenge diszperziós kölcsönhatás (4-20 kj/mol) Hidrofil felület (-OH): erıs H-hidak (50-80 kj/mol) A felületen lévı fémionok befolyásolják a szilanolcsoportok disszociációját (pk a változik ±1 egységgel) szilikagélek fémion tartalma: elsı generációs: 150-200 ppm második generációs: 10-100 ppm harmadik generációs: <1 ppm Hidrofób/hidrofil felület arány, fémion tartalom miatt kontrollálatlan fázisok: egy gyártón belül sincs két azonos fázis

2. Átmeneti módosítású fázisok Bifunkciós klór-szilánok alkalmazása: 1 lépésben 2 szilanolcsoport módosítása Si R OH Cl + Si OH Cl CH 3-2HCl Si R O Si O CH 3 OH OH Víz jelenlétében: Si-Cl kötés hidrolizál -OH A reakciókörülmények (pl. víztartalom) állandó értéken tartása elengedhetetlen a reprodukálható állófázis elıállításában.

2. Átmeneti módosítású fázisok R R Si OH Cl + OH Si Cl CH 3 -HCl Si O OH + Si Cl CH 3 +H 2 O -HCl OH R OH R +H 2 O -HCl Si O OH OH + Si OH CH 3 +szililezıszer -HCl Si O OH OH Si + O Cl Si CH 3 R CH 3 Hidrofób/hidrofil felületarány változtatható Monomer módosításhoz képest: eltérı sajátságú állófázis

3. Polimer módosítású fázisok Trifunkciós klór-szilánok alkalmazása víz tartalmú oldószerben: felületi térhálós polimer Reaktáns: triklór- vagy trietoxiklór-szilán + víz Maximum két Cl reagálhat a szilanolcsoportokkal Harmadik Cl további reakció a felületen térhálós polimer jön létre 1. Si OH Cl + OH Cl OH Si R Cl -2HCl Si O O OH Si R Cl Reakcióképes csoport

2. +H 2 O és szililezıszerre térhálósódás OH Cl OH Cl Reakcióképes csoport Si OH + Cl Si R -2HCl Si O Si R OH Cl OH Cl Reakcióképes csoport 3. POLIMERIZÁCIÓ OH +H 2 O és szililezıszerre térhálósódás O +2H 2 O -2HCl Si O OH OH + Si OH R +szililezıszer -HCl Si O OH OH Si + O Cl Si R R Cl

polimer módosítású állófázis: hozzáférhetı és leárnyékolt szilanolcsoportok polimerizáció: az oldatfázisban is lejátszódhat állófázis tulajdonságai: polimer szerkezetétıl függenek

Utószilanizálási reakciók szabad szilanolcsoportok: nemkívánatos kölcsönhatások (csúcs kiszélesedés) A maradék szabad szilanolcsoportok utólagos eltüntetése: End capping Módszerei: 1. Reagens: kellıen kis mérető, hogy a zegzugos polimerbe beférjen trimetil-klór-szilán Jó a polimer OH-ra, kevésbé hatásos a szilikagél felületén lévı OH-ra 2. Kétszeres utószilanizálás: a hosszú módosító láncok közül a könnyen hidrolizálhatót rövidebbre cserélik (nı a stabilitás)

3. Szililezıszer szénláncán terminális -NH 2 helyezkedik el ráhajlik a mellette lévı szilanolra, blokkolja víztőrı fázisok (vízzel vagy puferrel használhatók szerves módosító nélkül)

Monomer és polimer fázisok megkülönböztetése Szilanolcsoportok konverziójának mértéke x OH α α c OH α C : a felületen az alkilcsoport koncentrációja (µmol/m2 ) α OH : a szilanolcsoportok koncentrációja (µmol/m 2 ) A szilanolcsoportok konverziójának értéke: X OH < 1 monomer módosítású fázis 0,5 < X OH < 1 átmeneti módosítású fázis X OH > 1 polimer módosítású fázis

A ligandumok méretének hatása az elválasztásra HPLC-ben: C 2, C 4, C 8, C 18 és újabban C 30 szénláncokat visznek fel Az alkillánc hosszának hatása a retencióra Már a C 12 is jó (telítés)

Az alkillánc hosszának hatása a szelektivitásra itt is telítési görbe: k és α között kapcsolat van!

Az alkillánc hosszának hatása a hatékonyságra maximum oka: C 2 borítás esetén kölcsönhatás a szilanolcsoportokkal adszorpció lép fel: gátolt anyagátmenet: sávszélesedés C 30 borítás esetén a molekula túl sokáig diffundál az apoláris rétegbıl vissza a mozgófázisba optimális: elegendıen hosszú lánc: nincs számottevı kölcsönhatás a felülettel és elég gyors a diffúzió

Az állófázisok ph stabilitása (2<pH<8) Tartósan magas ph esetén: pontkorrozió a pórus átszakad, a szemcse összeomlik nagy iontartalom növeli az oldhatóságot: nagy koncentrációjú puffer használata nem elınyös magasabb ph: ph tőrı állófázisok

Felsı ph növelése: hibrid technológia Szerves és szervetlen töltet egyszerre Si-O-Si- kötések mellett Si-CH 3 kötések Xterra: ph 1-12 tartományban stabil

Tartósan alacsony ph esetén (ph < 2) Az alkilláncok hidrolízis sebessége nı Új tipusú töltet: a klórszilán CH 3 csoportok helyett 2-propil, i-butil-csoportot tartalmaz: -O-Si- kötéshez való hozzáférés csökken

Poláris csoportot is tartalmazó fordított fázisú töltetek savamid ( NH-CO-R) csoportot, kvaterner ammóniumiont építenek be: lehetséges kölcsönhatások: H-híd ioncsere (alacsony ph: -NH 2+ -)

Nem szilikagél alapú fázisok Szerves polimer alapú állófázisok: sztirol-divinilbenzol kopolimer kevésbé nyomástőrı (keresztkötések számával javítható) duzzadhatnak: (bizonyos szerves oldószereket csak kisebb koncentrációban vagy egyáltalán nem lehet alkalmazni) ph stabilitás: 1< ph < 14 hátrány: DVB növelése: keresztkötés mikropórusok keletkezése mechanikai stabilitás növelés kinetikai hatékonyság csökken

Komponens-állófázis kölcsönhatások: Aromás-aromás (π-π) aromás-apoláris kölcsönhatások Aromás győrőre -C 18 H 37 csoportot építenek: kapcsolat az oktadecilszilika kolonnákkal ez is egy C 18 töltet

Szerves polimer fázis rosszul nedvesíthetı Nedvesíthetıség növelésére ionos (ionizálható) csoportokat építenek be:

Többfunkciós szerves polimer alapú töltetek Apoláris oldalláncok, aromás csoportok: Piridin bázis protonált formája: hidrofób kölcsönhatás ionos kölcsönhatás (anioncsere) Apoláris oldalláncok, aromás csoportok: Szulfonsav csoport (ph kontroll): hidrofób kölcsönhatás ionos kölcsönhatás (kationcsere)

Szerves polimer fázisok kritikus pontja a nyomástőrés Szemcsék összelapulnak végül összeroppannak Szerves polimer fázisok elınyei: ph tartomány: 1-14 szemcseátmérı eloszlás jó energetikailag gyenge kölcsönhatás (tiszta RP) szinte végtelen élettartam reprodukálható sarzsok Szerves polimer fázisok hátrányai: kisebb hatékonyság (N) lassúbb egyensúly beállás rosszabb nedvesíthetıség limitált maximális nyomás klórozott szénhidrogénekkel nem kompatibilis

Szén alapú állófázisok Kezdetben: szén mint adszorbens nem lineáris izoterma, mechanikai instabilitás jellemezte Knox és Gilbert porózus grafitizált szén (PGC) elıállítás lépései nagy porozitású, 5 µm szemcseátmérıjő szilikagél pórusokat fenol-formaldehid monomerrel töltik fel fokozatosan 150 C-ra hevítik, hogy fenol-formaldehid gyanta képzıdik a pórusokban ezt a gyantát fokozatosan 900 C-ra hevítik N 2 áramban szilárd szilikagél váz szénnel töltött pórusokkal 5M KOH oldattal a szilikagélt kioldják gömbszimmetrikus szén részecskék (inverz alakja a szilikagélnek) pórusátmérı kisebb mint 30Å, fajlagos felület 400 m 2 /g Szenet oxigén-argon atmoszférában hevítik, mikropórus átrendezıdik, makropórus keletkezik, visszamarad a sík, kristályos felület HYPERCARB

3. Egyéb töltetek Titán-dioxid alapúak Zirkónium-oxid alapúak Zeolit típusúak Oszlop anyaga: Oszlop méretei: saválló acél átmérı: 2-5 mm üveg hossz: 5-25 cm PEEK (poli(éter-éter-keton)) Töltet: (irreguláris) szférikus

Kolonnák

Töltetek porózus részecskék (szivacs-szerő szerkezet) átmérı: 3-10 µm pórusok belsejében: diffúzió átjárható részecskék: átjárható pórusok: 600-800 nm diffúziós pórusok: 80-150 nm 20 µm-es részecskék kicsiny ellenállás nem-porózus részecskék nincs belsı felület: nincs (elhanyagolható) diffúzió átmérı: 1-2 µm nagy nyomás kicsiny mintakapacitás monolit töltet: pórusos rúd kicsiny ellenállás kedvezı tulajdonságok

Töltetek héjszerkezető töltet: az állófázis porózus külsı héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén ötvözi a porózus és a nem-porózus töltet kedvezı tulajdonságait

H [mm] Töltetek C * u H min u u [cm/s] H = A + B/u + C * u

Folyadékkromatográfiás mozgófázisok A mozgófázisokkal szemben támasztott követelmények 1. az oldószer polaritása (módszer specifikus: normál, fordított fázisú kromatográfia) 2. az oldószer viszkozitása 3. az oldószer UV-fényáteresztése 4. az oldószer tisztasága 5. az oldószer forráspontja 6. az oldószer oxigén tartalma 7. az oldószer víztartalma 8. elegyíthetıség 9. ártényezık

Normál fázisú kromatográfia (NP-HPLC) mozgó fázisai 1. Az oldószer polaritása Az oldószernek vagy az oldószerelegynek a rendszer által meghatározott polaritásúnak kell lenni. Ez a módszerspecifikus feltétel. Olyan oldószert vagy oldószerelegyet kell választani, hogy a legkevésbé visszatartott komponensre is igaz legyen: k > 1

2. Az oldószer viszkozitása, nyomásesés a kolonnán Az alkalmazott oldószerek viszkozitása általában η < 1, ezért 25 C-on 1 cm 3 /perc vagy nagyobb térfogati áramlási sebességgel dolgozhatunk Darcy törvénye: u = K η o P Lε NP-HPLC-ben az u növelésével H minimálisan növekszik: nagyobb áramlási sebességekkel dolgozhatunk: rövidebb analízis idı kis viszkozitású oldószerekkel gyorsabb az anyagcsere az álló- és a mozgófázis között (kisebb sávszélesedés)

3. Az oldószer UV-fényáteresztése Legtöbbször UV-Vis detektort alkalmazunk 100T (%) 90%, UV cut off λ (nm) Uv cut-off: transzmittancia 90%-ra csökken Izokratikus vagy gradiens eluciónál más-más tisztasági fokú oldószereket kell alkalmazni (chromatographic grade; gradient grade; ultra pure grade) A szennyezések az állófázis felületét átalakítva (fıleg gradiens elució esetén) megváltoztatják az elválasztást

4. Az oldószerek tisztasága, toxicitása A szerves oldószerek (fıleg a halogén tartalmúak, CCl 4, CHCl 3, stb.) egészségre ártalmasak 5. Az oldószerek forráspontja Alacsony forráspontú oldószereknél nagyobb a buborék képzıdés esélye (pentán: hőthetı-főthetı termosztát). Ciklo-hexán esetén nagyobb nyomásnál (250 bar) a ciklo-hexán megszilárdul (dugattyútörés). 6. Az oldószerek oxigéntartalma Az NP-HPLC-ben használt oldószerek kb. ugyanolyan mértékben oldják az oxigént, nincs gázkiválás. (Az NP-HPLC-ben ritkán gázmentesítünk.)

7. Az oldószerek víztartalma Szilikagél-alapú állófázison a víz hatása elkerülhetetlen: a gyártás során a víz H-hidas kötéssel kötıdik a szilanolcsoportokhoz, ezt a vizet még hıkezeléssel is nehéz eltávolítani. Abszolutizált oldószereket használva ez a víz fokozatosan lejön reprodukálhatatlan retenció Metanol hasonlóan viselkedik mint a víz. Kémiailag módosított állófázisokon a víz hatása kisebb: a legaktívabb helyek le vannak már kötve a módosítóval. Víz hatásának kiküszöbölése: Vízzel telített mozgófázisok alkalmazása (nem jó: a víz adszorbeálódik a pórusokban, nem szilárd-folyadék hanem folyadék-folyadék kromatográfia esete áll fenn Néhány tized% 2-propanol alkalmazása kikerüli a víz okozta problémákat

8. Ártényezık Szénhidrogének, különösen egyes perfluorozott szénhidrogének ára meglehetısen magas. Az 1.-8. pontban felsorolt igényeknek egyetlen oldószer sem felel meg! Oldószer elegyeket használunk! A oldószer: biztosítja a nagy retenciót B oldószer: a megadott tartományba állítja a retenciót. Ezzel a poláris oldószerrel állítjuk be az adszorbens aktivitását. eluenserısség: alap: szénhidrogén poláris modifikátor

Alap oldószerek ( A oldószerek) n-hexán n-heptán i-oktán Oldhatóság növelı oldószerek diklórmetán diklóretán kloroform (etanollal stabilizált) Módosító szerek (modifikátorok; B oldószerek) Az állófázis legaktívabb helyein kötıdnek, homogenizálják a felületet. lokalizáltan adszorbeálódók: erıs H-híd kötések, a mintamolekula nem szorítja le az állófázisról nem lokalizáltan adszorbeálódók: gyenge H-híd kötések, a mintamolekula leszorítja az állófázisról a módosítószert, szelektivitás nı modifikátor kötıdése: alkohol > észter > éter

Leggyakrabban használt oldószerek polaritása és retenció összefüggések az NP-HPLC-ben

Az NP-HPLC-ben használt oldószerek eluens erıssége Az elúciós erısségi skálát Snyder dolgozta ki Az elúciós erısségi skála alapja az oldószer adszorpciós hıje alumínium-oxidon: a pentán adszorpciós hıjét 0-nak tekinti, a többi oldószert ehhez viszonyítja Minél nagyobb az oldószer kölcsönhatása az állófázissal, annál nagyobb az adszorpciós hı Az oldószer erısség, ε 0 egy dimenziómentes szám, mely megegyezik az oldószernek egységnyi felületre normalizált adszorpciós hıjével A szilikagél felületi aktivitása nagyobb mint az alumínium-oxidé, így a poláris oldószerek adszorpciós hıje is nagyobb, az eluens erısségük nı; összefüggésük: ε 0 szilikagél = 1,10 ε0 aluminium-oxid

Az NP-HPLC-ben használt oldószerek eluens erıssége

Snyder modellje az adszorbens egyrétegő (mono-molekuláris) borítottságán alapul S B B B B B S B d f S m + nb s S s + nb m [ ][ ] n SS Bm K = lg K = lgv ( ) [ S ][ B ] n a + β Se nε B m s V A - adszorpciós térfogat (d f *A S ); Se- S molekula adszorpciós energiája; ε B - oldószer egységnyi felület/molekula felület adszorpciós energiája; β- adszorbens aktivitási tényezı. ε B - oldószererısség mértékét jellemzi (kiinduló értéke 0, pentán alumínium-oxidon)

Fordított fázisú kromatográfia (RP-HPLC) mozgófázisai Az oldószerrel szemben támasztott általános követelmények megegyeznek az NP-HPLC mozgófázisaira megismertekkel Módszerspecifikus követelmény: A mozgófázis polárisabb mint az állófázis. Ennek a követelménynek a víz felel meg a legjobban Uv cut-off: 190 nm Viszkozitás: η = 1 cp A szerves molekulák nagy része nem oldódik vízben: szerves oldószer adagolása

RP-HPLC-ben alkalmazott szerves oldószerek Problémák: etanol és 2-propanol viszkozitása nagy dioxán polaritása ugyan nagy, de mérgezı tetrahidrofurán (THF): peroxid képzıdés elkerülésére 3,5- diizobutil-4-hidroxi-toluolt tartalmaz: ez adszorbeálódik a kolonnán és 280 nm-ig elnyeli a fényt (UV cut-off) acetonitril: kellı tisztaság biztosítása probléma (tisztaság ellenırzés gradiens elúcióval; lásd: detektorok)

Az alkoholok vízzel H-hidas kölcsönhatásba lépnek, a biner elegyek viszkozitása maximum görbe szerint változik Az etanol és a 2-propanol esetén a maximum még nagyobb értékő. Az acetonitril vízzel dipól-dipól kölcsönhatást létesít, mely gyengébb mint a H-híd, a görbe lefutása laposabb. egyre kisebb szemcseátmérıjő (d p ) kolonnák kerülnek forgalomba, a belépı nyomás ( p) nı, ezért az acetonitril sokkal kedvezıbb mint a metanol

A viszkozitás a hımérséklet növelésével csökken De: magasabb hımérsékleten dolgozva a kolonna élettartama csökken

Eluenserısség Nem olyan egyértelmően definiálható mint az NP-HPLC-ben: a felület változása miatt az adszorpciós hı meghatározása nem egyértelmő Nagy ligandum borítottságú felületnél csak diszperziós kölcsönhatás (hidrofób-hidrofób ) lép fel, ami a kölcsönhatási felületek nagyságával arányos RP-HPLC-ben használatos oldószerek eluotróp sora eluciós erı víz < metanol < acetonitril < etanol < 2-propanol < THF szelektivitás

Kinetikai hatékonyság változása biner elegyek esetén A víz - 2-propanol elegy alkalmazásának korlátja nemcsak a nagy viszkozitás, hanem a kinetikai hatékonyság csökkenés. (A kettı összefügg: Wilke-Chang egyenlet)

A szelektivitás függése a módosítószertıl Tökéletesen borított állófázis nincs (szabad szilanolok) Kérdés: hogyan jut a mintakomponens a szabad szilanolokhoz különbözı módosító esetén? Az alkilláncok taszítják a vizet, de módosítószertıl függıen a C 18 lánc különbözıképpen szolvatálódik, különbözı vastagságú adszorbeált réteg alakul ki Metanol: a megkötött oldószerréteg vastagsága kicsi, adszorpció jöhet létre a mintakomponenssel a felületen, ami erısebb, mint az abszorpció THF: a C 18 láncok jól szolvatálódnak a tetrahidrofuránban, vastag az adszorbeált réteg, a mintakomponens abszorbeálódik a szolvatált rétegben, gyengébb a kölcsönhatás mint a metanolos rétegben

Acetonitril: a kettı közötti szolvatáció, adszorpciós-abszorpciós kölcsönhatás Molekuláris szinten: Metanol: a C 18 láncok nem szolvatálódnak jól, a felület közelében vannak, beborítják a felületet elzárják az utat a szilanolcsoportokhoz ( hidrofób zár ) THF: a C 18 láncok jól szolvatálódnak, kinyílnak, lobognak a felületen még több szilanolhoz való hozzáférést biztosít Acetonitril: a kettı közötti szolvatáció, kevesebb szilanolhoz való hozzáférés, mint THF esetén Ha a mintakomponens erıs H-híd kötésre hajlamos, THF alkalmazásával növelhetjük a kölcsönhatás valószínőségét a szilanolcsoportokkal A szelektivitás csökkenését víz-metanol-thf terner rendszerrel javíthatjuk

Toxikusság Szerves oldószerek mind károsak az egészségre Pufferek használata Ionos és könnyen ionizálható anyagok vizsgálata: ph kontroll Ismerni kell a komponensek pk a értékét és az alkalmazni kívánt anyag pufferkapacitását Puffer használata: csökkenti a kolonna élettartamát Pufferek speciális alkalmazása: ionpár kromatográfia Pufferekkel szemben támasztott követelmények: alacsony cut-off hullámhossz nagy pufferkapacitás szilárd anyag mentesség (szőrés) pufferkompatibilitás: nagy szerves anyag tartalomnál ne váljon ki

Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) Ionok elválasztása: eltérı sebességgel haladnak át egy megfelelıen megválasztott oszlopon Ioncserélı gyanták 1971: forced flow chromatography : N 2 gáz +UV-Vis spektrofotometria: Fe(III) elválasztása HPLC fejlıdése megteremtette a mőszeres hátteret az IC fejlesztéséhez hiányoztak a detektorok (klasszikus HPLC detektorok nem alkalmasak) 1975: vezetıképesség-mérésen alapuló detektálás: modern IC

elválasztásért felelıs oszlop szulfonált polisztirol-dvb kicsiny ioncserekapacitás: 0,02 mmol/g elnyomó oszlop nagy ioncserekapacitás Ionkromatográf: Dionex Co. Kationokra: spektrofotometriás meghatározások léteztek korábban is Anionokra kicsiny koncentrációban (ppm) nem volt analitikai módszer

Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására Minta halmazállapota: folyadék nagyhatékonyságú analitikai módszer kvalitatív & kvantitatív információk összetett minták analízise a mintát alkotó komponensek szétválasztása Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélı technikai kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez

Elúciós analízis leggyakrabban alkalmazott technika jel 1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció Minta: A & B A: kevésbé kötıdik A detektort elérı mintakomponens(ek) felgyülemlett mennyiségét méri. A B integrális detektor Analitikai információ: minıségi: t (retenciós idı) mennyiségi: csúcs területe az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny elhanyagolható az eluenséhez képest nincs szükség regenerálásra jel t A t B idı differenciális detektor Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében. idı

Állófázis: térhálósított mőgyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon ioncserélı funkciós csoportok módosított szilikagél Ioncserélık: kationcserélık anioncserélık erıs kation: -SO 3 H (szulfonsav) gyenge kation: -COOH Ioncserélık: erıs gyenge erıs anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport Kationcserélı: n RSO 3 H + M n+ (RSO 3 ) n M n+ + n H + anioncserélı: n RN(CH 3 ) 3 OH + A n- [RN(CH 3 ) 3 ] n A + n OH -

Ionok megkötıdése függ: méret töltés hımérséklet ionerısség ph Állófázis: pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés hatékonyság növelése: felületi porózus réteg: éles csúcsok (kicsiny minta kapacitás) Mozgófázis: Kationok elválasztása: erıs sav híg (vizes) oldata Anionok elválasztása: erıs bázis híg (vizes) oldata Detektor: vezetıképesség mérés kompetíció a H + (OH - ) és a M n+ (A n- ) között az ioncserélı helyeken eluens: nagy a vezetıképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetıképesség elnyomó

Kationcserélı analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélı szupresszor Analízis: Kationcserélı: n RSO 3 H + M n+ (RSO 3 ) n M n+ + n H + Elnyomás: H + semlegesítése (eluens + minta) (KCl meghatározás acidi-alkalimetriásan) n RN(CH 3 ) 3 OH + A n- + nh + [RN(CH 3 ) 3 ] n A + n H 2 O A n- : az eluens anionja az eluens anionja megkötıdik és vele ekvivalens mennyiségő hidroxidion kerül az oldatba lecserélıdik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is: ekvivalens mennyiségő OH - jut az oldatba vezetıképesség mérés & kationok eluens tároló pumpa adagoló analitikai kolonna ionelnyomó kolonna detektor PC ionelnyomásos IC

anionok elválasztása: kationcserélı szupresszor Szupresszor oszlop: regenerálást igényel csúcs kiszélesedét okoz hatékonyság csökkenés Gyenge savak anionja nem meghatározhatók: savas forma kicsiny vezetıképesség-változást eredményez Kicsiny ioncserekapacitású oszlopok megjelenése: nem szupresszált rendszerek Anioncserélı: TÖLTET-E - + A - TÖLTET-A - + E -

nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop): kicsiny vezetıképességő mozgófázis alkalmazása eluens tároló pumpa adagoló analitikai kolonna detektor PC egykolonnás (nem szupresszált) IC Mozgófázis: benzoesav ftálsav borkısav citromsav Detektor: vezetıképesség mérés UV-Vis

1980 Töltetek fejlıdése: hatékonyság növekedés: folyamatosa növekvı számú alkalmazás töltettel szemben támasztott követelmények: lehetı legnagyobb tányérszám töltet/eluens rendszer: gyors egyensúly (kinetikus csúcs kiszélesedés minimalizálása) retenciós idık: se túl nagy, se túl kicsi töltet/eluens rendszer: detektorral kapcsolható legyen

Oszlop anyaga: saválló acél PEEK (poli(éter-éter-keton)) kicsiny (µm) szemcsék (HPLC) különbözı mérető pórusok: mikro & makro Az oszlop Oszlop méretei: átmérı: 1-8 mm Töltet: hossz: 3-30 cm polisztirol-dvb kopolimer módosított szilikagél cellulóz alapú szerves polimer-alapú töltetek: kevésbé nyomástőrı (keresztkötések számával javítható) duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható ph stabilitás: 1< ph < 14 szilikagél: ph: 3-8 pellikuláris töltet: az állófázis porózus külsı héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén

Kationcserélı HO 3 S HO 3 S HO 3 S SO 3 H kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás

Anioncserélı CH 2 N + R 3 CH 2 N + R 3 R 3+ NCH 2 CH 2 N + R 3 kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás

SiO 2 OH OH Módosított szilikagél OH OH OH

H [mm] H = A + B/u + C * u A van Deemter egyenlet általános ábrázolása C * u H min B/u A u szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlıtlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlıtlenségek u [cm/s]

Mintaadagolás 1. a mintát pillanatszerően kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG) minta térfogata: 10-50 µl (nincs térfogatváltozás) mikroliterfecskendı: A bevitt minta térfogatát az adagolón elhelyezett hurok ( loop ) térfogata határozza meg. hatutas bemérı szelep

alternáló mozgást végzı, kis dugattyú-térfogatú pumpa (reciprocating pump) pulzálás: jelentısen csökkenthetı: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás) térfogat: 10-100 µl továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása: löket hossz dugattyú sebessége V idı

DETEKTOROK Az eluenst alkotó ionok jelenlétében képesnek kell lennie, a minta ionjainak mérésére. csak a mintát alkotó komponensekre ad válaszjelet csak az eluenst alkotó komponensekre ad válaszjelet (indirekt detektálás) Eluens megválasztása: minél kisebb detektorjel

Detektorok Kolonna: idıben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel (vivıgázzal) együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által elıállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idıegység alatt bejutott mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet destruktív nem destruktív dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %) érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkezı jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelmően megkülönböztethetı a háttértıl (LOD) meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelı precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ)

UV-Vis spektrofotométer Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens Lambeert-Beer: A λ = ε λ c l fényforrás rés monokromátor fényosztó (splitter) I 0 mérı ág cella (küvetta) I 0 I 0 referencia ág I D E T E K T O R A = lg I 0 /I Fényforrás: UV: deutérium lámpa Vis: volfrám lámpa Detektor: fotodióda Cella: kvarc küvetta l=5-10 mm

Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector) polikromátor fényforrás lencse cella (küvetta) diódasor Elıny: különbözı hullámhosszúságon mért elnyelések egyidejő mérése spektrum felvétele: minıségi információ

Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor fluoreszkáló anyagok detektálása rés monokromátor cella (küvetta) fényforrás monokromátor pl. festékanyagok Detektor: a kibocsátott fényt méri

Vezetıképesség: G [Siemens] 1/R Vezetıképesség mérésen alapuló detektor Ha egy elektrolit oldatba két azonos mérető, sík felülető, párhuzamos elektródlap (pl. Ptlap) merül, amelyek felületének nagysága A, a köztük levı távolság pedig l, akkor az így kapott vezetıképességi cellára igaz, hogy K=A/l: cellaállandó (geometria) κ: fajlagos (specifikus) vezetıképesség: megadja a két, egységnyi (1 cm 2 ) felülető, egymástól egységnyi távolságra (1 cm-re) levı elektród között levı elektrolitoldat vezetıképességét oldatok vezetıképessége: additív tulajdonság Függ: ionok minıségétıl (mozgékonyság) ionok számától (koncentráció)

Semleges molekulák: nem detektálhatók Elv: 2 elektród (acél) elhelyezve az áramlási cellában megfelelı feszültség: áram folyik Áramerısség: töltés, méret, koncentráció, oldószer, hımérséklet Egyenfeszültség: elektrolízis veszélye Váltakozó feszültség: 100-10 khz, U= 20 V Érintkezés mentes cella

Detektor: vezetıképesség változása: 2 %/ o C zaj csökkentése The detector works without direct contact of the electrode with the eluent or sample. The sensor is based on two metal tubes that are placed around a fused silica capillary with a detection gap of approximately 1.5 mm (Figure 4.2). The conductivity sensor is based on two metal tubes that act as cylindrical capacitors. The electrodes may be placed around any nonconducting tubing such as fused silica, PEEK, or Teflon. Dead volume of the connecting tubing is minimized and an extremely low dead volume cell can be manufactured. A high oscillating frequency of 40 100 khz is applied to one of the electrodes. A signal is produced on the other electrode as soon as an analyte zone with a different conductivity compared to the background passes through the detection gap. An amplifier and rectifier are connected to the second electrode to measure resistance between the two electrodes. To isolate the two capacitors associated with each electrode, a thin piece of copper is placed between the electrodes and grounded.

Egyéb detektorok: potenciometria amperometria atomabszorpció ICP tömegspektrometria Termosztát: oszlop: ioncsere: hımérséklet függés

eltérés a HPLC-tıl: Ionokat mérünk (HPLC is) Ioncserélı oszlopokat használ (HPLC is) ALKALMAZÁSOK: Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari Környezetvédelmi

Ionpárkromatográfia: C18 HPLC oszlop + mintát alkotó ionokkal ellentétes töltéső ionok hozzáadása HILIC fázis: Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography + CH 3 SiO 2 CH 2 -N-CH 2 -CH 2 -CH 2 -SO- 3 CH 3

Kapilláris elektroforézis elektroforézis: valamely vezetı közegben (általában víz) elektromos erıtér hatására a töltéssel rendelkezı részecskék elmozdulnak elektroforetikus elválasztás: az elválasztandó komponensek adott elektromos tér hatására kialakuló eltérı migrációs sebességén alapul elektroozmotikus áramlás: (electroosmotic flow, EOF) a folyadék elektromos tér hatására valamely töltéssel bíró felület mentén kialakuló elmozdulása κ = G K κ: fajlagos vezetıképesség [S cm -1 ] G: vezetıképesség [S] K: cellaállandó [cm -1 ] κ Λ = moláris fajlagos vezetıképességet (Λ m c m ) Kohlrausch elsı törvénye Λ m = λ + + λ λ+: a kation moláris fajlagos vezetıképessége [cm 2 Ω -1 mol -1 ] λ-: az anion moláris fajlagos vezetıképessége [cm 2 Ω -1 mol -1 ]

Λ m = Λ0 kc 1/ 2 Kohlrausch második törvénye: erıs elektrolitok Λ 0 : végtelen híg oldat moláris fajlagos vezetıképessége [cm 2 Ω -1 mol -1 ] c: elektrolit koncentrációja [M] k: állandó [M -1/2 ] ion vándorlását végtelen híg elektrolitoldatban F e =z i e E F e : elektromos erı z i : az i komponens töltésszáma e: az elemi töltés E: az elektromos térerısség [V cm -1 ] súrlódás miatt F s =k η v i 0 k: állandó [cm] η: az oldat viszkozitása [Pa s] v i0 : az i komponens vándorlási sebessége a végtelen híg oldatban Stokes-törvény: k=6πr F e =F s v 0 i = zie 6πηr i E r i az i ion hidrodinamikai sugara A vándorlási sebesség egyenesen arányos a térerısséggel.

µ i = µ = i µ eff i vi E zie 6πηr = i q eff 6πηR mozgékonyság híg oldat, gömb alakú részecske valóság: iont körülvevı ionok gátolják a mozgását (elektrosztatikus kölcsönhatások) µ i eff : effektív elektroforetikus mozgékonyság q eff : az ion effektív töltése R: az ion teljes sugara az elektroforetikus mozgékonyság függ: az ion töltésétıl (lehet pozitív ill. negatív töltésének elıjelétıl függıen) sugarától alakjától szolvatáltságának mértékétıl a közeg viszkozitásától ph-jától, ionerısségtıl hımérséklettıl

üveg felület & víz: szilanol csoportok ph > 2,5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak: negatív elektród (katód) felé mozognak: folyamatos áramlás (dugószerő áramlási profil)

PC D E D K E P outlet V P inlet A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza E: elektród; K: kapilláris; D: detektor, P: puffertartó edény; PC: személyi számítógép; V: tápegység

E L E K T R O F E R O G R A M kation µ a : látszólagos mozgékonyság µ e : effektív mozgékonyság µ EOF : elektroozmotikus áramlás µ a = µ e + µ EOF semleges molekula anion Alapeset: bemenet: + kimenet: - kation: komigrál anion: kontramigrál

D katód (-) anód (+) EOF v k v a outlet V inlet

anód (+) D EOF v k v a katód (-) outlet V inlet Fordított polaritás: bemenet: - kimenet: +

A kapilláris követelmények: kémiailag és elektromosan inert hajlékony kellıen szilárd megfizethetı ne nyeljen el az UV-Vis tartományban kvarc kapilláris (poliimid bevonattal) 25 µm - 100 µm 10 100 cm bevonatos kapillárisok: polimerek, PVA, teflon Kondícionálás: üvegfelület helyreállítása (NaOH)

megfelelı érzékenység kimutatási határ kicsiny zajjal nagy linearitási tartománnyal gyors válaszidıvel A detektor Többféle mérési elv UV-Vis fluoreszcencia vezetıképesség MS UV-Vis: egyszerő, olcsó, széleskörben alkalmazható

UV-Vis Lambert-Beer: A=εcl háttérelektrolit elnyelése

fényút hosszának növelése

fluoreszcencia

A tápegység U=5-30 kv I=3-300 µa A feszültség változtatásának hatása: növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget: nı a térerısség nı az EOF csökkennek a migrációs idık élesebb csúcsokat kapunk növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget: nı az áramerısség egyre több hı szabadul fel (Joule-hı) kiszélesednek a csúcsok csúsznak a migrációs idık célszerő nagyobb feszültségen dolgozni célszerő kisebb feszültségen dolgozni

I U

Mintabevitel hidrodinamikai injektálás: nyomás alkalmazása elektrokinetikus injektálás: feszültség alkalmazása elektroforetikus mozgékonyságtól függ

pufferekkel szemben támasztott követelmények: nagy pufferkapacitás a kiválasztott ph-tartományban kis elnyelés a detektálás hullámhosszán kis mozgékonyság az áramtermelés minimalizálása érdekében Pufferkoncentráció Csökkentése áram, Joule-hı termelıdés hıáramlás okozta zónaszélesedés elektroozmotikus áramlás meghatározás idıtartama adszorpció a kapilláris falán Növelése

ph: szilanolcsoportok protonáltsága (felületi töltésállapot) minta disszociációja

Áramlási profil EOF lamináris áramlás áramlás hajtóereje a kapilláris belsejében mindenütt azonos lamináris áramlási profilból eredı zónakiszélesedés a kapilláris elektroforézisnél elhanyagolható

Szelektivitás: puffer minısége, koncentrációja ph Elınyök rövid analízis idı nagy felbontóképesség (N: 10 5-10 6 ) kicsiny oldószerfelhasználás egyszerő mintaelıkészítés Hátrányok: kisebb érzékenység kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák)

ALKALMAZÁSOK: bármi, ami befér a kapillárisba Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari Környezetvédelmi

Minıségi analízis Alapja: a retenciós idı a minta komponenseinek minıségétıl függ A legegyszerőbb módszer: a retenciós idık (pontosabban a redukált retenciós idık) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével jel relatív retenció (r x,r ): a kísérleti körülmények különbözıségébıl származó eltéréseket kompenzálja egy kiválasztott (r) anyagra vonatkoztatott redukált retenciós idı hányadosaként adnak meg: ' r x, r = t t R ' R x r t x idı jel t r t x idı

Mennyiségi értékelés a kromatogramon levı csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával. Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak mérése 1. kalibrációs módszer 2. addíciós módszer 3. belsı standard módszer

A kalibrációs módszer T = mc jel c 1 T 1 T: csúcs területe c: koncentráció (anyagmennyiség) m: arányossági tényezı (érzékenység) idı 1. független standard (kalibráló) oldatok jel T ismeretlen oldat: T x c 2 T 2 T 3 T x idı T 2 jel c 3 T 3 T 1 m c 1 c 2 c x c 3 c idı

Standard addíció jel c x T x T 1,x = T x +T 1 T 1 =T 1,x -T x idı T T 2,x = T x +T 2 T 2 =T 2,x -T x jel c x + c 1 T 1,x T 2 T 1 T x jel idı c 2 + c x T 2,x c x c 1 c 2 c idı

Belsı standard: relatív terület meghatározása a mintán belüli referencia rögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához hozzáadjuk a referencia anyagot a referencia anyag csúcsára vonatkoztatjuk a meghatározni kívánt csúcsok területét Elınyök: az analízis során fellépı hibák egy részét küszöböli ki: adagolás érzékenység változása

Analitikai információ: minıségi: retenciós (migrációs) idı retenciós (migrációs) idı függ: alkalmazott körülmények: mozgófázis anyagi minıség áramlási sebesség állófázis minıség hossz hımérséklet ph, ionerısség stb minıségi információ: UV-Vis: spektrum Növekvı igények: új detektorok alkalmazása, fejlesztése r x, r = Tömegspektrométer t t ' R ' R x r

Tömegspektrometria (MS) Nobel-díj: 1922, 1989, 2002 Alapelve: a gázállapotú ionizált molekulákat, ezek töredékeit (un. fragmenseit) vagy bizonyos esetekben az atomokból képzıdött ionokat tömegük alapján szétválasztja, majd mennyiségileg meghatározza 1. mintabevitel és a minta gázállapotba hozása 2. ionizáció és bizonyos esetekben fragmentáció 3. a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 4. a szétválasztott, különbözı tömegő ionok mennyiségének meghatározása A készülék felépítése: vezérlı- és adatfeldolgozó rendszer mintabevitel ionforrás analizátor detektor vákuumrendszer

A vákuumrendszer 1. az ionforrásban megfelelı hatékonysággal elı állíthatók legyenek az ionok 2. megfelelı hosszúságú szabad úthosszat kell biztosítani: az ionforrásban képzıdött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba kétlépcsıs nyomáscsökkentés: 1. elıvákuum: néhány torr 2. nagyvákuum: 10-3 Pa kb. 10-3 Pa vákuumszivattyú: 1. atmoszférikus nyomásról képes közvetlenül gázt elszívni (rotációs szivattyúk) 2. mőködéséhez un. elıvákuum megteremtése szükséges (diffúziós szivattyúk)

Olajrotációs pumpa

elınye: kicsiny háttérzaj

Elıny: Kicsiny molekula tömegő eluens (pl. H 2 ) is hatékonyan eltávolítható

Ionizációs módszerek lehetıvé teszik a különféle halmazállapotú, igen eltérı tulajdonságokkal bíró anyagféleségek ionizációját Elektronionizáció (electron impact ionization, EI) legáltalánosabban alkalmazott ionizációs technika

EI 1: mintabevezetı nyílás; 2: ionvisszaverı lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezetı nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépı nyílás; 8: ionképzıdés helye; 9: anód U=5-100 V

T 200 o C p 10-8 -10-9 atm EI elektronok U energia molekula gerjesztett molekula elektron emisszió molekulaion fragmens ionok fragmentáció: elektronok energiája (gyorsító feszültség: 70 ev) minıségi azonosítás (ujjlenyomat) általában : egyszeres pozitív ionok képzıdnek negatív ionok: nagy elektronegativitású atomok vannak jelen a molekulában

Kémiai ionizáció (CI) a mintát az elektronforrásba történı belépése elıtt un. reagens gázzal hígítják nem a vizsgálandó minta lép közvetlen kölcsönhatásba az elektronokkal, hanem a hígító gáz molekulái mintát alkotó komponensek: szekunder ionizáció RH e - RH + RH + + M MH + + R protontranszfer primer-ion képzıdés CH 4 + e = CH 4+ + 2e (CH 3+ ) szekunder-ion képzıdés CH 4+ + CH 4 = CH 5+ + CH 3 (CH 3+ + CH 4 = C 2 H 5+ + H 2 ) a) proton transzfer CH 5+ + MH = CH 4 + MH 2 + b) hidrogén absztrakció CH 3+ + MH = CH 4 + M + (C 2 H 5+ + MH = C 2 H 6 + M + ) c) töltésátvitel CH 4+ + MH = CH 4 + MH +

Kémiai ionizáció (CI) Reagens gáz: metán i-bután ammónia Ionizáció: a hígító gáz minıségétıl függıen Elınyök: egyszerősíti a tömegspektrumot molekulaion tömegét adja meg [M+H] +, [M-H] -, [M+NH 4 ] +

Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák (atmoszférikus nyomáson mőködnek) minta T elpárologtatás ionizálás kapcsolt technikák: HPLC-MS termikus ionizáció elektromos tér okozta ionizáció ionütközés okozta ionizáció gyors atom ütközési

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) MINTA + mátrix (ionizációt segíti) grid T a r g e t hν laser + Gas phase ions + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Time-of fligth tube + + U acc source

Analizátorok az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása Jellemzése: 1. maximális tömegszám: amelynek vizsgálatára még alkalmas az adott analizátor 2. transzmisszió: a detektort elérı és az ionforrásban keletkezett ionok hányadosa 3. felbontás: az analizátor mekkora tömegkülönbséggel tud elválasztani két iont szektor típusú kvadrupól ioncsapdás repülési idı analizátor

Szektor típusú analizátorok Ionok elválasztása: Mágneses tér vagy a gyorsító feszültség változtatása ionnyaláb mágnes E= qu=zeu E kin = ½ mv 2 ½ mv 2 = zeu v = 2zeU m ionforrás detektor Lorentz-erı F L = zevb F c = mv 2 /r F L = F c mv 2 /r= zevb r = mv 2 zevb r = mv/(zeb) = (m/z) (v/eb)

Elektrosztatikus analizátor egyszeres fókuszálás: felbontása korlátozott

kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás

Kvadrupólus analizátorok olcsó, egyszerően kezelhetı, stabilis, reprodukálható tömegspektrumot eredményezı analizátor 1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszőrt ionok útja 3: az analizátor által átengedett ionok útja; 4: detektor

egymással szemben elhelyezkedı rudakat elektromosan összekötve azokra egyenés váltóáramot kapcsolva kvadrupoláris változó elektromos tér alakul ki az ionok oszcilláló mozgást végezve haladnak át oszcilláció amplitúdója függ: ion töltése ion tömege alkalmazott feszültségek Ioncsapdás analizátor: (IonTrap) módosított kvadrupólus analizátor tárolni tudja az ionokat

Repülési idı analizátorok azonos kinetikus energiájú ionok sebessége vákuumban, külsı elektromos vagy mágneses teret nem tartalmazó közegben, tömegük négyzetgyökével fordítva arányos ionforrás U Ionok (egyenlı mozgási energia) repülési csı (tér mentes) Kisebb tömegő ion: nagyobb sebesség v = 2 zeu m

Tandem MS MS/MS Q/Q/Q (TRIPPLE QUAD) Q/TOF TOF/TOF szerkezetvizsgálat minıségi azonosítás Tandem in space : QQQ, QTOF in time : IT MS n

Detektorok az analizátor által elválasztott, adott idı alatt becsapódott ionok számát határozza meg pontdetektor: az ionok egymást követıen érik el a detektor ugyanazon pontját Csak olyan analizátorral alkalmazható együtt, amely képes az ionokat idıben elválasztani egymástól: pl. kvadrupólus Elektronsokszorozó: 1. a fókuszált ionnyaláb egy un. konverziós dinódába ütközve onnan elektronokat lök ki 2. kilökıdött elektronokat megfelelı feszültséggel gyorsítjuk 3. újabb és újabb felülettel ütköztetve megsokszorozott elektronáramot kapunk fotokonverziós detektorok: a becsapódó ionok hatására kilökıdött elektronokat szcintillátor segítségével fotonokká alakítjuk, majd a kibocsátott fotonokat fotoelektronsokszorozóval elektromos jellé alakítjuk jobb hatásfok, hosszabb élettartam és kisebb karbantartási igény

Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidıben érik el a kilépırésnél elhelyezett detektor sort drága: magasabb árfekvéső készülékekben alkalmazzák (TOF, szektor)

Kapcsolt technikák valós minták: komplex, sokkomponenső rendszerek A pontos és megbízható minıségi és mennyiségi analízis elképzelhetetlen a mintát alkotó komponensek elválasztása nélkül. elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges A hagyományos kromatográfiás technikák azonban még tökéletes szeparáció esetén sem kínálnak abszolút biztonságos minıségi azonosítást. minıségi információ: csak az adott komponens retenciós viselkedése a manapság megkövetelt megbízható és reprodukálható meghatározások indokolják a tömegspektrometria és az elválasztástechnikai módszerek kombinálását

A következı feltételeknek kell teljesülnie ahhoz, hogy a két, meglehetısen eltérı körülmények között mőködı módszert kapcsolni tudjuk egymáshoz: A kombináció ne vezessen kromatográfiás hatékonyság csökkenéshez. A kromatográfból a tömegspektrométerbe történı bevezetés során a minta alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe. A minta megfelelı mennyisége bejusson és ionizálódjon a tömegspektrométerben. A kromatográfot és az MS-t összekapcsoló un. interfész ne növelje számottevıen a háttérzajt. Az interfész legyen egyszerő felépítéső, könnyen használható, tisztítható és karbantartható valamint lehetıség szerint olcsó. Az interfész legyen kompatibilis valamennyi kromatográfiás körülménnyel (pl. vivıgázok, oldószerek, áramlási sebesség, ph, hımérséklet, stb.). Az interfész ne korlátozza az MS nyújtotta lehetıségeket (pl. ionizáció, vákuum, felbontóképesség, stb.). Az interfész alkalmazásával nyert eredmények reprodukálhatók legyenek.

HPLCMS Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák ESI (ElectroSpray Ionization) Nobel-díj

ESI az oldatbeli ionok gázfázisba juttatása COULOMB FISSION ION EVAPORATION

APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) nem szükséges ionok jelenléte az oldatban elektromos kisülés: szekunder ionizáció

CEMS