Név: Csoport: Dátum: 4. SZÉRUMFEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA ÉS FRAKCIONÁLÁSA (BGY:15-18 old.) A GYAKORLAT CÉLJA:........ Meghatározások: Elméletileg a szérum 60-80 mg/ml fehérjét tartalmaz: 60% (30-50mg/ml) albumin, 40% (20-30mg/ml) globulin Szérum:... Plazma:.... Albumin:... Globulin:. Kisózás:.... Gélszűrés:.... 1
Zavarosodási teszt: Ba 2+ + Cl - + SO 4 2- + NH 4 + = +..+ (melyik anyag a csapadék, húzza alá!) Fehérje meghatározás Biuret-reagenssel Fehérje meghatározás brómkrezolbíborral:....... Hatásfok, hozam (általánosan):....... Elektroforézis:...... A GYAKORLATOK RÖVIDEN: (Részletek a gyakorlati Jegyzetben: 15-18 old.) 1. Globulin kisózás: (Röviden) 3 ml telített ammóniumszulfát-oldatot adunk 3 ml szérumhoz = 6 ml felülúszó = albumin frakció; kb. 5,5 ml csapadék = globulin frakció; 3 ml 0,9 % NaCl oldatban feloldva.. MEGFIGYELÉS: Felülúszó térfogata..ml 2. Albumin sómentesítése Sephadex G-25 oszlopon: Pipettázzon 1.5 ml albumin frakciót az oszlop tetejére! (ha a felülúszó 5,5ml volt akkor: 5,5 ml/1,5 ml=3,33, tulajdonképpen 3 ml szérum 1/3-ad albumin része) Szedjen 20 x 3 ml frakciót 20 kémcsőbe.(ezek a csövek az 1,.5 ml albumin felülúszóból származó albumint tartalmazzák.) Mérje meg a fehérje koncentrációt (minden egyes frakcióból) majd figyelje meg a zavarosodás mértékét minden egyes frakció esetén! 2
3. Fehérje koncentráció meghatározása a szérumban és a szérumfrakciókban biuret-reakcióval MÉRÉSEK/ADATOK/ SZÁMÍTÁSOK: A, referencia sor standard oldattal: 10 mg/ml humán szérum albumin oldat. 1. 2. 3. 4. 5.vak 10 mg/ml fehérje standard oldat (ml) 0,050 0,100 0,150 0,200 - *fehérje tartalom (mg) 1 0 A 540 (30 perc inkubálás után!!) A 540 -A 540 vak - *Számítsa ki minden kémcső fehérje tartalmát az ismert koncentrációjú standard oldat (10mg/ml) és a hozzáadott térfogat (0.1ml) és a végső térfogat (1ml) segítségével. E.g #2 kémcső: 0,1ml/1ml x 10mg/ml = 1mg és így tovább Ábrázolja: A 540 -A 540vak (y) vs. mg fehérje a kémcsőben (x), és számítsa ki a meredekséget! Meredekség = (GRAFIKON) 3
B. összegyűjtött frakciók Készítsen elő 22 megszámozott kémcsövet! Pipettázzon 0,2 ml a korábban összegyűjtött 20 frakcióból (pl. #1-es frakcióból pipettázzon 0,2 ml-t egy új #1-es számú csőbe, a #2-es frakcióból egy új #2-es kémcsőbe. stb.). Adjon hozzájuk 0,8ml Biuret reagenst, keverje össze, és 30 perc állás (szobahőn) után 540 nm en mérje le az abszorbanciát! Miután kivett 0,2 ml-t minden frakcióból, pipettázzon 0,2 ml BaCl 2 -oldatot a megmaradt frakciókhoz.. Jelölje X-ekkel a zavarosodás mértékét. Kémcső 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Albumin frakciók 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 ( ml) Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-A vak (ref. sorból származó vak) Zavarosodás x-xxxxx *Albumin tartalom 0.2ml - ben (Xmg) **Albumin tartalom 3ml -ben (15x X mg) Kémcső 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Albumin frakciók ml 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-A vak Zavarosodás x-xxxxx Albumin tartalom 0,2ml -ben (Xmg) * Albumin tartalom 3ml-ben (15x X mg)** A 20 kémcső össz. albumin tartalma *** Ʃ 1+2+..stb mg *Számolja ki a fehérje tartalmat: (A-A vak )/meredekség **A teljes fehérje tartalom kiszámítás :(pl. ha 0.2 ml X mg-ot tartalmaz, akkor, 3ml 3/0,2=15 x X mg fehérjét tartalmaz frakciónként ***Adja össze = ez fogja megadni a gélszűrés során összegyűjtött teljes albumin tartalmat 4
C, Szérum minták Készítsen elő 2 megszámozott kémcsövet! (21, 22. minta). Pipettázzon 0,02 mlt a szérumból a csövekbe! Adjon hozzájuk 0.180 ml NaCl-t és 0,8ml Biuret reagenst, keverje össze, és 30 perc állás (szobahőn) után 540 nm en mérje le az abszorbanciát! #21 #22 szérum (ml) 0,02 0,02 Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-A vak *Fehérje tartalom 0,02ml-ben (Y mg) ** Fehérje tartalom 3ml szérumban (150 x Y mg) A két párhuzamos átlaga A szérum fehérje tartalma (mg/ml): *A fehérje tartalom kiszámítása: (A-A vak )/ meredekség; **A teljes fehérje tartalom kiszámítása 3 ml szérumban: ha 0,02ml szérum Y mg fehérjét tartalmaz, akkor 1ml szérum 1:0,02=50-szer több mg-ot tartalmaz, akkor 3ml szérum 3/0,02=150xYmg fehérjét tartalmaz. D, globulin minták Készítsen elő 2 megszámozott kémcsövet! (23, 24. minta). Pipettázzon 0,04 mlt a visszaoldott globulinból a csövekbe! Adjon hozzájuk 0.160 ml NaCl-t és 0,8ml Biuret reagenst, keverje össze, és 30 perc állás (szobahőn) után 540 nm en mérje le az abszorbanciát! #23 #24 globulin (ml) 0,04-0,04 - Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-A vak *Fehérje tartalom 0,02ml-ben (Z mg) ** Fehérje tartalom 3ml szérumban (75 x Z mg) A két párhuzamos átlagértéke (mg) A szérum globulin tartalma (mg/ml): *A fehérje tartalom kiszámítása:: (A-A vak )/meredekség; **A tiszta globulin frakció fehérje tartalma: (3ml oldatban feloldott csapadék): ha 0.04ml Z mg globulint tartalmaz, akkor 1ml 1/0,04=25-ször több mg-ot tartalmaz így 3ml - 3/0,04=75xZmg globulin. 5
4. Albumin meghatározása brómkrezolbíborral Röviden írja le a lépéseket! A, referencia sor 10 mg/ml humán szérum albumin oldat. 1. 2. 3. 4. 5. 6.vak fehérje standard (ml) 0,050 0,0750 0,10 0,150 0,200 - fehérje (mg) 1 0 A 620 A 620 -A 620 vak - Számolja ki minden cső albumin koncentrációját.pl.: 3-as cső 0,1 ml x10mg/ml=1mg, Ábrázolja: A-A vak (y) vs. mg fehérje/cső (x), Meredekség = (GRAFIKON) B, Albumin meghatározása szérumban brómkrezolbíborral: Cső 1. 2. szérum (ml) 0,10 0,10 A 620 A 620 -A 620vak *mg albumin/0,1ml szérumban (W mg) mg albumin/3ml szérum (30x W mg) A két párhuzamos átlagértéke (mg) A szérum fehérje tartalma: (mg/ml): *Határozza meg az albuminkoncentrációt a szérumban. (A-A vak )/meredekség) 6
KÉRDÉSEK: 1. Ábrázolja a fehérje koncentrációt (3 ml-ben) (y1) és a frakciók zavarosodását (1-20) (y2) vs. frakciók száma (x)! (grafikon) 2. A fenti ábra alapján milyen következtetést lehet levonni? Mennyire volt sikeres a kisózás (fehérje tisztítás)? Magyarázat!.. 3. Az összegyűjtött frakció hány százaléka az oszlopra felvitt fehérjének? (A gélszűrés hatásfoka, hozama): 100% a gélre felvitt albumin = 1.5 ml felülúszóban található albumin. A kérdés az, hogy mennyi albumint kaptunk a 20 frakcióból? Mindig van veszteség, tehát a hozam nem lehet 100 % vagy több. 3ml szérum albumin tartalma = (150xYmg)-(75xZmg) (korábbi adatok; röviden: szérum mínusz globulin). Mivel a 3 ml szérum albumin tartalmának 1/3-át vittük fel az oszlopra (5.5 ml-ből cask 1.5 ml-t). A felvitt albumin: (150xY-75xZ)/3 A gélszűrés hozama: % ((a fehérje frakciók összege) /150xY-75xZ)/3))x100 Hatásfok, hozam:.% 4. Mennyi az albumin és a globulin koncentrációja a szérumban? Számolja ki a szérum összetételét a brómkrezolbíborral történő meghatározás alapján (mg fehérje /1ml): 1ml szérum teljes fehérje tartalma:...mg 1ml szérum albumin tartalma:..... mg.% (albumin mg/teljes szérum mg) x100 1ml szérum globulin tartalma:...mg..% (100% - albumin%) 5. Hasonlítsa össze a brómkrezolbíborral és a biuret-reakcióval kapott albumin tartalmat! Melyik módszer jobb, specifikusabb? Miért?. 7
5. Szérumfehérjék elektroforézise cellulózacetát-membránon (BGY 17-18.old) demonstráció Minták: human szérum, albumin, gamma globulin, brómfenolkékkel festett albumin (marker). Rajzolja le az eredményt és tüntesse fel az ábrán az alábbiakat: (+, -) pólus, kezdő vonal, meghatározott albumin, globulin frakciók. Összegezze az eredményt egy rövid következtetésben. Következtetések/megfigyelések:....... 8
Albumin és globulin elválasztása (kisózás és sómentesítés) 3ml (NH4) 2 SO 4 +3ml szérum RT 5 min, centrifugálás max rpm/ 20 min? ml felülúszó (albumin+só) 1.5 ml Gélszűrés/ sómetesítés +üledék (globulin) serum +3ml fiz só (Beoldás) Fehérjemérés: (RT 30 min, A 540nm) Szérum (21#;22 #) 0.02ml szérum+0.180mldv+0.8ml Biuret üledék/globulin (23#; 24#) 0.04ml globulin+0.160ml dv+0.8ml Biuret Fraciók/albumin( 1-20#) 0.2ml fració+0.8ml Biuret 20x3ml frakció 0,2 ml kivétele után a maradékhoz adunk 0.2ml BaCl 2 -t (turbidity aassay x-xxxxx) 9