Duna-víz extrahálható komponenseinek meghatározása GC-MSD rendszerrel A gyakorlat az előző évi kötelező műszeres analitika laborgyakorlat gázkromatográfiás laborjára épít. Az ott szerzett ismeretek a gyakorlat során a beugró részét képezhetik. Amennyiben az előző évi gyakorlatleírás nem áll rendelkezésére, a szükséges információk A gázkromatográfia alapjai c. dokumentumban találhatók. Gyakorlatvezető: Novák Márton (marton.novak@ekol.chem.elte.hu) I. Elméleti áttekintés 1. A gázkromatográfia alapjai (emlékeztető az előző félévről) A kromatográfiás eljárások célja valamely összetett elegy komponenseinek szétválasztása. Alapja a komponensek két fázis közötti ismételt megoszlása, az elválasztás a komponensek eltérő megoszlási hányadosa következtében jön létre. Más ismert megoszláson alapuló elválasztási folyamatoktól (folyadék-folyadék extrakció, stb.) a kromatográfiás eljárások abban különböznek, hogy a két egymással nem elegyedő fázis közül az egyik mozgásban van (mozgófázis), míg a másik helyhez van kötve (állófázis). A gázkromatográfiában a mozgófázis mindig gáz. Ha az állófázis szilárd adszorbens, akkor gáz-szilárd adszorpciós kromatográfiáról (GSC), ha folyadék, akkor gáz-folyadék megoszlási kromatográfiáról (GLC) beszélünk. A használatos oszlopok lehetnek pl. töltetes oszlopok, itt GSC esetén a szilárd fázist töltik a csőbe, míg GLC esetén a folyadék állófázist egy inert felületű szemcsés anyagra juttatják, és az így nyert töltetet teszik a kolonnába. Ma a jobb felbontás miatt főleg kapilláris oszlopokat használnak, itt az állófázis az oszlop belső falához van rögzítve. A gázkromatográf részei a gázrendszer,az injektor, a termosztát (benne az oszloppal), a detektor és a számítógépes adatfeldolgozó rendszer. A vivőgáz (mozgófázis vagy eluens) folyamatosan áramlik az oszlopon, az injektor ebbe az állandó vivőgázáramba juttatja be a vizsgálandó mintát. A mérés közben a kolonna termosztált térben van elhelyezve. Aszerint, hogy a kolonna hőmérséklete állandó, vagy valamilyen 1
program szerint változik, beszélhetünk izoterm, illetve hőmérsékletprogramozott gázkromatográfiáról. A hatékony elválasztás megkívánja, hogy a mintaadagolás pillanatszerű legyen. Ennek érdekében különböző injektortípusokatalkalmaznak (oncolumn, split-splitless, programozottan fűthető injektorok). Az injektálástól a detektálásig eltelt időt nevezzük az adott komponens retenciós idejének (t R ). Ennek az időnek egy részét az anyag a vivőgázban tölti, másik részét pedig az állófázisban. A holtidő (t 0 ) azon komponensek retenciós ideje, amelyek nem lépnek kölcsönhatásba a folyadékfázissal,hanem egyszerűenáthaladnak a vivőgázzal az oszlopon. A holdidőt a vivőgáz lineáris áramlási sebessége és kolonna hossza határozza meg. A állófázissal kölcsönhatásba lépő komponensek hosszabb-rövidebb időt töltenek a folyadékfilmben a megoszlási hányadosuknak (K) megfelelően, így jön létre az elválasztás. Ideális esetben a nagy sebességgel beinjektált minta komponensei csak nagyon szűk sávot töltenek ki a kolonnán és igen keskeny csúcsként detektálhatók. A gyakorlatban a kezdeti szűk sáv számos fizikai folyamat révén kiszélesedik. Ennek következtében, ha két komponens retenciós ideje el is tér egymástól (különböző K érték) a diffúzió okozta átfedés miatt nem biztos, hogy a kolonna végéhez érve is teljesen el tudnak különülni. A megfelelő elválasztás érdekében az elválasztandó komponensek tulajdonságainak (polaritás, illékonyság, stb.) és mennyiségének megfelelően kell megválasztani az állófázist, az oszlop hosszát, átmérőjét és filmvastagságát. A kolonnából kiáramló (eluálódó) anyagokat a detektor (pl. lángionizációs, hővezetőképességi, elektronbefogásos detektor, tömegspektrométer) folyamatosan érzékeli.a kapott kromatogram tehát a detektor által szolgáltatott jel az idő függvényében. 2
2. A tömegspektrométer, mint gázkromatográfiás detektor A tömegspektrométer egyrészt univerzális detektor, mivel minden olyan anyagra, ami a detektortérbe kerül, jelet ad; másrészt azonosító detektor, mivel a válaszjel (tömegspektrum) alapján az egyes komponensek azonosíthatóak is (vs. TCD, FID, ECD). A tömegspektrometria nagy érzékenységű (akár fg!), valamint jól kombinálható elválasztástechnikai módszerekkel, így például gázkromatográfiával (GC-MS), folyadékkromatográfiával (LC-MS) vagy kapilláris elektroforézissel (CE-MS) megfelelő interface hozzákapcsolásával. Nagy előnye a tömegspektrométernek, hogy a mintából származó a célkomponenssel koeluálódó egyéb szennyezők a mennyiségi meghatározás során csak akkor zavarnak, ha ionjaik megegyeznek a meghatározni kívánt vegyület ionjaival (vs. FID). Hasonlóan, a mérendő vegyületek teljes elválasztása sem szükséges abban az esetben, ha a jellemző ionjaik különbözőek. 3
A tömegspektrométer részei: Vákuumrendszer Míg a gázkromatográfok atmoszférikus nyomáson (1-3 atm) üzemelnek, addig a tömegspektrométer nagyvákuumban (10-6 Pa ~ 10-5 torr) működik, mivel a legkisebb szabad úthossznak legalább akkorának kell lennie, hogy az ionforrásban keletkezett ionok a detektorig más molekulával való ütközés nélkül jussanak el. A két egység között tehát kb. nyolc nagyságrendnyi nyomáskülönbséget kell létrehozni. Ezt általában két lépésben hajtják végre, elővákuum létrehozására rotációs szivattyút, a nagyvákuuméra diffúziós vákuumszivattyút vagy turbomolekuláris szivattyút alkalmaznak. Transzfer line A kapilláris oszlop végső kb. 20 cm-es szakasza vezet át a gázkromatográfból a tömegspektrométer felé az ionforrásba, ezt nevezik transzfer line-nak. Annak érdekében, hogy a mérendő komponensek ne kondenzáljanak itt, ezt a szakaszt külön termosztálják, így hőmérséklete legalább akkora, mint a hőprogram végső hőmérséklete. A transzfer line-t azonban nem szabad felfűteni az oszlop maximális hőmérséklete fölé, hiszen akkor degradálódik ezen a részen az állófázis. Tömegspektrométer detektor esetén vivőgázként általában nagy tisztaságú, 5.0-ás héliumot használnak. A hidrogént nagy diffúziós állandója miatt a vákuumszivattyú nehezen tudja eltávolítani, és bár az újabb készülékek képesek rá, a spektrum zajosabb lesz, mint hélium vivőgáz esetén. Ionforrás Az ionforrás az oszlopról eluálódó molekulák ionizációját végzi el. A GC-MS-ben leggyakrabban használt ionizációs technika az elektronütközéses ionizáció(ei), ezt használjuk a gyakorlaton is. Ennek során az oszlopról eluálódó molekulákat nagy energiájú elektronok segítségével ionizáljuk. Az ütközés hatására kiütődik egy elektron molekulából, így molekulaion (M + ) keletkezik, valamint gyökvesztéssel keletkezhetnek kisebb tömegű ún. fragmensionok (F + ). 4
A tömegspektrum nem más, mint az intenzitás a tömeg/töltés (m/z) arány függvényében. Fontos kiemelni, hogy a fragmensek tömege és intenzitása jellemző az adott anyagra, így azonos körülmények között végzett ionizáció esetén az azonosítás spektrumkönyvtárak segítségével elvégezhető. (Megjegyzés: elvileg kétszeres töltésű ionok is keletkezhetnek, de ez elektronütközéses ionizáció esetén elég ritka. Emiatt noha pontosan tömeg/töltés arányt kellene mondani, gyakran csak tömegre hivatkoznak.) Mivel az elektronütközéses ionizáció erősen fragmentálja a molekulákat, gyakran a molekulaion meg sem jelenik, ezért bizonyos feladatok esetén a lágyabb, kémiai ionizációs (CI) technikát használják. Ennél az EI-hez hasonló módon létrehozott, ionizált reagensgázzal (metán, izobután, ammónia) ütköztetjük az eluálódó molekulákat, azonban így a molekuláknak jóval kisebb energia adódik át, és nem fragmentálódnak jelentős mértékben. A tömegspektrum vonalszegény, azonban a molekulaion (esetleg kvázimolekulaion) többnyire egyértelműen azonosítható. Fontos kiemelni azt is, hogy a CI sokkal szelektívebb, mint az EI, mivel a reagensgáz anyagi minőségétől függ, hogy képes-e ionizálni az adott molekulát. A képződött ionokat megfelelő potenciálokra kapcsolt lencsék, ún. ionoptika juttatja tovább az analizátor felé. Analizátor Az analizátor a különböző m/z értékű ionok szétválasztását végzi. Működési elvét tekintve sokféle analizátor-típus létezik (pl. kvadrupól, ioncsapda, repülési idő-, mágneses eltérítésű tömeganalizátorok), azonban kromatográffal történő alkalmazhatóságukat olyan paraméterek is megszabják, mint a sebesség, az ár vagy a méret. GC-MS technikáknál legelterjedtebb a kvadrupól, a gyakorlaton használt készülék is ezzel rendelkezik. A kvadrupól analizátorban négyhiperbolikus fémtest van egy képzeletbeli négyzet alapú oszlop éleire elhelyezve, melyekre megfelelő egyenfeszültséget kapcsolnak, továbbá a két-két egymással szemben elhelyezkedő rúdpárra egy-egy szinusz-potenciált. A rudakra kapcsolt egyen- és váltófeszültség 5
eredményeképpen adott időpillanatban csak egy adott m/z értékű ion haladhat át az analizátor tengelyével párhuzamosan a detektor felé. Detektor A detektor tulajdonképpen egy ion-elektron átalakító, amelyben a becsapódó ionok szekunder elektronokat váltanak ki, ezek száma a fotoelektronsokszorozó mintájára növekszik, ennek megfelelően igen kis anyagmennyiségek is mérhetőek. 3. Adatgyűjtés, kiértékelés A készülék vezérlése és az adatgyűjtés teljes mértékben számítógéppel történik. A készülék kétféle adatgyűjtési módban használható, ezek a SCAN és SIM. A SCAN módban egy előre megadott tömegtartományt pl. 50-550 ATE (atomi tömegegység, dalton, angolul atomicmass unit, AMU) pásztázunk folyamatosan. Ebben az esetben az analizátor elektonikája a kvadrupól megfelelő fémtesteire a kiindulási m/z-nek megfelelő potenciálokat generál, majd aezen potenciálok mértékét megfelelően lépteti ahhoz, hogy egyesével csökkentse az analizátor m/z áteresztését, s így végigpásztázzuk 0,1 tömegegységenként az általunk meghatározott tömegtartományt. Mivel az ionizáció, tömeganalizálás és detektálás időigénye kisebb, mint egy kromatográfiás csúcs elúciója, ezért egy csúcs elúciós ideje alatt is többször végigpásztázhatjuk a választott tömegtartományt. Átlagos esetben az MSD 1 másodperc alatt 3-szor vesz fel egy teljes spektrumot, azaz egy SCAN felvétel ideje kb. 0,006 perc, így az MSD megfelelően gyors a kromatogram felvételéhez. A felvett kromatogram valójában három dimenziós. Az x tengelyen minden egyes időpillanathoz tartozik egy tömegspektrum, mely mint y tengely jelenik meg. A 6
ztengelyen az intenzitások szerepelnek. A képernyőn megjelenő kromatogram (TIC, Total Ion Cromatogram) nem más, mint egy adott időpillanatban a teljes tömegtartományban az intenzitások összege. Az azonosítás a kiválasztott csúcs tömegspektruma alapján történik, melyet egy adatbázissal hasonlítunk össze. Amennyiben SCAN módban felvett kromatogramokból kívánunk mennyiségi információt kapni, akkor egy, a komponensre jellemző, megfelelően intenzív ion csúcsterületét vizsgáljuk az alkotó ismert koncentrációja függvényében. Fontos kiemelni, hogy izomerek esetén az azonosítás pusztán a tömegspektrum alapján csak ritkán végezhető el, ezekben az esetekben a kromatográfiás elválasztás, ezzel együtt a retenciós idő is a minőségi azonosítás alapját képezi. A detektor másik adatgyűjtési módszere a szelektív ionkövetés (SIM, selected ion monitoring) üzemmód. Ebben az esetben ismernünk kell a mérni kívánt anyagok retenciós idejét és jellemző ionjait a korábbi SCAN felvételek vagy spektrumkönyvtári adatok alapján. Ekkor a molekulánk retenciós ideje körül egy megfelelő szélességű időablakot választunk ahhoz, hogy a csúcs előtt és után mérjünk alapvonalat is a biztos integráláshoz. Ebben az időablakban komponensenként maximum 4 m/z-t (fragmenst) követünk, ami a mérendő vegyületünkre jellemző, azaz a spektrum maximum 4 intenzív, karakterisztikus ionját választjuk ki. Ezzel a módszerrel nagyjából 1-1,5 nagyságrend 7
növekedés érhető el a kimutatási határokban a SCAN módhoz képest, azonban a minőségi kiértékelésünk biztonsága valamelyest csökken. SIM módban a minőségi azonosítás alapját a választott ionok megfelelő aránya biztosítja. A mennyiségi kiértékelés alapja szintén egy, a komponensre jellemző, megfelelően intenzív ion csúcsterülete. 8
4. Minta-előkészítés A szilárd fázisú extrakció (SPE) egy minta-előkészítési technika. A vízmintát egy szilárd halmazállapotú, szemcsés tölteten vezetik át, ahol a kiválasztott töltet felületi csoportjai a dúsítani kívánt komponenseket megkötik, így megakadályozzák, hogy a szilárd fázisról az adott komponensek távozzanak. Nagy mennyiségű vízminta átengedésével jelentős dúsítás érhető el. A különböző analitikai eszközöket gyártó cégek többféle minőségű és kapacitású adszorbenst forgalmaznak. A leggyakoribbak az apoláris vagy poláris csoportokkal módosított szilikagél töltetek és az ioncserélő gyanták. Az apoláris fordított fázisú töltetek C2-, C4-, C6-, C8-, C18-, ciklohexil- vagy fenil-csoporttal módosított szilikon gyanták. A normál fázisú és az ioncserélő tulajdonságú tölteteknél ennél nagyobb a változatosság. Összetett analitikai feladatok megoldására kevert, vagy egy adott vegyületcsaládra specifikus töltött oszlopok is rendelhetők. A szénhidrogének meghatározására alkalmas adszorbensek apoláris, leggyakrabban oktil- vagy oktadecil-csoportokkal (aromásoknál fenil-csoportokkal) módosított szilikagél fázist tartalmaznak. A geometriai megvalósítást tekintve két változat terjedt el: az oszlopos/patronos (cartridge) és a diszkes megoldás. A patron egy 1-70 ml-es üveg vagy polietilén cső, amelyben a szemcsés töltetet két tartóréteg között helyezik el. A töltet mennyisége 25 mg-tól 10 g-ig terjed, a szemcseméret 30-60 m. A szilárdfázisú extrakció főbb munkafázisai a kondicionálás, ekvilibrálás, mintafelvitel, mosás, szárítás és a leoldás (elúció). A kondicionáláskor az oszlop mintával való nedvesíthetőségét növelik meg és a töltet felületi csoportjait megfelelő oldószer átengedésével alkalmassá teszik a kívánt kölcsönhatások kialakítására. Az ekvilibrálás során felkészítjük a töltetet a minta fogadására, szükség esetén beállítjuk a vizsgálandó minta ph-ját, apoláris jellegét (pl. metanol hozzáadásával). A mintafelvitel során az oszlopon átáramló mintából megkötődnek a dúsítandó komponensek, a mosás a nemkívánatos mátrixkomponensek eltávolítását szolgálja. 9
Fontos, hogy a munkafázisoksorán az oszlopon folyamatosan legyen folyadék, ugyanis ha levegő kerül az oszlopra, akkor a továbbiakban már nem lesz megfelelő a nedvesítés. A szárítás során eltávozik az eredeti oldószer maradéka az oszlopról, majd az elúció során a vizsgált komponensek alkalmas oldószer kis mennyiségével szelektíven leoldhatók. Az oszlopon való áthaladási sebességet vákuum segítségével lehet szabályozni. A módszer előnye, hogy kevés oldószert igényel, valamint hogy egy lépésben történik meg az extrakció, a tisztítás és a dúsítás is, ezáltal időigénye is kisebb a bepárlással összekötött folyadék-folyadék extrakciónál. A kiindulási és a végtérfogattól függően, akár 50-300-szoros dúsítás is lehetséges. A módszer megvalósításához használt készülék az alábbi ábrán látható: 10
II. Gyakorlati rész A gyakorlat célja, hogy megismerkedjetek egy napjainkban használatos modern GC-MS rendszer kezelésével, használatával, mérési módszereivel, a kapott kromatogram kiértékelésével. A feldolgozott minta a gyakorlat során Duna-víz, melyet szilárd fázisú extrakciós módszerrel készítünk elő, majd az extraktum komponenseit GC-MS rendszerrel választjuk el és azonosítjuk. 1. Minta-előkészítés: A gyakorlat során 100 ml Duna-vizet dolgozunk fel, melyhez annyi metanolt adunk, hogy a minta 2 (v/v)%-os metanoltartalmú legyen Az analizálandó mintákat az előkészített SampliQ C18 200 mg-os SPE patronon tisztítjuk és koncentráljuk. A szilárd fázisú extrakció menete: Kondicionálás: 10 cm 3 MeOH, 10 ml/min Ekvilibrálás: 10 cm 3 desztillált víz, 2% MeOH, 10 ml/min Mintafelvitel: 100 cm 3, 25ml/min Mosás: 10 cm 3 desztillált víz, 2% MeOH, 10 ml/min Szárítás: 5 min, levegő átszívatás (minimális nyomáson) Leoldás: 3 cm 3 hexán 2. Műszeres mérés: ADuna-víz extrahálható komponenseinek meghatározását GC-MS-sel végezzük el a leírásban szereplő körülmények mellett. - GC: Agilent 6890N & MSD: Agilent 5973 - Vivőgáz: He(tisztaság: 5.0) - Oszlop: HP-5MS 30 m0,25 mm 0,25 m filmvastagság - Injektor hőmérséklet: 250 C - Injektált mennyiség: 1 μl - Injektálás: splitless, 1,5 perces splitless idővel - Áramlási sebesség: 1,2 ml / perc - Hőmérsékletprogram: 50 C (2 perc) 20 C /perc 300 C (5 perc) - Transzfer line hőmérséklet: 300 C, solventdelay: 4,5 perc 11
3. Jegyzőkönyv: A jegyzőkönyv tartalmazza a gyakorlaton elvégzett minta-előkészítést, a főbb kromatográfiás körülményeket, a gyakorlaton rögzített kromatogramokat és a tömegspektumokat. Írd le a SCAN és SIM adatgyűjtési módszerek lényegét és hasonlítsd össze őket mind mérés, mind kiértékelés szempontjából. Milyen feladatra melyik technika alkalmas? Hányszoros dúsítást hajtottunk végre a szilárd fázisú extrakció során? Táblázatosan foglald össze a Duna-vízből kimutatott komponenseket (név, jellemző fragmensek, retenciós idő). 12