Csúcstechnológiák a Debreceni Egyetem vonzáskörzetében: genomikai, nano- és biotechnológiai alkalmazások GENOMNANOTECH DEBRET (GND) (Nyilvántartási szám: RET-06/2004) ZÁRÓ SZAKMAI BESZÁMOLÓ (2005. január 1. - 2008. december 31.) Támogatott szervezetek: Projektkoordinátor: Dr. Fésüs László, rektor (http://gnd.unideb.hu) 1. Debreceni Egyetem (konzorciumvezetı) 2. National Instruments Europe Software és Hardware Gyártó Kft. 3. METALELEKTRO Méréstechnika Kereskedelmi és Szolgáltató Kft. 4. Szinapszis Piackutató és Tanácsadó Kft. 5. Labexpert Kereskedelmi és Szolgáltató Kft. 6. Abiol Kereskedelmi és Tanácsadó Kft. 7. Actavis Hungary Gyógyszermarketing és Kereskedelmi Kft. 8. Jonaco Kereskedelmi és Szolgáltató Kft. 9. Master Good Termelı és Kereskedelmi Kft. 10. Bakonszegi Awassi Mezıgazdasági, Élelmiszeripari és Kereskedelmi Zrt. 11. Juhker Mezıgazdasági Termelı, Kereskedelmi és Szolgáltató Kft. 12. Észak-Alföldi Regionális Agrár-Innovációs és Technológia Transzfer Központ Közhasznú Társaság 13. SANATMETAL Ortopédiai és Traumatológiai Eszközöket Gyártó Kft. 14. Amri Hungary Zrt. 15. Solvo Biotechnológiai Zrt. 16. ADEXGO Ipari Kereskedelmi és Szolgáltató Kft. 17. Acrom Szolgáltató Bt.
Tartalomjegyzék GENOMNANOTECH DEBRECEN Regionális Egyetemi Tudásközpont Program négy évének összefoglalása.. 3 Az 1. programban elért eredmények... 6 A 2. programban elért eredmények... 11 A 3. programban elért eredmények 18 A 4. programban elért eredmények 22 Az 5. programban elért eredmények...... 30 2
GENOMNANOTECH DEBRECEN Regionális Egyetemi Tudásközpont Program négy évének összefoglalása (2005-2008) Küldetés nyilatkozat A GENOMNANOTECH Debrecen Regionális Egyetemi Tudásközpont projekt keretében folyó genomikai, nano-és biotechnológiai alkalmazott kutatások dinamikus fejlesztésével, új ipari kultúra és jelentıs számú munkahely teremtésével a Debreceni Egyetem a régió meghatározó szereplıjévé válik az élettudományok és az ahhoz kapcsolódó interdiszciplináris kutatások területén. A GND RET bázisa, a Debreceni Egyetem, évi 4,2 milliárd Ft K+F bevételével és nyolc spin-off vállalkozásával a térség legjelentısebb kutató-egyetemei közé tartozik. A Tudásközpont missziójának tekinti, hogy az Egyetemen belül az alapkutatások mellett az alkalmazott kutatás és fejlesztés segítségével elérje azt a kritikus tömeget, amellyel versenyképes innovációs légkört tud teremteni. A Tudásközpont projekt a Debreceni Egyetem környezetében megindult innovációs szemléletváltás elsı mérföldköve: hosszú távú célja a genomikai, nano- és biotechnológiai alkalmazott kutatások dinamikus fejlesztésére alapozva új ipari kultúra és jelentıs számú munkahely teremtése a régióban, nemzetközi viszonylatban is kiemelkedı biotechnológiai központ kialakításával. Átfogó célok Transzlációs K+F tevékenység indítása a Debreceni Egyetem környezetében Az Egyetemen létrejött tudás és technológia piaci környezetbe történı transzferálása A transzferfolyamat feltételrendszerének kidolgozása és tudatosítása az egyetemi polgárokban A szellemi alkotások hatékony védelmének biztosítása Szakmai áttekintés A GENOMNANOTECH Debrecen Regionális Egyetemi Tudásközpont a Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal 2004. évben kiírt pályázatának eredményeként jött létre. 2004. decemberének elején került aláírásra a pályázatot benyújtó konzorcium és az NKTH között a szerzıdés. 2005. elején konzorciumi szerzıdés rögzítette a Debreceni Egyetem és a 16 együttmőködı cég, illetve ipari partner közös tevékenységének kereteit. A konzorciumi tagok száma gazdasági okok miatt 2006-ban tizenhatra csökkent, a kilépı Synosens Kft. által vállalt kötelezettségeket a Debreceni Egyetem teljesíti. A GND RET két alapvetı és meghatározó kiindulópontja közül az elsı azt a célt tőzte ki, hogy az élettudományokban megszerzett szellemi potenciál, az ehhez kapcsolódó és rövidesen bekövetkezı infrastrukturális fejlesztési lehetıségekkel élve a Debreceni Egyetem környezetében meghatározó súlyú fejlesztésre koncentráló transzlációs K+F tevékenység induljon meg kihatva a régióra és az ország egészére. Ehhez kapcsolódóan négy nagy területen kezdıdött meg, illetve az elızményekre épülve folytatódott az intenzív innovációs tevékenység. A projekt szakmailag sikeresen zárult, az elért eredmények számos esetben túlmutatnak az eredetileg kitőzött célokon. A kutatási eredményeket az ipari partnerekkel szoros együttmőködésben értük el, azok hasznosítása több esetben is megkezdıdött a partnereknél. A 3
szerzıdés mellékletét képezı munkatervben foglalt feladatok megvalósultak, a szakmai sikerek pedig számos új projekt kialakulását alapozzák meg. 1) A metabolikus szindróma diagnosztikájában, illetve terápiájában felhasználható molekulák és módszerek kifejlesztése A program teljesítése során jelentısen bıvítettük genomikai eszközparkunk áteresztıképességét és megalapítottuk az UD-Genomed Medical Genomic Technologies Kft. spin-off céget a Debreceni Egyetemen elérhetı komplex genomikai szolgáltatások hasznosításának menedzselésére. Létrehoztunk egy az akadémiai szférában egyedülálló folyamatosan bıvülı molekulabankot. Kialakítottuk a házi és a kereskedelmi forgalomban beszerezhetı molekulabankok különbözı sejtfunkciókra ható vegyületeinek kiválasztását lehetıvé tevı robotizált laboratóriumot. Kidolgoztunk számos eljárást, melyekkel e robotizált környezetben elvégezhetı a metabolikus szindróma egyes sejtszintő eltéréseire ható vegyületek azonosítása. Diagnosztikai eljárásokat fejlesztettünk a metabolikus szindróma trombózis igazolására. Igazoltuk egy növényi kivonat, a meggymagolaj sejtvédı hatásait, azonosítottuk a kivonat összetevıit, és kozmetikai terméket fejlesztettünk belıle, melynek ipari mérető gyártásához is kialakítottuk a szükséges feltételeket. 2) Molecular farming, illetve egyéb növény-biotechnológiai módszerek kifejlesztése és alkalmazásba vétele Egyik legfontosabb eredménye az alprogramnak a Növényi Molekuláris Genetikai Intézet létrehozása az Egyetem Élettudományi Épületében. Gyógyszeripari cégek számára rendelkezésre áll a dohánylevél alapú rekombináns fehérjetermelés kísérleti technológiai platformja. A meggyre kalibrált hordozható össz-antocianin-tartalom mérı mőszerrel a meggytermelık, feldolgozók, kereskedık és élelmiszer forgalmazók a gyakorlat számára megfelelı pontossággal, egyszerő méréssel el tudják választani a meggyfajták különbözı folyékony állagú termékeit, különös tekintettel az egészségjavító, un. funkcionális magyar pharma-meggyekre. Új Fito-bioreaktor kísérleti technológiai platform ipari rendelkezésre áll a szomatikus embriógenezisre alapozva. A bioaktív anyagokat nagy koncentrációban tartalmazó ún. növényi pempıt állítottunk elı paprikából és meggybıl. A gomba eredető sziderofórok funkcionális élelmiszerekben (szalámikban) történı alkalmazását a húsipari partnerekkel tovább fejlesztettük, ezek üzemi tesztelése folyik. A régió-specifikus, új borélesztı-starterkultúrák elıállítására irányuló törekvés eredményeként 10 új törzset teszteltünk technológiai körülmények között. Különbözı juh és pulyka fajok tejtermelıképességet, illetve hústermelı-képességet befolyásoló génjeit folyamatosan vizsgálata révén két új terméket állítottunk elı: jó húsformákat mutató keresztezett vágópulykát és callipyge mutációt hordozó magasabb húskihozatalú cigája juhot. 3) Gyógyszerjelölt és funkcionális élelmiszerek fejlesztése, ipari színvonalú biztonság-farmakológiai vizsgálatok végzésére is alkalmas preklinikai vizsgálóhelyen Az alprogram keretében a konzorciumi partner ADEXGO Kft. közremőködésével a gyógyszerfejlesztési szabványoknak megfelelıen üzemelı Good Laboratory Practice minısítéssel rendelkezı, kutató-fejlesztı laboratóriumokat szereltünk fel, illetve üzemeltetünk. A projekt eredményeként egy olyan prediktív biztonság farmakológiai 4
metodika született meg, melynek segítségével antidiabetikumok, kiemelten inzulin érzékenyítı szerek kardiovaszkuláris mellékhatásainak korai fázisú kiszőrésére nyílik lehetıség. Az alprogram keretében diverzifikált kockázatú gyógyszeripari projekt portfoliót dolgoztunk ki melyben eredeti molekulák, módosító termék innovációk, fix generikus kombinációk szerepelnek. 4) Mérésmetodikai nanotechnológiai fejlesztési programok elindítása Befejeztük a gyorsulásmérın alapuló, a gyógylovaglás és járásanalízis területén alkalmazható eszköz fejlesztését. Sikeresen bevezettük az ólommentes forrasztási technológiát, valamint automatikus optikai ellenırzı rendszert fejlesztettünk ki a National Instruments Europe Kft.-nél. Létrehoztunk egy Vascularis MultiGraph adatgyőjtı szoftvert, és az értékeléshez szükséges adatbázist (vasclab). A revíziós csípıprotézis-szett kifejlesztése lezárult, jelenleg a hazai klinikai alkalmazásban folyik a kipróbálás. 2009-tıl a csípıprotézis terméket a Sanatmetal Kft. vezeti be a nemzetközi piacra. Elkészült az új térd- és csípımozgató rehabilitációs eszköz. Sikeresen elıállítottunk olyan nanokompozitokat, amelyek potenciálisan alkalmasak orvosi fogorvosi és gyógyszerészeti alkalmazásra. Funkcionális felületek keletkezésének lehetıségét vizsgáltuk elsısorban bioimplantátumokhoz, a minták sejtnövekedési folyamatait analizáltuk. Összességében mind a négy területen az elızetes terveknek megfelelıen zárult a kutatási tevékenység és teljesültek a négy évre kitőzött feladatok. 5) A fenti célkitőzéshez szorosan kapcsolódott a második alapvetı célkitőzés: technológiatranszfer és -hasznosítási rendszer kiépítése a Debreceni Egyetemen. Ezt a feladatot éppúgy, mint a fenti négy program összefogását, a GND RET mőködésének legelején felállított Kutatási és Fejlesztési Igazgatótanács felügyeli. A tanács tagjai a négy fenti részprogram koordinátorai is egyben. A KFIT kialakította a GND RET mőködésének rendszerét, rendszeres üléseivel biztosítja a munka folyamatosságát és monitorozását, továbbá annak belsı és külsı kommunikációját. A Tudásközpont mőködésének második évében létrejött a GND Tudás- és Technológia Transzfer Iroda, mely már a kezdetektıl fogva törekedett az Egyetem egészére kiterjeszteni tevékenységét. Ennek megfelelıen az iroda neve 2007-tıl Debreceni Egyetem Tudás- és Technológia Transzfer Iroda. A DE TTI profilja és feladatköre mára jól elkülöníthetı a GND RET projekttıl: az iroda hatáskörébe tartozik többek között a Debreceni Egyetemen létrejött szellemi alkotások iparjogvédelmi menedzselése, a szakértı értékelés és hasznosítás feltételeinek biztosítása, a spin-off cégek létrejöttének elısegítése, illetve az Egyetem innovációs portfoliójának folyamatos frissítése és népszerősítése. Egyértelmő cél, hogy a DE TTI a tudásközpont projekt zárása után, új finanszírozási modellt találva, tovább folytassa technológia transzfer tevékenységét az Egyetem önálló szervezeti egységeként. 5
Az 1. programban elért eredmények Program koordinátor: Dr. Gergely Pál egyetemi tanár Új eljárások a legjelentısebb népbetegségeket egyesítı metabolikus szindróma diagnosztikájában és terápiájában: a genomikától a betegágyig Résztvevık Debreceni Egyetem, Labexpert Kft., Actavis Hungary Kft., Jonaco Kft., AMRI Hungary Zrt., Solvo Biotechnológia Zrt. 1. Genomikai kutatások (témavezetı: Dr. Nagy László) A nagy áteresztıképességő (high throughput) transzfekcióra való áttérés technikai feltételeit kidolgoztuk annak érdekében, hogy biztosítsuk a feltételeket nagyobb mintaszámú vegyületkönyvtár szőrésére PPARgamma aktiváló vagy gátló hatás azonosítására. Az ABI Low density array használatával az elsı méréseket súlyosan inzulin rezisztens betegek perifériás vérébıl származó, PPARgamma ligand rezisztens dendritikus sejteken végeztük el. COPD betegségben szenvedı és egészséges páciensek közötti génexpressziós különbségek alapján marker géneket azonosítottunk, illetve a betegséghez kapcsolható génekben egy nukleotidás polimorfizmusok (SNP) kapcsoltságát vizsgáltuk. Vizsgálatunkba 571 pácienst vontunk be, 300 kontroll és 271 COPD-s beteget, férfiakat és nıket egyaránt, 38-89 éves életkor között. Az irodalomból ismert adatok alapján választottunk ki 4 db COPD-hez kapcsolható gént: SERPINE2b, mephx1, TNFa, SFTPB. Az SNP genotipizálásra real time kvantitatív PCR-t (ABI 7900), TaqMan genotipizáló assay-ket (ABI) használtunk. Az eredmények alapján elmondható, hogy a populációnk követik a Hardy-Weinberg egyensúlyt. Az allélgyakoriságból számított odds ratio 1.102 tehát a polimorfizmus a betegséggel asszociálódhat. A mért adataink alapján az allélgyakoriság 70%:30%, amely közelít az irodalomból ismert 66%:34%-os arányhoz. Az AMRI Hungary Zrt. által, a saját könyvtárából kiválasztott molekula vegyületeket vizsgáltuk. Ezek a molekulák potenciálisan aktiválnak egyes magreceptorokat és így alkalmasak lehetnek a metabolikus szindróma kezelésére. Sikeresen beállítottuk a transzfekciót 96 lyukú formátumban. Munkacsoportunk olyan molekulákat tesztelt, amelyek bioinformatikai modellezés alapján képesek aktiválni a PPARgamma molekulát. A teszteléshez beállítottunk egy olyan módszert, amely segítségével sejtes rendszerben tanulmányoztuk a vegyületek PPARgamma aktivációs képességét. Vizsgálataink során a tesztelt 500 molekulából több tíz olyan új molekulát azonosítottunk, melyek aktiválják a PPARgamma-t és potenciálisan kedvezıbb lehet a mellékhatásprofiljuk. A pozitív 6
PPARgamma aktivitást mutató ligandok további génexpressziós és farmakológiai vizsgálata indokolt. A PPARgamma kutatások eredményei hasznosíthatóak egyrészt a felnıttkori cukorbetegség kezelésében, másrészt pedig bizonyos gyógyszerkutatások terén. A felnıttkori diabétesz ma már népbetegségnek tekinthetı. Az utóbbi évtized egy új gyógyszercsoportja képes a test szöveteiben kialakuló inzulinrezisztenciát csökkenteni. Ezek a gyógyszerek képesek a PPARgamma nevő fehérjét bekapcsolni és ezáltal beindítanak olyan genetikai programokat melyek által javul a betegek állapota. A gyógyszerkutatások egyik célja a kevesebb mellékhatással rendelkezı molekulák fejlesztése. A PPARgamma másik élettani hatása, hogy fokozza a zsírsejtek kialakulását. E hatás eredményezi ezen gyógyszerek mellékhatását, a súlygyarapodást és végsı esetben az elhízást. 2. Molekulabank létrehozása a Debreceni Egyetemen (témavezetı: Dr. Patonay Tamás) A Molekulabank elektronikus adatbázis kialakítása megtörtént. A Molekulabankban lévı vegyületek száma összesen 2095 db. A glikogén foszforiláz inhibitorok fejlesztése területén N-2-aril-N -β-d-glükopiranozilkarbamidokat vezérszerkezetként alkalmazva különbözı, triazol egységet tartalmazó glükózszármazékokat állítottunk elı, illetve meghatároztuk glikogén foszforiláz gátló hatásukat. A Solvo Zrt.-nél összesen 2016 vegyület MDR1 transzporter ATPase aktiváló hatását vizsgálták meg azzal a céllal, hogy a gyógyszerjelölt molekulákat tartalmazó molekulakönyvtár tagjainak lehetséges MDR1 szubsztrát tulajdonságát meghatározzuk. A kapott eredmények alapján a sejtekbıl a transzporter által gyorsan eltávolításra kerülı vegyületek már a gyógyszerfejlesztés kezdeti szakaszában kiszőrhetıek. Az adatok szerkezethatás összefüggés vizsgálata lehetıvé teszi a szubsztrát sajátságért felelıs molekularészletek felismerését és tervezését. Az AMRI Hungary Zrt. a DE Molekulabank vegyületeinek teljes körére elvégezte az in silico ADME/Tox elemzést. Ennek eredményeképpen egy 200 tagú alkönyvtár került elhelyezésre a Molekulabankban. Elvégeztük a potenciálisan biológiailag aktív oligoszacharidok szintézisére vonatkozó vizsgálatait. 1863 származékot átadtunk a RET 1.3. részfeladatát végzı csoportnak robotizált tesztek céljára, akik folytatták ezek szőrését. Ennek során több citoprotektív és poli-adp-ribóz polimeráz gátló vegyületet azonosítottak, amit manuális mérésekben megerısítettek. A pályázati ciklus lezárása után is folytatjuk a Molekulabank bıvítését és az abban tárolt vegyületek átadását tudományos partnereknek, illetve ipari partner megrendelıknek. A Solvo Zrt. munkatársaival folytatott elızetes egyeztetés alapján tervezzük a tesztelt vegyületek MDR1 transzporterre gyakorolt hatásadatainak kemoinformatikai módszerekkel történı analízisét. Ez a projekt beépíthetı lehet egy esetleges következı RET pályázatba. 7
Folytatni kívánjuk a fenolos hidroxicsoportot tartalmazó és jó MDR1 vagy BCRP szubsztrát molekulák vizsgálatát. Ugyancsak folytatni kívánjuk az antidiabetikus és az antitrombotikus hatású vegyületek elıállítását, emellett hídmolekulával ellátott szabad di-, tetra-, hexa- és oktaszacharid fehérjéhez kötése révén Staphylococcus aureus fertızés elleni vakcina elıállításához kívánunk eljutni. A Molekulabank szolgáltatás hasznosító vállalkozásba történı kiszervezésérıl a GND RET program befejezése után dönt a Debreceni Egyetem. 3. HTS kompatibilis eljárások kifejlesztése (témavezetı: Dr. Virág László) Az elsı évben 4 különbözı biológiai hatás meghatározására szolgáló 6 különbözı HTS assay beállítását végeztük el (intracelluláris kalciumkoncentráció mérése, MTT és BrdU alapú kolorimetriás assay-k, antioxidáns hatás mérése, poli(adp-ribóz) polimeráz (PARP) aktivitás mérése). A DHR assay HTS alapra ültetését elvégeztük, ami alkalmas a metabolikus szindrómában termelıdı egyik legreaktívabb intermedier, a peroxinitrit, mennyiségének mérésére. Az AMRI Hungary Zrt. kismolekula bankjából hasonlósági keresést használva egy fókuszált könyvtárat választottunk ki. Különbözı kombinált fluoreszcens HTS assay-k alkalmazását és optimalizálását közel 20-féle humán sejttípuson (pl. keratinocyták, sebocyták, fibroblastok, harántcsíkolt és szívizomsejtek) hajtottuk végre. A kísérletek során az alábbi kombinációkat fejlesztettük: i) Ca-imaging (fluo-4 festék) + real-time apoptózis (DilC 1 (5) mitochondrialis membránpotenciál-érzékeny festék); ii) Ca-imaging (fluo-4 festék) + nekrózis (glükóz-6- foszfát-dehidrogenáz kimutatása); iii) a fenti 3 eljárás kombinációja. A kifejlesztett riporter gén assay-t az AMRI Hungary Zrt. adaptálta HTS környezetbe. A PPARγ magreceptor agonisták ás antagonisták vizsgálatára alkalmas rendszert automatizáltuk és így alkalmassá tettük nagy áteresztıképességő szőrés elvégzésére. Ezután használtuk az AMRI molekulakészletébıl kiválasztott agonista jelöltek vizsgálatára. Az ígéretes találatok alapján az AMRI raktárkészletében analógjaikat kerestük egy Daylight-típusú molekuláris fingerprinten alapuló szerkezeti hasonlóságot azonosító algoritmus segítségével. A Debreceni Egyetem Molekulabank vegyületeinek szőrését elvégeztük, ennek során több citoprotektív és poli-adp-ribóz polimeráz gátló vegyületet azonosítottunk. A HTS laboratórium teljes egészében kiépült, a szolgáltatási portfolió kidolgozásra került és megindult a szolgáltatások kínálása külsı partnerek részére. A kutatási eredmények hasznosítása lehetséges a humán gyógyászatban illetve, az orvosi diagnosztikában. A részprogram keretében végzett kutatások eredményei felhasználhatók a metabolikus szindróma egyes kórélettani történéseinek meghatározására. Az eljárásokat HTS (highthroughput screening) környezetbe való átültetése révén pedig lehetıség nyílik molekulák százai, ezrei hatásainak tesztelésére, potenciális gyógyszerjelölt vegyületek azonosítása céljából. A HTS laboratórium szolgáltatási portfoliójának összeállítását követıen elkezdtük a tevékenység marketing munkáit. A szolgáltatás 2008-tól elérhetı külsı partnerek számára is. 8
4. A metabolikus szindróma diagnosztikája és terápiája (témavezetı: Dr. Muszbek László) Kimutattuk, hogy az a2-plazmin inhibitor N-terminális dodekapeptidje [a2-pi (1-12)] kiváló szubsztrátja a véralvadás aktivált XIII-as faktorának (FXIIIa), s meghatároztuk a reakció legfontosabb kinetikai paramétereit. E szubsztrát aminosavszekvenciája: NQEQVSPLTLLK. Az inhibitor keresésével kapcsolatos munkánk során ebbıl a peptidszubsztrátból indultunk ki. Az a2-pi (1-12) négyes pozíciójában is glutamin reziduum van, és az irodalmi adatok alapján ellentmondóak a tekintetben, hogy ez a glutamin is szolgálhat-e acil-donorként a reakcióban. Ennek vizsgálatára elıállítottunk olyan szubsztrát-analógot, melyben a kettes pozícióban lévı glutamint kicseréltük aszparaginra. Az így szubsztituált peptidnek a vizsgálata kimutatta, hogy a négyes pozícióban lévı glutamin nem szubsztrátja a FXIIIa-nak, viszont az így elıállított peptid inhibitor hatással rendelkezik. Elıállítottuk a FXIII meghatározásra szolgáló diagnosztikai tesztben alkalmazható szubsztrátot, ill. FXIIIa-t gátló peptideket. Kifejlesztettünk egy olyan ELISA módszert, mely a véralvadás V-ös faktorából az aktiváció során kihasadó egyik fragmentummal specifikusan reagál, és így alkalmazható a trombózisok diagnosztikájában. Két új, a trombózis és a pretrombotikus állapotok diagnosztikájában potenciálisan használható immunassay-t sikerült kifejlesztenünk. Az egyik monoklonális antitesteket használó módszer az V-ös faktor aktivációs peptidjének meghatározására, a másik poliklonális antitesteket használó módszer az aktív X-es faktor antitrombin III komplexének a mérésére szolgál. Kísérletes körülmények között mindkét módszer jól mőködött. A klinikai kipróbálás során derült ki, hogy az utóbbi módszer esetében a plazmában nagy mennyiségben jelenlevı inaktív X-es faktor interferál a módszerrel, nagymértékben csökkentve annak érzékenységét. Ezért ez esetben az eredetileg tervezett másik megközelítést is elkezdtük és monoklonális antitestetet termeltettünk aktív X-es faktor, ill. ennek antitrombin III-mal alkotott komplexe ellen. Ezek felhasználásával új immunassay összeállítása folyik. Új, a véralvadás XIII-as faktor aktivitás meghatározására alkalmas szubsztrát peptidet szintetizáltunk, mely jól alkalmazható volt további inhibitor(ok) keresésére, illetve tesztelésére. A korábban tesztelt szubsztrát analógok gátló hatása gyenge volt, ezért egy újabb szubsztrát analógot szintetizáltunk, ahol a 12 tagú szubsztrát peptid aktív glutaminját 6-diazo- 5-oxo-L-norleucinnal (DON-nal) helyettesítettük. Jelenleg ennek tesztelése folyik. Az aktív XIII-as faktor gátlása helyett aktivációjának a gátlását tőztük ki célul egy trombin gátló aptamer segítségével. A szakmai feladatok megvalósításában a Labexpert Kft. aktívan részt vett. Napjainkban a metabolikus szindróma népbetegségnek számít. A pretrombotikus, trombotikus állapotok laboratóriumi diagnosztikája jelenleg még nem megoldott. Ezért az alprogram keretében többek között azon dolgoztunk, hogy új módszereket fejlesszünk ki a pretrombotikus és trombotikus állapot meghatározására. Eddigi kutatási eredményeinket olyan trombózis diagnosztikai kit kifejlesztésre kívánjuk felhasználni, melynek segítségével percek alatt, nagy biztonsággal megállapítható, hogy az adott betegnek van-e trombózisra való hajlama. 9
5. A meggymag komponenseinek szívvédı hatásai (témavezetı: Dr. Tósaki Árpád) A meggymag extrakciója a csonthéj eltávolítása után két frakciót, Frakció I (olajos frakció) és Frakció II (szilárd frakció), eredményezett. A mőszeres analízist mindkét frakcióra elvégeztük. Az izolált extrakumok farmakológiai hatásait patkányszíven vizsgáltuk. A meggymag extraktum magasabb dózisokban (10 mg/kg és 30 mg/kg) jelentıs mértékben javították a posztiszkémiás szívfunkciókat. Az olajos frakcióból elıállított krém UV sugárzás elleni farmakológiai vizsgálatát eredményesen elvégeztük. Elvégeztük továbbá a krém mikrobiológiai, allergológiai, stabilitási, és hatóanyag analízisét, melyek alapján megkaptuk az OÉTI-engedélyt és a gyártáshoz szükséges ÁNTSZ engedélyt. Az olajos frakcióból további segédanyagok felhasználásával elkészítettük a piacra szánt krémet, melynek forgalomba hozatalát megkezdtük. A szilárd frakció továbbfejlesztéséhez további tıke bevonását kezdtük meg. Mindkét technológia szabadalmi bejelentése folyamatban van. A Jonaco Kft. kidolgozta a meggymag-csonthéj elkülönítésének technológiáját. A meggymag bél szárítására, további feldolgozásra való alkalmassá tételére, szállítására, valamint tárolására eljárásokat dolgoztunk ki. Az Actavis Hungary Kft. végezte a szabadalmi bejelentések elıkészítését és benyújtását, illetve marketing tervet készített az arckrém és a testápoló piaci bevezetéséhez. A továbbiakban új termékeket kívánunk kifejleszteni (OLABELLA éjszakai krém, valamint a hatóanyagokat tartalmazó lágyzselatin- és keményzselatin kapszulák) a jelenleg két termékbıl álló OLABELLA termékcsalád bıvítése céljából. Az OLABELLA termékek alkalmasak lehetnek a kardiovaszkuláris megbetegedések számának csökkentésére. Az alprogram keretében kifejlesztett meggymag-technológia hasznosítása érdekében a DE TTI munkatársai állnak állandó kapcsolatban egy kanadai biotechnológiai céggel, amely komoly szándékát fejezte ki a technológia továbbfejlesztése és hasznosítása iránt. 10
A 2. programban elért eredmények Program koordinátor: Dr. Fári Miklós Gábor tanszékvezetı, egyetemi tanár Versenyképes agrár-biotechnológia megalapozása a Debreceni Egyetem vonzáskörzetében: összefogás a genomikától a termékig Résztvevık Debreceni Egyetem, Abiol Kft., Master Good Termelı és Kereskedelmi Kft., Bakonszegi Awassi Mezıgazdasági, Élelmiszeripari és Kereskedelmi Rt., Juhker Mezıgazdasági Termelı, Kereskedelmi és Szolgáltató Kft., Észak-Alföldi Regionális Agrár-Innovációs és Technológia Transzfer Központ Kht. 2.1. Molekula-farming, ill. egyéb növény biotechnológiai módszerek kifejlesztése és alkalmazása új hungarikum zöldség, gyümölcs, dísznövény, valamint takarmánynövény fajták nemesítésére, és egészségjavító piacképes feldolgozott termékeik elıállítására (témavezetı: Dr. Fári Miklós) A kloroplasztisz transzformálás hatékony technikáját kidolgoztuk hazai dohányfajtákra. A Penicillium chrysogenum kis molekulatömegő antifungális hatású PAF génjét kifejeztettük dohány sejtmagban és kloroplasztiszokban. Az R1 transzgénikus nemzedékben PCR technikával bizonyítottuk a PAF gén beépülését a növényi genomba. Rekombináns fehérjét termelı, növényi biomassza steril elıállítását célzó kutatások keretében teszteltük az ún. 3R fito-bioreaktor technológiát PAF gént hordozó, sejtmagban transzformált R1 dohánnyal. Homológia kutatással megtaláltuk a lucernában lévı target szekvenciákat, a terminációs szekvenciát, illetve a rendelkezésünkre álló aada gént. M. truncatula Prrn promóter szekvenciájának ismeretében sikerült klónozni a lucerna promóterének megfelelıjét. A lucerna transzformálást és a regenerációs kísérleteket elvégeztük. Megállapítottuk a növények szelenizálásának optimális módszerét, a szerves és szervetlen szelén akkumulálódásának mértékét, nyomon követtük a növények zsírban és vízben oldódó összes antioxidáns kapacitásának változását a szelenizációs folyamat végén. A csírák szelenizálására 3R fito-bioreaktor tenyészcsöveket alkalmazva az üzemi körülményeket szimuláltuk. A szelenizálási kísérleteket szántóföldi körülmények közé is kiterjesztettük, a zöldtakarmányok közül lucernát és pázsitfüvet vontunk be a kísérletekbe. Ennek eléréséhez nátrium-szelenát tartalmú tablettákat állítottunk elı. Összehasonlító kutatásokat végeztünk magas összes endogén antioxidáns kapacitású meggy és paprika fajták kiválasztására. Meghatároztuk a zsírban és vízben oldódó bioaktív komponensek összes antioxidáns kapacitását, a melatonin-tartalmat, a minták antocianidin profilját. Kidolgoztuk a legmagasabb antioxidáns kapacitású és melatonin tartalmú, ún. Bmeggy, vagy farma-meggy sorozat mintáiból a koncentrátum-elıállítás technológiáját, 11
részben por halmazállapotú, részben sőrő, mézszerő meggy-extraktum ( meggy-méz, meggy-pempı ) formájában. A legmagasabb antioxidáns aktivitású Kapia és Pritavit fajtákból portok tenyészeteket létesítettünk és növényeket neveltünk fel homozigóta vonalak elıállítása céljából. A kiválasztott hibridek és szülık terméseinek antioxidáns kapacitása, illetve aszkorbinsav-, és E-vitamin-tartalom vizsgálatával azok genetikai öröklıdése között összefüggést tártunk fel. A mindenkori élelmiszeripari szabványoknak megfelelı technológiát (extrakciós eljárást) dolgoztunk ki, mely során maximális hatóanyag kinyerés érhetı el. Az elıállított termék, mint funkcionális élelmiszer, jelentıs szerepet játszhat a II. típusú diabetes mellitus kialakulásának megelızésében. Az új Rudbeckia nemesítési vonalak elıállítása és in vitro klónozása mellett a rozsdabetegségekkel szemben rezisztens, várhatóan nagy díszértékő, mályva nemzetséghibrideket (Alcea biennis x Alhaea officinalis) állítottunk elı. Hasadó, többezres Rudbeckia populációból mintegy 170 ígéretes különleges virágú, habitusú, többféle újdonság-értékkel bíró genotípust cserepeztünk be és nevelünk tovább üvegházban. Ezek egy részébıl steril tenyészeteket hoztunk létre (öt genotípus), melyeket részben hagyományos módon, részben 3R fito-bioreaktor tenyésztı csövekben neveljük hatékony in vitro klónozási technológia kifejlesztése érdekében. A steril magvetésbıl származó Cosmos tenyészetek mikroszaporítása sikerrel járt. A mályva nemzetség hibrideknél mintegy 300 fajok közötti keresztezést hajtottunk végre. Megfigyeltük, hogy bizonyos növekedés-szabályozó anyagok alkalmazásakor a Cosmos fajták in vitro hajtásai szabályos formájú, mini-virágzatot képesek fejleszteni. A magpopuláció 2%-ából kaptunk hibrid egyedeket. Ezeket steril tenyészetbe vittük és in vitro módszerrel tartjuk fenn. A fertızésmentesen fejlıdı klónpopuláció egy részét szabadföldi összehasonlító kísérletbe ültettük ki. A nemzetség hibrid populáció másik részét 3 liter térfogatú transzparens 3R fito-bioreaktor tenyésztı cilinderekbe helyeztük, üzemi klónszaporítási módszer kidolgozása céljából. Az Észak-Alföldi Regionális Agrár-Innovációs és Technológia Transzfer Központ Kht. végezte a külföldi (izraeli, japán, olasz) piacok feltárását. Üzleti kapcsolatokat szervezett a technológiák hasznosítása céljából és részt vett a DENEX Spin-off Innovációs Kft. megalapításában. Szabadalmi és know-how szolgáltatásokat, marketing tanácsadást és piackutatást végzett az elıállított termékek kapcsán. Molekula farming: Gyógyszeripari cégek számára rendelkezésre áll a dohánylevél alapú rekombináns fehérjetermelés kísérleti technológiai platformja, és új pilot-plant projektek generálása; Pharma zöldségfélék: Kertészeti termékeket feldolgozó üzemek számára rendelkezésre áll funkcionális paprika meggy koncentrátumok elıállításának kísérleti technológiai platformja, és új pilot-plant projektek generálása; Eljárás funkcionális gyümölcscukorka (Királycukorka) élıállítására: pilot-plant projektek generálása; Meggyre kalibrált hordozható össz-antocianin-tartalom mérı mőszer: a kifejlesztett eszközzel a meggytermelık, feldolgozók, kereskedık és élelmiszer forgalmazók a gyakorlat számára megfelelı pontossággal, egyszerő méréssel el tudják majd választani a meggyfajták különbözı folyékony állagú termékeit, különös tekintettel az egészségjavító, un. funkcionális magyar pharma-meggyekre ; 12
Zöldségfélék szelenizálása: Kertészeti, zöldségtermelı gazdaságok számára rendelkezésre áll a brokkoli és zöldségcsírák szelenizálásának technológiája, és új pilot-plant projektek generálása. Új Fito-bioreaktorok: kísérleti technológiai platform rendelkezésre áll a szomatikus embriógenezisre alapozva, új pilot-plant projektek generálása. A projekt kezdetekor létrejött Denex Spin-off Innovációs Kft. funkcionális ivóleveket fejlesztett ki, melyet a fogyasztói visszajelzések, az elért kutatási eredmények és a gépbeszerzések tükrében új prototípusokkal és receptúrákkal fejlesztenek. 2.2. Antifungális hatású fehérjék elıállítása, illetve érelmeszesedést gátló élelmiszeradalékok kifejlesztése (témavezetı: Dr. Pócsi István) A Penicillium chrysogenum kis molekulatömegő antifungális fehérjéjének (PAF) a heterológ expresszióját Pichia pastoris metilotróf élesztıben végeztük el. Különféle in vitro tesztekben vizsgáltuk a PAF fehérje gátló hatását különféle növénypatogén és opportunista humán patogén járomspórás és aszkomikóta gombafajokon. Kísérleteket folytattunk degenerált, illetve PAF-specifikus primerek alkalmazásával más PAF-homológ fehérjét termelı fonalasgomba fajok azonosítására is. A PAF termelés kihozatalának jelentıs javulását értük el néhány oxidatív stresszt generáló anyaggal. Számos, a P. chrysogenummal rokon faj antifungális fehérje termelését vizsgáltuk meg. A tesztelt gombák közül 3 Penicillium faj tenyészeteiben a PAF-hoz hasonló (vagy azzal megegyezı) fehérjét sikerült a PAF-ra specifikus antitesttel detektálnunk. Ezen fehérjék aminosav sorrendjének analízise MALDI- TOF technikával megtörtént. Az ezeket a fehérjéket kódoló gének szekvenciája 100 %-os homológiát mutat a paf génnel. Mivel a PAF gátolja a humán opportunista patogén Aspergillus fumigatus gomba növekedését, ezért korábbi eredményeinkre alapozva mely szerint a PAF számos jelátvitelben sérült Aspergillus nidulans mutáns növekedését gátolta és így valószínőleg a fehérje szignál útvonalakon keresztül fejti ki hatását megkezdtük számos szignál útvonalban sérült mutáns PAF érzékenységének/ rezisztenciájának vizsgálatát. Az MTA Növényvédelmi Kutatóintézettel közösen végeztük a PAF antifungális hatásának tesztelését obligát növénypatogén gombákon. Továbbá igazoltuk, hogy a PAF nem toxikus Drosophila (muslica) fajokon, ami a növényvédelmi alkalmazás egyik legfontosabb elıfeltétele. Az Abiol Kft. Penicillium fajok által termelt PAF-homológ fehérje-elemzését, hatásspektrum vizsgálatát, a fermentációs termelésoptimalizálását, illetve promóter analízisét végezte el. HPLC eljárást dolgoztunk ki ferri- és dezferri-sziderofórok kimutatására és mennyiségi meghatározására penésszel érlelt élelmiszerekbıl (tej- és húskészítményekbıl). Méréseink alapján elmondható, hogy a tesztelt élelmiszerek mindegyike tartalmazott - igen változó koncentrációban és összetételben - sziderofórokat. Az adatokból világosan látszik, hogy az élelmiszerek sziderofór tartalma, még hasonló termékek esetén is, igen nagymértékben függ az elıállítás technológiájától, azaz a technológia módosításával lehetıség nyílik a termékek sziderofór tartalmának növelésére és csökkentésére egyaránt. Optimalizáltuk a Neurospora crassa koprogén termelését rázott lombikos kísérletekben. 13
Beállítottunk egy, a sziderofór képzıdését FeCl 3 -dal láthatóvá tévı módszeren alapuló screening, és az EDTA toleranciára való szelekción alapuló szelekciós rendszert, jó koprogén termelıképességő törzsek izolálására. In vitro vizsgálatokkal igazoltuk, hogy a dezferrisziderofórok bejutnak az emberi kis sőrőségő lipoproteinbe (LDL-be), ott képes stabilan megkötni a hembıl kiszabaduló Fe3+-ionokat és, következésképpen, hatékonyan gátolja az LDL hem-mediálta oxidációját. Igazoltuk továbbá, hogy a hem-mediált oxidációtól dezferrisziderofórokkal védett LDL humán endotél sejtekre gyakorolt citotoxicitása lényegesen kisebb, mint a nem védett LDL-é, valamint azt is, hogy a dezferri-szideroforok hatékonyan fékezik az érelmeszesedés primer soft plack-jainak oxidatív károsodását. Laborkísérletekben igazoltuk, hogy az iparban használt Penicillium fajok koprogén termelésének szabályozása igen hasonló a korábban Neurospora crassanál tapasztaltakhoz, azaz a vas jelenléte és a savas ph gátolja a koprogén képzıdését. Számos penésszel érlelt húsáru sziderofór tartalmának meghatározásával igazoltuk, hogy bizonyos körülmények között lehetséges sziderofórok felhalmozódása hústartalmú készítményekben, azok vastartalma ellenére is. Egy-egy ilyen készítmény a penésszel érlelt sajtokban mért értékekkel összevethetı mennyiségben tartalmazott gomba eredető sziderofórokat, melyek dezferriformában is jelen voltak. A húsiparban használt Penicillium nalgiovense sziderofór termelése a korábban a Neurospora crassanál mért értékhez képest lényegesen érzékenyebb volt a vas jelenlétére. Meglepı módon a sziderofór tartalmú húsáruk felszínérıl visszaizolált gomba törzsek sziderofór termelése legalább olyan mértékben érzékeny volt a vas jelenlétére, mint a kontroll törzseké. Azaz, sziderofór tartalmú húsáruk a megfelelı technológia kialakításával a hagyományos ipari törzsek segítségével is megvalósítható, így elkerülhetı a törzsek nemesítése és az új törzsek élelmiszeri alkalmazásának engedélyeztetése. Rázott lombikos kísérletekben igazoltuk, hogy a vas sziderofór termelést represszáló hatása jelentısen csökkenthetı a gomba növekedésének optimalizálásával és a tápközeg vastartalmának mikrobiológiai úton történı megkötésével (kevert tenyészetek) is. Kimutattuk továbbá, hogy a vas gátló hatását keletképzık adagolásával mérsékelni lehet. A fentiek figyelembe vételével megfogalmaztunk egy stratégiát, melynek segítségével növelni lehet a gombával érlelt húsáruk sziderofór tartalmát. A sziderofórokkal kapcsolatos kutatások eredményei felhasználhatóak gyógyászati hatással rendelkezı élelmiszerek, elsısorban húsáruk, különösen kolbász- és szalámiáruk elıállítására. A termékfejlesztéssel kapcsolatos kísérleteket két ipari partnerünk, a Debreceni Hús Zrt. és a Szole Meat Húsipari Kft. végezték, az üzemi kipróbálások jelenleg is folynak. Ezzel összefüggésben lehetıség kínálkozik egy olyan minısítı rendszer kidolgozására, mellyel megállapítható, hogy élelmiszerek rendelkeznek-e a fentiekben említett, érrendszervédı hatással. 14
2.3. Bor fajélesztı törzsek elıállítása, illetve gyümölcsök-és zöldségfélék védelme a tárolás során (témavezetı: Dr. Sipiczki Mátyás) Elvégeztük a tokaji borvidékrıl izolált 16 Saccharomyces sensu stricto típusú törzs molekuláris taxonómiai vizsgálatát. Az eredmények alapján 10 törzset a S. uvarum, 5 törzset pedig a S. cerevisiae fajba lehetett besorolni. Egy törzs fajok közötti hibridnek bizonyult. Elvégeztük a törzsek egyes technológiai paramétereinek a jellemzését. A két faj legjobbnak bizonyult izolátumait hibridizáltuk. Újabb Saccharomyces sensu stricto törzseket izoláltunk a tokaji és az egri borvidéken. Az újabb eredmények alapján 12 törzset a S. uvarum, 11 törzset pedig a S. cerevisiae fajba lehetett besorolni. Két törzs fajok közötti hibridnek bizonyult. Kiterjesztettük a vizsgálatot Egerre, Badacsonyra, a Kunságra, Szekszárdra és Pécsre ebbıl létrehoztuk egy néhány száz törzsbıl álló kollekciót. Eljárásokat fejlesztettünk ki Saccharomyces törzsek keresztezésére és bebizonyítottuk, hogy az általános felfogással ellentétben nem a Candida stellata, hanem a Candida zemplinina, egy új faj, melyet nemrég laboratóriumunkban mutattunk ki, felelıs a Saccharomyces törzzsel kapcsolatban az édes borok erjedéséért. Molekuláris taxonómiai módszerek felhasználásával újravizsgáltuk a nemzetközi törzsgyőjteményekben (pl. CBS, DBVPG, RIVE, CCY, stb.) Candida stellata fajnévvel letétbe helyezett borélesztıket. Kiderült, hogy valamennyi helytelenül volt meghatározva, mert a Candida zemplinina fajhoz tartoznak. Ez az eredmény magyarázatot ad a legtöbb ellentmondásra, ami e két faj szerepét övezi az édes borok erjesztésében. Öt borászat teszteli a startereket technológiai körülmények között. Antifungális hatású élesztıket izoláltunk nemes-rothadásban levı szılırıl. A rothadás különbözı fázisaiban levı szemeket homogenizáltuk, majd egy-sejtbıl származó élesztıtenyészeteket hoztunk létre. Konvencionális (fiziológiai) és molekuláris taxonómiai módszerekkel (pl. ribotipizálás, karyotipizálás, szekvenálás, stb.) meghatároztuk az izolátumok faji hovatartozását. 27 élesztıfajt találtunk a mintákban. A Metschnikowia pulcherrima törzsek különösen széles hatásspektrummal rendelkeztek. A citológiai vizsgálatok egy felettébb komplex gátlási mechanizmust tártak fel. A Metschnikowia sejtek egy vegyületet bocsájtanak a környezetbe, ami gátolja a konídiumok csírázását és a mycélium hífáinak lízisét okozza. Kimutattuk, hogy a Metschnikowia törzsek a vas lekötésén keresztül fejtik ki gombaellenes gátló hatásukat. További antifungális hatású élesztıket izoláltunk a Vietnamban és Kambodzsában győjtött mintákból. Ezek közül az egyik egy új, eddig ismeretlen faj. Bizonyos törzsek antifungális hatását növeltük genetikai módszerekkel. A korábbi kísérletek során legmagasabb antifungális aktivitást és legerısebb bioprotekciós hatást mutató Metschnikowia izolátumot szabadalmi bejelentéssel védjük. A törzset a közelmúltban mutagenizáltuk is, hogy fokozzuk az aktivitását. A tesztekben gyümölcsökön (alma, körte, narancs, citrom, földieper, stb.) kívül zöldségféléket is bevontunk. A program keretében kifejlesztett borélesztı startertenyészetek, hazai borászok és bortermelık számára értékesíthetıek. A Gyümölcsök raktározási betegségeit okozó gombák gátlása kapcsán szabadalmi bejelentést teszünk 2008-ban. Az ezzel kapcsolatban kidolgozott eljárás alkalmas a gyümölcsök tárolási betegségeinek megakadályozására vagy késleltetésére. 15
Így tehát a hazai gyümölcstermelık és forgalmazók jöhetnek szóba, mint a technológia potenciális vásárlói és alkalmazói. 2.4. A juhtenyésztés és a pulykatenyésztés genetikai hátterének tökéletesítése (témavezetı: Dr. Jávor András) Megtörtént a Callipyge juh genetikai felépítésének meghatározása, továbbá a tejtermelési paraméterek vizsgálata ıshonos racka, cigája és awassi fajtákban. A bronzpulyka húsminıségének javítása érdekében molekuláris genetikai vizsgálatokat végeztünk. A genetikai képességek javítása révén, továbbá ezen értékmérı tulajdonságok célirányos felhasználásával elérjük az intenzív pulykafajták minıségének javítását. Juh esetében a tejtermelı képességet befolyásoló géneket vizsgáljuk és azok alkalmasságát a markerek/gének segítségével végzett szelekcióban, különbözı tejelı juhfajtákban. Továbbá, a juhoknál duplafarúságot okozó callipyge mutáció keresztezett bárányok hústermelı képességére gyakorolt hatását mértük fel. 260 anyajuh termelési eredményeit (tejhozam, tejzsír, tejfehérje, tejcukor, szomatikus sejtszám) használtuk fel az analízishez. Genotipizáltunk az ország több állományából származó növendék kost a callipyge mutációra, de egy sem bizonyult hordozónak. Összesen mintegy 300 állat tesztelése történt meg. Import suffolk spermában sikerült hordozó mintákat találnunk. A mélyfagyasztott spermával, mesterséges termékenyítéssel termékenyítettünk meg összesen 16 cigája anyajuhot. A suffolk cigája keresztezésbıl összesen 6 bárány született. In vivo real time képalkotó eljárással (ultrahang segítségével) mérjük a bır alatti faggyú vastagságát a test több pontján, meghatározzuk a hosszú hátizom és a comb keresztmetszetét, mélységét. A juh tejtermelés marker alapú szelekciójának segítéséhez elvégzett QTL vizsgálatok (13 mikroszatellit, 260 anyajuh) eredményei és a felvételezett termelési eredmények (tejhozam, tejzsír, tejfehérje, tejcukor, szomatikus sejtszám) között összefüggés vizsgálatokat végeztünk. A pulyka esetében olyan hústermelı képességet befolyásoló gének polimorfizmus és génexpressziós vizsgálatát végeztük el, melyeket keresztezéssel az ıshonos bronzpulyka fajtába szeretnénk bevinni, és a késıbbi szelekcióban markerként alkalmazni. Ehhez két olyan gént választottunk (IGF1 és TGF3béta), melyeknek irodalmi adatok alapján, tyúk esetén, jelentıs hatása van a hústermelı képességre. A genotipizálást tollból végeztük, az RNS vizsgálatokhoz szív, máj és mellizom mintákat használtunk. Ezeket cdns formában tároltuk és elvégeztük a IGF-I génre a qpcr méréseket. Az IGF1 gén esetén a múlt évben azonosítottunk egy olyan nukleotidcserét, mely a GeneBank adatbázisban közzétett szekvenciához képest a mi állományunkban kimutatható, de a saját Nagy húshozamú merino juhok állományon belül nem mutatott polimorfizmust. A Juhker Kft. biztosította a kosokat és a keresztezéshez az anyajuhokat, az állatlétszámot, illetve a vérmintákat a genotipizáláshoz. A bárányok növekedési erélyének és vágási paramétereinek felvételezését is a partner végzi. Ezek az eredmények jelentik az adatbázist a további DNS vizsgálatokhoz. A Master Good Kft. az ıshonos bronzpulyka genotípust tartja, elvégzi a vágást, és folytatja az értékmegırzı hústermékek fejlesztését. Biztosítja a biológiai mintát a DNS vizsgálatokhoz. A Bakonszeg Awassi Rt. biztosítja a tulajdonában lévı gyimesi racka és awassi állományt a vizsgálatokhoz. Adatokat győjt a termelt tej mennyiségérıl, beltartalmáról (fehérje, zsír), továbbá biztosítja a DNS munkákhoz szükséges vérminta-győjtést és beszállítást. 16
A 2.4 részprogramban két új termék keletkezett: jó húsformákat mutató keresztezett vágópulyka és callipyge mutációt hordozó magasabb húskihozatalú cigája juh. Ezeket az ipari partnerek hasznosítják állományukban. A genomikai és a tenyésztési kutatási eredmények hasznosítói elsısorban a régióban mőködı állattenyésztı vállalkozások. 17
A 3. programban elért eredmények Program koordinátor: Dr. Szilvássy Zoltán intézetigazgató, egyetemi tanár Gyógyszerjelöltek és funkcionális élelmiszerek fejlesztése ipari színvonalú, biztonság farmakológiai vizsgálatok végzésére is alkalmas preklinikai vizsgálóhelyen, a Debreceni Egyetemen. Résztvevık Debreceni Egyetem, ADEXGO Ipari Kereskedelmi és Szolgáltató Kft. 1. Biztonság-farmakológiai laboratórium felállítása (témavezetı: Dr. Szilvássy Zoltán) Két jelentıs infrastrukturális beruházás csoport valósult meg: a programot kiszolgáló GLP állatház lényegében megvalósult a DE OEC területén, a másik a valamennyi szervrendszert érintı safety pharmacology laboratóriumi vertikum felállítása megtörtént. Ezt követıen metodika-beállítások történtek, melynek eredményeként a Debreceni Egyetem Farmakológiai- és Farmakoterápiai Intézetében a biztonság-farmakológiai teljes vertikum rendelkezésre áll. A különféle metodikák és protokollok GLP akkreditációja, illetve az akkreditációval rendelkezı metodikák GLP bizonyítványának meghosszabbítása az Adexgo Kft. szerves közremőködésével folyamatossá vált. A GLP akkreditáció az Országos Gyógyszerészeti Intézet 2006. január 3-án megkezdett safety pharmacology laboratóriumi minısítési eljárásával indult (száma: 594/48/2005). A hatóság 2007. áprilisában elvégezte a GLP laboratóriumok helyszíni ellenırzését. Megállapították, hogy a beüzemelt GLP laboratóriumok messzemenıen megfelelnek az OECD és EC vonatkozó elıírásainak. Ezen ellenırzés alapján a GLP laboratóriumok minısítését további két évre meghosszabbították (a kiadott OGYI engedély száma: 33527/48/2006). A GLP rendszer birtokában jellemeztük egy magyar gyógyszerjelölt készítmény, a VITION biztonság-farmakológiai paramétereit, illetve egy peptid hatóanyag kardiovaszkuláris safety sajátosságait. Az eredeti molekula fejlesztés célja speciálisan lymphocyta kálium csatorna blokkoló immunoszupresszív gyógyszerjelölt fejlesztése. Ezen a területen nem sikerült szabadalommal védhetı molekulát kifejleszteni a terület rendkívül kompetitív természete miatt. A furopyridin alapvázú gyógyszerjelölt csoport fejlesztését megindítottuk abból a célból, hogy a furopyridin családban a szabadalmaztatott cicletanine mellé követı molekulákat tudjunk az asthma indikációban elırehaladott preklinikai fázisba hozni. Az említett egységek megteremtésével a Debreceni Egyetem és a magyar gyógyszergyárak közötti kapcsolatot igen szoros és tartós együttmőködéssé fejlesztjük, melynek révén a Debreceni Egyetem az egész magyar gyógyszeripar számára egy fontos és nélkülözhetetlen 18
partnerré válik. A folyamat egyik sikeres mérföldköve a Richter Gedeon Nyrt. új biotechnológiai üzemének Debrecenbe telepítése. Szőkebb szakmai szempontból fontos, hogy a projekttel olyan programot hoztunk létre, amely felgyorsítja a gyógyszer- és egészségmegırzı termékek piacra jutását, valamint integráljuk a farmakoterápia és az orvosilag ellenırzött diéta elınyeit a metabolikus szindróma kezelése és megelızése érdekében. 2. A cicletanine, mint potenciális antidiabetikum (témavezetı: Dr. Szilvássy Zoltán) A kísérletek alapján egyértelmővé vált, hogy a cicletanine képes inzulin-érzékenyítı hatás indukálására két állatfajon. Kiderült az is, hogy az inzulin-érzékenyítı hatás mechanizmusában elkülönül valamennyi eddig ismert inzulin érzékenyítı szer hatásmechanizmusától. Az eredmények alapján a cicletanine, mint ciklikus GMP foszfodiészteráz gátló egy endogén inzulin szenzitizáló mechanizmus, a HISS mechanizmus aktiválásával fejti ki potenciális antidiabetikus hatását. A cicletanine ezt a hatást az ismert kardiovaszkuláris hatások kifejtéséhez szükséges dózis 30-40%-án ki tudja fejteni, ezért ezzel a fejlesztéssel kapcsolatban sem biztonság farmakológiai, sem toxikológiai problémák nem merülnek fel. A technológia hasznosítására létrejött Sensocrine Pharma Kft. szabadalmi bejelentést nyújtott be Gyógyszerkészítmény elzáródásos és gyulladásos légúti betegségek kezelésére P060815 címmel. További vizsgálatok során kiderült, hogy a cicletanine inzulin érzékenyítı hatása mellett növeli a szívizom vérellátási zavarokkal szembeni tőrıképességét, valamint védelmet jelent szívritmuszavarokkal szemben. Ennek megfelelıen az elvégzett kísérletek azt célozták, hogy a cicletanin inzulin érzékenyítı hatása alapján fejt-e ki antidiabetikus hatást, ill. az ehhez szükséges dózis elegendı-e a kedvezı szív-és érrendszeri hatások kiváltásához. A cicletanine inzulin érzékenyítı hatása alapján képes antidiabetikus hatás elérésére inzulin rezisztens ún. Zucker-obes patkányokon, ill. cukorbeteg nyulakon. Az említett hatások 10 mg/testsúly kg orális cicletanine dózisok mellett kialakulnak azaz legalábbis állatkísérletekben harmad akkora dózisok mellett, mint amennyi a korábban ismert vérnyomáscsökkentı hatás elıidézéséhez szükséges. Az eredmények alapján lehetséges a cicletanine orális antidiabetikumként történı kifejlesztése, ezzel kapcsolatban projektjavaslat készül gyógyszeripari szereplık számára. Az alprogramban folytatott gyógyszeripari fejlesztések jelenleg még bizalmas információt képeznek az igen nagy piaci verseny miatt. Két nagy hazai gyógyszergyárral is folynak egyeztetések a technológiák továbbfejlesztése érdekében. A részprogram hatására alakult meg a Sensocrine Pharma Kft. spin-off vállalkozás, melynek sikerült tıkét bevonnia a további fejlesztésekbe. 3. Skorpió méreg vizsgálata (témavezetı: Dr. Panyi György) A Mexikóban honos Centruroides elegans skorpió toxinjának peptidjeit tanulmányoztuk. A peptidek homogenitási és kromatográfiás tisztítása után automatikus Edman degradációs 19
procedúrával meghatároztuk a teljes aminosav szekvenciákat. Tekintettel arra, hogy a humán T-lymphocytákhoz kötıdı immunfolyamatokban a KV1.3. csatornák játszanak központi szerepet, ill. hogy ezek a peptidek igen affinisak a KV1.3. csatornákhoz, mint blokkoló szerek, ezen peptidek alapján specifikus immunoszuppresszív molekulák fejlesztését kezdtük meg. Molekuláris biológiai módszereket alkalmaztunk a természetes Kv1.3 csatorna gátló hatású skorpió toxinoknál biztonságosabb mesterséges peptidek elıállítására. A peptid toxinok szelektivitására vonatkozó kísérletes háttér fejlesztésében létrehoztunk egy olyan rekombináns ioncsatorna bankot, melynek felhasználásával a molekulák szelektivitása tesztelhetı. Ez a munka magába foglalta a rekombináns ioncsatorna klónok beszerzését, a megfelelı gazda sejtvonal kiválasztását, a transzfekciós eljárás és az oldatok ionösszetételének optimalizálását. Két kis peptid molekulát izoláltunk a Centruroides suffusus suffusus és Tityus stigmurus skorpiók teljes méreganyagából, melyek nagy affinitással gátolják a Kv1.3 csatornákat. Sikeresen befejeztük a toxinok farmakológiai karakterizálását. További eredményünk a korábban elıállított szintetikus anuroctoxin többszöri reprodukálható elıállítása, mely vad típusú toxinnal megegyezı hatását elektrofiziológiai méréseinkkel igazoltuk. Irodalmi adatok, valamint a Css20 toxinnal kapott szimulációs eredmények alapján a Kv1.3 iránti megnövelt affinitás és szelektivitás érdekében célzott pontmutációkat terveztünk a toxinban, és elkezdtük a mutáns toxinok elıállítását. Létrehoztunk egy olyan rekombináns ioncsatorna bankot, melynek felhasználásával a molekulák szelektivitása tesztelhetı. Ez a munka magába foglalta a rekombináns ioncsatorna klónok beszerzését, a megfelelı gazda sejtvonal kiválasztását, a transzfekciós eljárás és az oldatok ionösszetételének optimalizálását Az alábbi táblázat foglalja össze az ioncsatorna bank tagjait és fı tulajdonságaikat. Az így létrejött ioncsatorna bank, mindamellett, hogy a jelen kutatási program megvalósításának jelentıs eleme, lehetıséget nyújt arra is, hogy drugscreening szolgáltatással jelentkezzünk a piacon. Az ioncsatorna-bank felhasználásával jelenleg is folyik a korábban tisztított peptidek farmakológiai karakterizálása. 4. Peptidek szájon át történı alkalmazhatósága (témavezetı: Dr. Tızsér József) Gyógyszerkombinációt fejlesztettünk, ahol a kombináció másik partnere kvázi vivıanyagként szerepel. Az általunk alkalmazott kombinációs partner az ε-amino kapronsav (gyógyszerként törzskönyvezett anyag, acepramin, melyet vérzéscsillapítóként alkalmaznak, és gyakorlatilag nincs toxicitása, 30-50 g dózisban alkalmazható intravénásan is). Eredményeink szerint az ε-amino kapronsav-inzulin, ill. ε-amino kapronsav-cck kombinációval patkányon sikerrel alkalmazható orálisan mindkét peptid. A fix generikus kombináció fejlesztése révén technológiát dolgoztunk ki, ami peptidek szájon át, gyógyszerként történı alkalmazását jelenti. A kutatások során kidolgoztuk az orális inzulin, illetve a cholecystokinin alkalmazhatóságának a technológiáját és cukorbetegség, illetve epeúti prokinetikum, valamint étvágycsökkentı gyógyszerjelölt fejlesztéseket végeztünk. Ezen túlmenıen elıkészítettük egy újonnan megismert peptid, a neurális somatostatin analóg thrittén/ill módosulatai indikációs területeik meghatározását migrén, asztma, gyulladásos megbetegedések, illetve krónikus fájdalom kezelésére. A kidolgozott technológia révén ebben a betegség-csoportban a thrittén analógok orális alkalmazhatóságának módszereit feltártuk. 20