Gerőcs Annamária 1 Farkas Tibor 2 Nemes-Barnás Katalin 3 Májer János 4 Szőke Barna 5 Olasz Ferenc 6 A Badacsonyi Borrégió élesztő mikrobiótájának azonosítása: terroir élesztők izolálása, karakterizálása és borászati hasznosítása Investigating the yeast microbiota of the Badacsony wine region: isolation, characterization of indigenous terroir strains and using in winemaking processes gerocs.annamaria@naik.hu 1 Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ - Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő, intézeti mérnök 2 Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ - Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő, tudományos főmunkatárs 3 Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ - Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő, intézeti mérnök 4 Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ - Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Badacsonytomaj, intézetigazgató 5 Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ - Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Badacsonytomaj, kutatómérnök 6 Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ - Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Badacsonytomaj, intézet vezető BEVEZETÉS Magyarországon a szőlőtermesztés és borkészítés nagy hagyományokkal rendelkezik, számos híres borrégió, illetve borvidék található az ország területén. Az egyik legismertebb hazai borvidékünk a badacsonyi, amely a Dunántúl közepén, a Balaton északi partjának nyugati részén, a Badacsony-hegy környékén található. Területe 1600 hektár, jellemző szőlőfajtái közé tartozik a Szürkebarát, az Olasz és Rajnai rizling, a Rózsakő, a Vulcanus, a Zeus, és a csak erre a tájegységre jellemző Kéknyelű. A mikrobiológiai kutatások eredményei alapján körvonalazódni látszik, hogy a különböző borvidékek nem csak jellemző szőlőfajtákkal, hanem az adott területre specifikus mikroba közösségekkel is rendelkeznek, melyek adaptálódtak az adott környezeti viszonyokhoz (Gilbert et al., 2014). A hagyományos borkészítés során, amikor a mikroorganizmusok a szőlő felületéről, valamint a borkészítéshez használt eszközökről kerülnek a mustba (Romano et al., 2003), a terroir mikrobióta aktívan részt vesz a borok karakterének kialakításában. A szőlő felületén lévő mikrobapopuláció összetételét több tényező befolyásolja: a szőlő fajtája, az időjárási és talajviszonyok, a területen végzett mezőgazdasági tevékenység, pl. az öntözés, a felhasznált fungicidek, szerves- és műtrágyák (Schütz and Gafner, 1993; Shuller et al., 2005). A spontán alkoholos erjesztésben főleg az élesztőgombák vesznek részt, melyek közül a Saccharomyces cerevisiae szerepe a legjelentősebb (Howell et al., 2004), de a fermentáció kezdeti szakaszában a szőlő felületén élő egyéb élesztőgombák (elsősorban Hanseniaspora, valamint Candida, Pichia, Rhodotorula fajok) dominálnak, ezek azonban az etanol koncentráció növekedésének hatására egyre inkább visszaszorulnak. A nem Saccharomyces fajokhoz tartozó élesztők a fermentáció elindítása mellett fontos szerepet játszanak a borok egyedi jellegének kialakításában is, az íz- és illatanyagok szintézisében (Guillanóm et al., 1998), vagy a minőségromlást okozó penészgombák gátlásában (Styger et al., 2011). A modern borászatokban általánosan elterjedt az irányított erjesztés alkalmazása, mely során kereskedelmi forgalomban kapható, úgynevezett starter élesztőkultúrákat használnak. A starter kultúrák alkalmazása révén a fermentációs folyamat jól kontrollálható, lerövidíthető a fermentációs idő és gyorsabb alkoholtermelés érhető el (Sipiczki et al., 2001). Használatuk révén azonban a borok íz- és aromaanyagok által meghatározott egyedi karaktere kevésbé érvényesül, ami a borok uniformizálódásához vezet. 139
A kísérletek során 31 élesztőstartert és 528 izolátumot vizsgáltunk, utóbbiak Kéknyelű és Szürkebarát szőlőbogyóról, különböző erjedési állapotú Kéknyelű mustból, borból és egyéb környezeti mintákból származtak. Vizsgálataink célja az adott területre és szőlőfajtára specifikus élesztők szelektálása, azonosítása, illetve az izolátumok jellemzése, borászati szempontból fontos tulajdonságaik meghatározása, valamint olyan új starter kultúrák fejlesztése, melyek az adott borvidékre specifikus borok egyedi karakterjegyeit kiemelik. ANYAG ÉS MÓDSZER Alkalmazott tápközegek és kiegészítők Az élesztők izolálása és vizsgálata során a következő tápoldatokat és táptalajokat használtuk: Yeast Malt tápleves/agar (YM és YMA, Biolab Zrt., Magyarország), Glucose Yeast Peptone tápleves/agar (YPG), Yeast Carbon/Nitrogen Base agar (HiMedia, India), fermentációs tápleves: 100 ml desztillált víz, 1g glükóz, 2g élesztő kivonat, 0.0016g brómkrezol vörös indikátor. Az agar táptalajok 2% agart tartalmaztak. A baktériumok és penészgombák növekedésének megakadályozása érdekében a táptalajokat az alábbi antibiotikumokkal egészítettük ki (zárójelben az adott kiegészítő végkoncentrációja látható): ampicillin (A; Duchefa, Hollandia; 150 μg/ml), klóramfenikol (C; Duchefa, Hollandia; 20 μg/ml), bifenil (B; Sigma-Aldrich, USA; 150μg/ml). Mintavétel A mintavételezés a NAIK-SzBKI Badacsonyi Kutató Állomás területén a következő helyekről történt: 1., 3. Kéknyelű művelésmód kísérlet 5C 1996 parcella 2., 12. Szürkebarát B.10 5C/E.20/1998-99 jelzésű parcella, 3., Zirczi pince. A begyűjtött mintatípusok az alábbiak voltak: Szürkebarát és Kéknyelű szőlőbogyó, különböző erjedési stádiumban lévő Kéknyelű must, palackozott bor, környezeti minták ( húzott tampon minták). A húzott tampon mintákat tápfolyadékkal (YM+A+B+C) átitatott eszközzel vettük, és a vizsgálatokig tápfolyadékban (YM+A+B+C) tároltuk. A kontamináció veszélyét steril mintavevő eszközök alkalmazásával a lehető legkisebbre csökkentettük, a mintákat sterilen, hűtve szállítottuk a laboratóriumba, ahol azonnal megkezdtük feldolgozásukat. Az elsődleges vizsgálatok után a biológiai mintákat (must, dúsított környezeti minták) -70 ºC-on tároltuk, 20-30% glicerin jelenlétében. Élesztők izolálása A szőlőszemekből steril dörzsmozsárban szőlőlevet készítettünk, amit steril műanyag centrifugacsövekbe öntöttünk. A nyers szőlőléből centrifugálás segítségével eltávolítottuk a sejttörmeléket (1000 rpm, 4ºC, 10 perc). A felülúszóból 2-2 ml alikvotokat vettünk és azokat újra centrifugáltuk, hogy kinyerjük az élesztősejteket (13000 rpm, 4ºC, 5 perc). A centrifugálást követően a csapadékból steril fiziológiás sóoldattal szuszpenziót készítettünk, amit YM+A+B+C táptalajra szélesztettünk. A must mintákból hígítási sort készítettünk, amit YM+A+B+C táptalajra szélesztettünk. A palackozott borokból steril körülmények között 100-200 ml alikvotokat steril főzőpohárba mértünk. A mintákat 0.2 µm pórusméretű filtereken leszűrtük, majd a filtereket kétszer átmostuk 100-100 ml steril fiziológiás sóoldattal. A filtereket egyesével 10-10 ml YM+A+B+C táplevest tartalmazó Petri csészébe helyeztük és az inkubációt követően (30ºC, 48 óra) a mintákat YM+A+B+C agar táptalajra szélesztettük. A környezeti mintákat YM+A+B+C tápfolyadékban inkubáltuk 30ºC-on 48 óráig, majd YM+A+B+C táptalajra szélesztettük és inkubáltuk őket (30ºC, 48 óra). Klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok Az izolátumok csoportokba rendezéséhez elsődlegesen klasszikus mikrobiológiai teszteket végeztünk, ezek segítségével csökkentettük a mintaszámot, és így molekuláris biológiai módszerekkel csak az egyes csoportok 140
reprezentánsait kellett vizsgálnunk. A morfológiai és élettani tesztek alapján egy csoportba sorolt izolátumok között különböző fajokhoz tartozó élesztők is lehetnek, ezért igyekeztünk minél több reprezentánst tovább vizsgálni molekuláris biológiai módszerekkel. A klasszikus mikrobiológiai tesztek közül a következőket végeztük el: morfológia, savtermelés, savtűrés, glükóz (ozmotikus) tolerancia, alkohol tolerancia, szénhasznosítás, nitrogénhasznosítás, fermentációs vizsgálat. Az élettani tesztek közül borászati szempontból különösen fontos a szén-, és nitrogénhasznosítás, illetve a fermentációs képesség vizsgálata. Tenyészetek előkészítése a mikrobiológiai vizsgálatokhoz Az élesztő izolátumokat egy éjszakán keresztül növesztettük YPG táplevesben, 30ºC-on. Az élesztő szuszpenziót Eppendorf csőben centrifugáltuk (2-2 ml alikvot, 5.00 0 rpm; RT; 5 perc), majd az élesztősejteket háromszor átmostuk 1,5 ml steril 0,85% NaCl oldattal. Az utolsó mosási lépés után a sejteket újra szuszpendáltuk steril 0,85% NaCl oldatban, olyan térfogatban, hogy az OD 600 érték 0.1-0.2 legyen. A mintákból a vizsgálatokhoz 5-5 µl-t cseppentettünk a megfelelő agar lemezekre. Szénforrás hasznosítás vizsgálata A szénasszimilációs vizsgálatok célja, hogy megállapítsuk, képes-e egy adott izolátum oxigén jelenlétében a tápoldatban egyedüli szénforrásként rendelkezésre álló szénhidrátot felhasználni. A teszt során a minimál táptalajt (Yeast Nitrogen Base agar) a következő szénforrások egyikével egészítettük ki 2% végkoncentrációban: glükóz, szacharóz, galaktóz, mannóz, xilóz, arabinóz, maltóz, glicerol, ramnóz, cellobióz, maltobióz. Az előkészített tenyészeteket a szénhidrátokkal kiegészített táplemezekre cseppentettük, majd a lemezeket inkubálás után (30ºC, 48 óra) megvizsgáltuk, és értékeltük az eredményt. Nitrogénforrás hasznosítás vizsgálata A nitrogénasszimilációs vizsgálatok során azt vizsgáljuk, hogy egy adott izolátum képes-e oxigén jelenlétében a tápoldatban egyedüli nitrogénforrásként rendelkezésre álló nitrogént felhasználni. A teszt során a minimál táptalajhoz (Yeast Carbon Base agar) különböző nitrogénforrásokat (ammónium-szulfát, lizin, triptofán, nátriumnitrit, kálium-nitrát) adtunk 1% végkoncentrációban, majd az előkészített tenyészeteket a nitrogénforrásokkal kiegészített táplemezekre cseppentettük. Inkubálás után (30ºC, 48 óra) a tenyészeteket megvizsgáltuk, és értékeltük az eredményt. Fermentációs képesség vizsgálata A fermentációs teszt során azt vizsgáljuk, hogy a mikroorganizmus képes-e egy adott szénhidrátot oxigén hiányában etilalkohollá és szén-dioxiddá konvertálni. A fermentációs folyamatot úgy tudjuk nyomon követni, hogy közben detektáljuk a ph változást, és a gázképződést a tápoldathoz adott brómkrezol vörös indikátor, illetve a tenyészetbe elhelyezett Durham csövek segítégével. Az előkészítés során a vizsgált élesztő kultúrát YM+A+B+C lemezeken egyes telepekre szélesztettük, majd az inkubálást követően (30ºC, 48 óra) egy telepet kiválasztottunk, és azzal inokuláltuk az YM tápfolyadékot. Az inkubálási idő leteltével (30ºC, 24 óra) 2-2 ml élesztő szuszpenziót centrifugáltunk (10000 rpm, RT, 5 perc), és a felülúszót eltávolítottuk. A csapadék fázisban lévő élesztősejteket 2-2 ml fiziológiás sóoldatban vettük fel, majd az OD 600 értékeket beállítottuk 0.2 körülire. A fermentációs kísérletet kémcsövekben végeztük, amelyek 6-6 ml fermentációs táplevest tartalmaztak, inokulumként pedig 100-100 µl élesztő szuszpenziót használtunk (OD 0.2). A leoltást követően 1-1 ml paraffinolajat rétegeztünk a tápfolyadék felületére, ami redukálta a gázcserét a 141
folyadék és a környezete között. A kémcsöveket három különböző hőmérsékleten (10-16-26ºC) inkubáltuk 1 héten keresztül, ez alatt naponta monitoroztuk a képződött gáz mennyiségét és a színváltozást. A ph változás és a gázképződés alapján tudtunk arra következtetni, hogy a vizsgált élesztő kultúra fermentálja-e az adott cukrot (glükóz). Molekuláris biológiai azonosítás Az élesztő izolátumok molekuláris biológiai azonosítását PCR alapú technikák segítségével végeztük el. A különböző módszerek érzékenysége, felbontási képessége eltérő, ezért a megbízható rendszertani besoroláshoz ezeket kombináltan, egymás eredményeire építve használtuk fel. A kereskedelmi forgalomban kapható starter kultúrák vizsgálatba vonása lehetővé tette a visszaizolált starter élesztők kiszűrését, illetve ezek a törzsek kontrollként is szolgáltak a különböző tesztek során. Élesztő kultúrák azonosítása az ITS régió nukleotid szekvenciája alapján Az élesztők riboszómális RNS génjében található ITS (internal transcribed spacer; belső átírt köztes szekvencia) régió nukleotid szekvenciájának analízise felhasználható az élesztők faji szintű elkülönítésére. A kiválasztott élesztő kultúrákból a YeaStar DNS tisztító kit segítségével genomi DNS-t izoláltunk a gyártó használati utasítását követve. A preparátumok DNS koncentrációját NanoDrop 1000 spektrofotométer készülék segítségével határoztuk meg. Az ITS régió amplifikálásához polimeráz láncreakció technikát (Polymerase Chain Reaction, PCR) alkalmaztunk, az ITS4 és ITS5 primerek felhasználásával (White et al., 1990). A kapott PCR terméket QIAquick PCR Purification Kit felhasználásával tisztítottuk, majd spektrofotometriásan újra meghatároztuk a DNS koncentrációt. A minták nukleotid szekvenciájának meghatározását a Biomi Kft (Gödöllő) végezte, az Applied Biosystems 3130xl típusú genetikai analizátor, és a hozzá tartozó szoftverek segítségével. A kapott szekvencia adatokat a Chromas Lite (Technelysium Ltd., Ausztrália) és Geneious (Biomatters Ltd., Új-Zéland) programokkal dolgoztuk fel, az izolátumok azonosítását pedig az NCBI (National Centre for Biotechnology Information) GenBank adatbázisban a BLAST program segítségével végeztük el. Starterélesztők azonosítása D1/D2 régió nukleotid szekvenciája alapján A riboszóma nagy alegységét kódoló rrns génben (nuclear ribosomal large subunit rrna gene, LSU) található D1/D2 domain nukleotid szekvenciája szintén felhasználható az élesztők faji szintű elkülönítésére. Az élesztő kultúrákból a fent leírt módon kivontuk a genomi DNS-t, amit ezután az NL1-NL4 primerekkel amplifikáltunk (Kurtzman és Robnett, 1998). A minták nukleotid szekvenciájának meghatározását, az adatok feldolgozását, és az izolátumok azonosítását a fent leírt módon végeztük. Izolátumok és starterélesztők azonosítása a delta régió nukleotid szekvenciája alapján A Saccharomyces fajok genomjában található Ty1 (transposon yeast 1) retrotranszpozon kb. 5.6 Kb hosszúságú, és kb. 30-40 példányban fordul elő sejtenként. A Ty1 széleit határoló ún. delta szekvencia kb. 380 bp hosszúságú DNS szakasz, amely átlagosan 100 kópiában található meg egy sejtben. A delta régiót amplifikáló PCR módszert széleskörűen alkalmazzák az élesztők faj alatti szintű elkülönítésére. Az élesztő kultúrákból a fent leírt módon kivontuk a genomi DNS-t, amit ezután a delta12/delta21 primerekkel amplifikáltunk (Legras és Karst, 2003). A kapott PCR termékeket 2%-os agaróz gélen futtattuk, a kapott mintázatok alapján különítettük el a vizsgált törzseket. 142
Mikrovinifikációs kísérletek A próbaerjesztés során a szelektált élesztőtörzsek borászati technológiában való alkalmazhatóságát vizsgáltuk. A kísérletben 2014-es évjáratú, ülepítés után pasztőrözött Kéknyelű mustokat használtunk alapanyagként. A mustból vett alikvotokat (5l) beoltottuk a szelektált élesztő kultúrákkal, majd komplex tápsót adtunk a mintákhoz. A fermentációt 15ºC-on végeztük, folyamatosan figyelemmel kísérve a tápsó igényt és a cukorfogyást. A keletkező borokat organoleptikus, valamint analitikai analízisnek vetettük alá. Az analitikai vizsgálatok közé tartozik pl. az etilalkohol-, összes cukor-, glükóz-, fruktóz-, összes és illó sav-, polifenol-, borkősav tartalom, illetve a ph meghatározása. EREDMÉNYEK Mintavétel, élesztők izolálása A mintavételt követően a Kéknyelű és Szürkebarát szőlőbogyó, különböző erjedési állapotú Kéknyelű must, és környezeti mintákból élesztőket izoláltunk. Az izolálás során olyan dúsító, illetve szelektív táptalajokat alkalmaztunk, amelyek visszaszorították a penészgombák és baktériumok növekedését. A módszerrel 528 saját izolátumot sikerült elkülönítenünk, ezen kívül 31 kereskedelmi forgalomban kapható starter kultúra is bekerült a törzsgyűjteményünkbe, melyek kontrollként szolgáltak a kísérletek során. Élesztők csoportokba rendezése A csoportokba rendezést klasszikus mikrobiológiai módszerek segítségével végeztük el. Ezen tesztek közül csak néhánynak az eredményét mutatjuk be (szénforrás hasznosítás, nitrogénforrás hasznosítás, fermentációs képesség vizsgálat). 1. ábra. Az izolátumok növekedése különböző szénforrásokon 2. ábra. Az izolátumok növekedése különböző nitrogénforrásokon Az izolátumok taxonómiai azonosításának klasszikus módszere az élettani és biokémiai vizsgálatokon alapul. Kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy az izolátumok mely szénforrások hasznosítására képesek, ezért 11 különböző szubsztrátot adagoltunk a táptalajhoz és figyelemmel kísértük a növekedésüket. Az eredmények alapján elmondható, hogy a glükóz után a szacharóz bizonyult a leginkább preferált szénforrásnak, a mellobióz és az arabinóz tartalmú médiumon pedig alig figyeltünk meg növekedést (1. ábra). Az izolátumokat a 143
szénhasznosítási mintázat alapján 20 csoportba soroltuk, ezután minden csoportból reprezentánsokat választottunk ki, amelyeket bevontunk a további vizsgálatokba (40 izolátum). A mikroorganizmusok nitrogénhasznosító képessége is felhasználható az egyes fajok elkülönítésében, ezért megvizsgáltuk az izolátumok növekedését különböző nitrogénforrások jelenlétében (2. ábra). Az elsődleges vizsgálatok célja a S. cerevisiae izolátumok elkülönítése volt, ugyanis irodalmi adatok alapján a S. cerevisiae nem képes hasznosítani a lizint (Valero et al., 2007). A kísérletben 3 nitrogénforrásként szolgáló szubsztrátot (lizin, nátrium-nitrát, kálium-nitrit) adtunk a táptalajhoz, majd azokat az izolátumokat választottuk ki, melyek ammónium-szulfáton jól növekednek, lizinen azonban nem. Kontrollként ammónium-szulfát tartalmú táptalajt használtunk. A szelektált izolátumok közül 40 törzset választottunk ki a további vizsgálatokhoz. A kiválasztott törzsek mikrovinifikációs tesztbe való bevonása előtt megvizsgáltuk a minták fermentációs képességét. A fermentációs folyamat során többek között etanol és széndioxid képződik (3. ábra), valamint csökken a ph, amit az indikátor színének változása jelez (lilából sárgára vált, lásd 3. ábra). A gázképződés detektálását Durham csövek segítségével végeztük. A minták között voltak gyorsabban illetve lassabban fermentáló törzsek, vagy épp olyanok, melyek egyáltalán nem fermentáltak. Negatív kontrollként glükózmentes tápfolyadékot alkalmaztunk, amit S.cerevisiae mintával oltottunk be. Pozitív kontrollként egy starter élesztőt választottunk, mely alkalmas megfelelő minőségű borok előállítására. 3. ábra. Fermentációs teszt. Megfigyelhető a gázképződés és a ph változás a glükóz fermentáció során (24 ºC; 1-6: minta; NK: negatív kontroll). 4. ábra. A glükóz fermentáció során keletkezett gázmennyiség vizsgálata. A képződött gázmennyiséget naponta mértük 5 napos időintervallum során (24 ºC; 1-10: minta; PK: pozitív kontrol; NK: negatív kontroll). Három különböző inkubációs hőmérsékleten (10-16 - 24 ºC) végeztük a fermentációs teszteket, melyek közül a 24 ºC-on történő kísérlet eredményeit grafikonon ábrázoltuk (4. ábra). Színváltozást és gázképződést a mintákat tartalmazó kémcsövek mindegyikében tapasztaltunk, azonban a negatív kontroll esetében fermentáció nem történt (3. ábra). A kísérletek eredményei alapján 3 izolátum (CA21, NA34 és NA30) lehet alkalmas borok előállítására, mivel a pozitív kontrollal megegyező fermentációs képességgel bírnak. 144
Molekuláris biológiai azonosítás Izolátumok és starterélesztők azonosítása ITS régió nukleotid szekvenciája alapján Az ITS régió alkalmazása széles körben elterjedt eljárás az élesztőgombák identifikálására, ezért az online adatbázisokban nagy mennyiségű szekvencia adat található, melyek segítségével faj szintű azonosításra is lehetőségünk van. Az izolátumok ITS szekvenciái méretük szerint csoportosíthatóak (5. ábra), az adott szakaszok szekvenciája alapján pedig genus ill. faj szinten azonosíthatók. A kapott szekvencia adatok alapján meghatározott minták az 1. táblázatban szerepelnek. 5. ábra. Az izolátumok elkülönítése az ITS4/ ITS5 primerekkel amplifikált PCR termék hossza alapján: 1-12: izolátumok, MWS: molekulatömeg standard (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder.) 1. táblázat. Az izolátumok azonosítása ITS régió nukleotid szekvenciája alapján az NCBI BLAST analízis alkalmazásával Izolátum Rendszertani megnevezés Azonosság (%)* CA10 Candida zemplinina 100 2m 1.2 Cryptococcus flavescens 100 S2/1 Hanseniaspora uvarum 100 S1/1 Metschnikowia sp 100 FTPG5 Pichia kluyveri 100 3v4.1, R2 Rhodotorula glutinis 100 2v1.2-z0.5 Rhodotorula nothofagi 100 CA21 Saccharomyces cerevisiae 100 CA24 Saccharomyces pastorianus 98 K1 Sporidiobolus pararoseus 100 * azonosság az NCBI adatbázisban található szekvencia adatokkal. Izolátumok és starterélesztők azonosítása a delta régió nukleotid szekvenciája alapján 145
A delta szekvenciák amplifikációja és gél elektroforézise során a PCR termékek különböző mintázatokat mutatnak, melyek alapján lehetővé válik a Saccharomyces fajok törzs szintű azonosítása. A módszer segítségével a saját izolátumaink elkülöníthetők a starter élesztőktől, illetve más módszerekkel kombinálva a vizsgálat a visszaizolált starterélesztők kiszűrésére is alkalmas lehet. MWS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 NK MWS 6. ábra. Delta12 és delta21 primerekkel amplifikált PCR termékek gél elektroforézise. 1-15: starter élesztők, NK: negatív kontroll, MWS: molekulatömeg standard (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder) Mikrovinifikációs kísérletek A mikrovinifikációs kísérlet során kis tételben (5 liter) vizsgáltuk a szelektált élesztők hatékonyságát a borászati technológiában. A kísérlet során mustot oltottunk be az élesztő kultúrákkal és különböző analitikai eljárások segítségével meghatároztuk a kialakult borok néhány beltartalmi értékét, melyek a 2. táblázatban láthatók. 2. táblázat. A szelektált izolátumokkal előállított borok vizsgált beltartalmi paraméterei Izolátum Etilalkohol (V/V%) (NIR spektrometria) Összes sav (g borkősav/l) Illósav (g ecetsav/l) Redukáló cukor (g/l) (Schoorl módszer) NK 0,61 12,38 0,20 212,97 NA 36 12,68 12,65 0,14 4,98 NA 26 12,62 12,53 0,26 3,84 CA 21 12,46 12,68 0,27 4,10 CA 22 12,17 12,61 0,37 6,84 CA 39 12,45 12,08 0,30 4,67 PK 12,50 11,47 0,20 3,52 NA 30 12,45 11,90 0,29 3,53 S 1/1 3,87 12,95 0,12 138,14 NA 34 12,59 12,12 0,20 4,20 CA 24 12,37 12,26 0,40 5,31 MCN 1/1 12,61 11,95 0,38 3,33 146
A pozitív kontrollként alkalmazott, starter élesztővel készített borok cukor koncentrációja kevesebb, mint 4 g/l, mely az irodalmi adatok szerint a száraz borok egyik kritériuma (Bellon et al., 2013). Vizsgálatunk során a 2. táblázatban szereplő NA26, NA30 és az MCN1/1 mintákkal készített borok esetében mértünk hasonló 4 g/l alatti cukorkoncentrációkat, tehát ez a három élesztő bizonyult alkalmasnak száraz borok előállítására. KÖVETKEZTETÉSEK Vizsgálataink során megkezdtük a Badacsonyi borrégió területéről az élesztő izolátumok gyűjtését, azonosítását és jellemzését. Az izolátumokat klasszikus mikrobiológiai tesztek segítségével csoportosítottuk a morfológiai, biokémiai és fiziológiai tulajdonságaik alapján (pl. szén- és nitrogénasszimiláció, fermentációs képesség, alkoholés cukortolerancia, savtermelési és savtűrési képesség). A csoportok reprezentánsait molekuláris biológiai módszerek segítségével vizsgáltuk tovább, a primer izolátum közül 99 mintának meghatároztuk az ITS régióban a nukleotid szekvenciáját, ez alapján a vizsgált minták legalább 8 genusba sorolhatók. A szelektált Saccharomyces cerevisiae izolátumokat mikrovinifikációs kísérletekben teszteltük. A tesztelt izolátumok közül több is alkalmasnak tűnik borászati technológiába való alkalmazásra. Az analitikai vizsgálatok során az NA26, NA30 és az MCN1/1 minták tűntek ki, míg a fermentációs teszt alapján a CA21, NA34 és NA30. Az NA30 minta mindkét esetben a legjobb eredményeket mutató izolátumok közé tartozik, így ezen izolátum nagy valószínűséggel hasznosítható lehet borászati vonatkozásban. Vizsgálataink során arra a következtetésre jutottunk, hogy ezek a módszerek alkalmasak olyan kedvező tulajdonságokkal rendelkező élesztőtörzsek szelektálására, melyek az adott régióra specifikus karaktert kölcsönöznek a helyi boroknak, ezáltal kiemelve azok egyedi jellegét. IRODALOM JEGYZÉK: Bellon, J. - Schmid, F. - Capone, D.- Dunn, B. - Chambers P. (2013) Introducing a new breed of wine yeast: interspecific hybridisation between a commercial Saccharomyces cerevisiae wine yeast and Saccharomyces mikatae. PLoS ONE 8 (4): e62053. Guillanóm, H. M.- Sabaté, J. - Barrio, E. - Cano, J. - Querol, A. (1998) Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Archives of Microbiology 169 (5): 387-392. Gilbert, J. A. - van der Lelie, D. - Zarraonaindia, I. (2004) Microsatellite PCR profiling of Saccharomyces cerevisiae strains during wine fermentation. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111(1): 5-6. Howell, K.S. - Bartowsky, E.J. - Fleet, G.H. - Henschke, P.A. (2004) Microsatellite PCR profiling of Saccharomyces cerevisiae strains during wine fermentation. Applied Microbiology 38 (4): 315-320. Kurtzman, C.P. - Robnett, C.J. (1998) Identification and phylogeni of ascomycetous yeast from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek 73 (4): 331-371. Legras J-C. - Karst, F. (2003) Optimisation of interdelta analysis for Saccharomyces cerevisiae strain characterisation. FEMS Microbiology Letters 221 (2): 249-255. 147
Romano, P. - Fiore, C. - Paraggio, M. - Caruso, M. - Capece, A. (2003) Function of yeast species and strains in wine flavour. International Journal of Food Microbiology 86 (1-2):169-180. Schuller, D.- Alves, H.- Dequin, S.- Casal, M. (2005) Ecological survey of Saccharomyces cerevisiae strains from vineyards in the Vinho Verde Region of Portugal. FEMS Microbiology Ecology 51 (2): 167-177. Sipiczki, M. - Romano, P. - Lipani, G. - Miklos, I. - Antunovics, Zs. (2001) Analysis of yeasts derived from natural fermentation in a Tokaj winery. Antonie van Leeuwenhoek 79 (1): 97 105. Styger, G. - Prior, B. - Bauer, F.F. (2011) Wine flavor and aroma. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 38 (9): 1145-1159. Valero, E.- Cambon, B.- Schuller, D.- Casal, M.- Dequin, S. (2007) Biodiversity of Saccharomyces yeast strains from grape berries of wine-producing areas using starter commercial yeasts. FEMS Yeast Research 7(2): 317-329. White, T.J. - Bruns, T. - Lee, S. - Taylor, J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications pp. 315-322. Edited by M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White. Academic Press, San Diego, USA. 148