Talajok, természetes vizek, szennyvizek állapotának felmérése, a szennyezett területek tisztulási folyamatának nyomonkövetése Talajok, vizek minıségének meghatározása fizikai, kémiai, biológai vizsgálatok elvégzésébıl és kielemzésébıl áll. A kémiai minısítés a klasszikus komponensek, valamint mikroszennyezık, radioaktivitás meghatározása. Fizikai felmérések pl. a talaj porozitása, vizek sótartalma, hımérséklet (pl. hıszennyezés esetén fontos). A szennyvizek, szennyezett talajok igen sokféle szerves anyagot tartalmaznak, melyek egyenkénti mennyiségi meghatározása (sıt kimutatása is) rendkívül körülményes, ezért mennyiségüket közvetve mérve azzal az oxigénmennyiséggel jellemezzük, mely adott körülmények között oxidálásukra elhasználódik. Az oxigénigény meghatározására kétféle módszert alkalmazunk: A természetben lejátszódó folyamatokat legjobban a biokémiai oxigénigény (BOI) közelíti meg, de idıigényes. A BOI az az oxigénmennyiség, amely a vízben levı szerves anyagok aerob úton, meghatározott idı alatt történı (ált. 5 nap) biokémiai lebontása során elfogy. BOI 5 = mg O 2 /L. A teljes biokémiai oxigénigény (TBOI) a szerves szennyezık teljes lebontásához szükséges oxigén mennyisége. A BOI nagy idıigénye miatt gyakrabban alkalmazzák a kémiai oxigénigény (KOI) meghatározást. A víz (talajminta) K-permanganáttal vagy K-dikromáttal (erélyesebb oxidálószer, így pontosabb eredményt ad) történı forralása során elhasználódott vegyszerrel egyenértékő oxigénfogyasztással jellemeznek. További mérhetı paraméterek a szennyezettség illetve a tisztulás meghatározására a nitrogén-, foszfor-, szerves- és totál szén tartalom, a ph, valamint a mikroflóra összetétele, változása is információt nyújt a vizsgált minta állapotáról. A biológiai vízminıség azon tulajdonságok összessége, melyek a vízi ökoszisztémák életében fontosak, létrehozzák, és fenntartják azokat: halobitás, trofitás, szaprofitás, toxicitás. A toxicitás a víz mérgezıképessége, olyan anyagok jelenléte, melyek a vízi élılények életmőködését zavarják, csökkentik az öntisztulóképességet. Pl. toxinok, bomlástermékek, szintetikus anyagok. Mértékét biológiai tesztekkel állapítják meg, azzal a hígítással jellemzik, melyben adott idı alatt a kísérleti élılények fele életben marad. I. Szennyvizekben, szennyezett talajokban a biológiai oxigénigény mérése Szennyvizek, szennyezett talajok vizsgálata során hasznos információt nyújthat a szennyezettség fokáról, és a mikroflóra jelenlétérıl vagy hiányáról az oxigénfogyasztási ráta mérése. Mérni lehet oxigén szenzitív elektróddal a minta oldott oxigén szintjét, a legjobb megoldás erre a membránelektród módszer, melynek lényege, hogy az elektród egy oxigén-permeábilis membránnal védett, ami védi az elektródot a szennyezıdésektıl, de az oxigén számára átjárható. Állandó feltételek mellett a mért áram (kiírón megjeleníthetı, és a ráillesztett egyenes meredekségébıl számolható az oldott oxigén konc. változása) egyenesen arányos az oldott oxigén koncentrációval. A biológiai oxigénigény meghatározására alkalmazott öt napos mérési módszer egyszerő, bár hosszadalmas. A mérendı minta szervesanyagainak biokémiai elbontásához felhasznált oxigén koncentrációt határozhatjuk meg (figyelembe kell venni azonban, hogy a szulfidok, Fe 2+ ionok, valamint a nitrogén redukált formáinak oxidálására elhasznált oxigént is mérjük ebben a tesztben. Az utóbbi inhibítorokkal gátolható). Amennyiben egy mikroorganizmus képes felhasználni a talajban található szennyezıdéseket, az ehhez szükséges oxigén fogyasztás mértéke az alábbi módszerrel egyszerően detektálható. BOI 5 mérése: Kellékek: BOI üvegek tartozékokkal, inkubátor (20 C), pipetta, mérıhenger, mikroorganizmusok Anyagok: imitált szennyvíz minta 5 x M9 törzsoldat: 15 g KH 2 PO 4, 64 g Na 2 HPO 4 x 7H 2 O, 2,5 g NaCl (ph=7,0) M9 minimál tápoldat: 200 ml 5 x M9, 2 ml 1 M MgSO 4, 0,1 ml 1 M CaCl 2 felhasznált mikroorganizmusok: pl. Sphingomonas subarctica., Bacillus megaterium, Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis 1
A gyakorlat menete: Pipettával a szennyezıanyag törzsoldatából kiveszünk annyit, hogy a végkoncentrációja 5 mm legyen, majd M9 tápoldattal kiegészítjük a BOI üvegekbe (a végtérfogat 97 ml legyen). A negatív kontroll üveg kivételével az üvegekbe 5-5 ml mikroorganizmus kultúrát mérünk, keverıbotot dobunk bele, az üveg szájában lévı kosárba két-két NaOH szemcsét ejtünk, majd lezárjuk a speciális mérıfejjel az üvegeket (A NaOH szerepe, hogy a keletkezı CO 2 -ot megkösse. A mérıfej az oxigén fogyasztás által kialakult nyomásváltozást méri, amit a keletkezı széndioxid pontatlanná tenne). Az indításhoz nyomjuk le egyszerre a fejen lévı két fekete gombot, és lenyomva tartjuk a 00 megjelenéséig. Az üvegeket 20 C-os inkubátorban lévı keverılapra tesszük. Öt nap elteltével az üvegek fejében tárolt adatokat leolvassuk, kiértékeljük. Az M gomb megnyomásával megjelenítjük a számokat, léptetni az S gomb megnyomásával lehet. Az S gombot kétszer kell megnyomni, hogy megjelenjen az I., mely az elsı napot jelenti, rögtön megjelenik a hozzátartozó érték is, majd az S megnyomásával lépünk tovább a 2. napra. A leolvasott adatokat 97ml térfogat esetén 20-al megszorozva kapjuk meg az oxigén igény értékeket mg O 2 /L ben. Feladat: a kapott értékek elemzése, értékelése a kontroll(ok) figyelembevételével. II. Húsfeldolgozó üzemekben keletkezı keratintartalmú hulladék lebontása mikrobiológiai úton Demostratív gyakorlat a napi aktuális problémák közül. Be szeretnénk mutatni egy olyan újonnan kifejlesztett illetve még jelenleg is fejlesztés alatt álló eljárást, amelynek során a húsipar által kibocsátott nagy mennyiségő keratin fehérjét tartalmazó hulladék mikrobiális eljárással feldolgozható. Önmagukban a toll, szır, köröm, képletek nem toxikusak, azonban szervesanyagtartalmuk igen nagy, így veszélyes hulladéknak minısülnek. Elhelyezésükre, megsemmisítésükre jelenleg nincs elfogadott módszer, így igen fontossá válik mikrobiális lebontásuk. Az állati eredető tollak, szırık természetes úton nagyon lassú mikrobiális aktivitás eredményeképpen lebomlanak. A toll, szır képletek stabilitását az azokat felépítı keratin szálak között kialakult kénhidak biztosítják. A baromfi feldolgozó üzemekben nagy mennyiségben keletkezı hulladékot a természetes folyamatnál sokkal gyorsabban kell eltávolítani a környezetbıl, hiszen elhelyezése, tárolása gondot jelent. A biológiai lebontáshoz megfelelı mikroorganizmust kellett találni, mely az üzemekbıl kikerülı tollat hatékonyan elbontja nagy mennyiségben is. Elsısorban dermatofita gombák, Streptomycesek, Bacillus licheniformis bontják több-kevesebb sikerrel. Sikerült izolálnunk egy mikroorganizmust, mely rövid adaptációs idı után képes a leforrázott tollat egy nap alatt elbontani extracelluláris proteázai segítségével, és saját szaporodásához felhasználni a szerves anyagot. Hosszúkás, pálca formájú baktérium, mely kedvezıtlen körülmények között gömb formájú, mikroszkóp alatt látványos, fényes spórákat képez. Elınye, hogy már az inkubálás elsı napján elkezdi termelni keratinolitikus aktivitású extracelluláris proteázát. A keratin vízben oldhatatlan fehérje (1. ábra), mely igen ellenálló a proteolitikus aktivitással rendelkezı enzimekkel szemben. Három fı csoportba sorolható fehérje építi fel: 1. glicin/tirozin gazdag fehérjék (6-9K) 2. alacsony kéntartalmú fehérjék (40-60K), melyek ~10nm-es filamentumokat alkotnak 3. magas kéntartalmú fehérjék (10-25K). Az 1. és 3. csoportba tartozó fehérjék a filamentumok közötti anyagot képezik. A filamentumok között kénhidak és másodlagos hidrogén kötések alakulnak ki, melyek nagy számuk miatt megnehezítik a keratin mikrobiális lebontását. Habár keratin felhalmozódás a természetben eddig nem volt tapasztalható, lebomlása igen lassú folyamat. Több módszer is lehetséges ezen diszulfid hidak felhasítására. Ezek közül említhetjük a kémiai kezeléseket. Az egyik legdrasztikusabb módszer a savas hidrolízis. Ez esetben teljesen elroncsoljuk a fehérjét NaOH-al való kezelés esetén töménységtıl függıen a keratin fehérjét aminosavaira bontjuk, és a keletkezett hidrolizátumot tápanyagként alkalmazzuk a baktériumok számára. A hidrolízist magas hımérsékleten (forralva) kell elvégezni. Egyéb kémiai módszerek is 2
léteznek pl.: thioglikolsav, dithiothreitol vagy dimetilszulfoxid redukálószerekkel történı elıkezelések, azonban az itt alkalmazott vegyszerek környezetet károsító, veszélyes anyagoknak minısülnek, ezért ezek a módszerek nem jelenthetnek megfelelı megoldást. További lehetséges megoldás a hıkezelés. Magas hımérsékleten, nyomás alatt a keratinban lévı kénhidak jelentıs része elbomlik, közben káros melléktermék nem keletkezik. Hidrofób- és van der Waals kölcsönhatások Hidrogén kötés Polipeptid váz Diszulfid híd Ionos kötés 1. ábra Az α-keratin szerkezeti felépítése Hıkezelést követıen a fehérje elveszíti stabil szerkezetét, így a mikróbák által termelt proteázok számára hozzáférhetıvé válik. A mikroorganizmusok által termelt proteázoknak több típusa létezik. Azon proteázokat, melyek a sejten kívül fejtik ki aktivitásukat extracelluláris proteázoknak, amelyek a sejten belül intracelluláris proteázoknak nevezzük. A keratin tartalmú szennyezıdések eltávolítására csak az extracelluláris proteázok jöhetnek szóba. A proteázok csoportosíthatóak aszerint, hogy milyen felépítéső aktív centrummal rendelkeznek. Léteznek szerin, cisztein, aszparagin típusú, illetve metalloproteázok. A metalloproteázok aktív centrumában fém iont találunk, míg a szerin, cisztein és aszparagin títusú proteázok aktív centrumában szerin, cisztein illetve aszparagin helyezkedik el. További fontos ismertetıjegye a proteázoknak mőködésük ph optimuma. A ph optimum alapján megkülönböztetünk alkalikus, semleges és savanyú proteázokat. Egyes enzimek aktivitása magas hımérsékleten maximális, ezeket nevezzük hı-, vagy termostabil proteázoknak. A GYAKORLAT MENETE A kísérlet során a mikroorganizmust tápanyagdús (pepton, élesztıkivonat) oldatban elıneveljük. A hıkezelt (v. nem kezelt) tollat tartalmazó foszfátos oldatokba (ph=8.0) inokuláljuk az elınevelt kultúra 1-1 ml-ét. A toll tartalmú kultúrát 43 C-on, 150 rpm sebességgel keverve inkubáljuk. Másnapra jól látszik a tollakon a változás, demonstrálva, hogy ilyen komplex összetett stabil struktúrák, mint a toll is bonthatóak mikrobiológiai módszerekkel. (Az intenzív növekedési szakaszban a kultúrához friss tolldarabokat (hıkezelt, nem hıkezelt) mérhetünk). Az enzim jelenléte kimutatható enzimaktivitás méréssel a tápfolyadékból. A lecentrifugált sejtek felülúszóját használjuk, szubsztrátként pedig oldott keratint, ennek hiányában kazeint vagy bovine serum albumint (BSA). A reakcióelegy összemérése után 50-65 C közötti hımérsékletet biztosítva, nyomonkövethetı a fehérjetartalom változása 280 nm-en. 3
Vízoldékony keratin elıállítása: Hibino [Hibino 1985] eljárását alkalmazzuk módosítva: autoklávozzuk a keratin tartalmú anyagokat 142 C-on, 45 percig. Ezt követıen mossuk 140 mm NaCl, 100 mm TRIS-HCl, ph=8.0 pufferoldatban. A nem oldódó frakcióhoz 8 M urea, 50 mm 2-merkaptoetanol, 25 mm TRIS-HCl, ph=9.0 pufferoldatot adunk, majd inkubáljuk egy éjszakán keresztül 45 C-on. A felülúszót 5 mm TRIS-HCl, ph=3,5 oldatban dializáljuk. A keratin ph=5.0 alatt kicsapódik. A kapott csapadékot lecentrifugáljuk (10000 rpm, 10 perc), majd 5 mm foszfát pufferoldatban feloldjuk (ph=8.0). Enzimaktivitás mérés: Poliakrilamid gélen: Fehérjével (1 mg/ml BSA, kazein, keratin) keresztkötött poliakrilamid gélelektroforézis: elkészítjük az akrilamid gélt a szokásos módon [Sambrook és mtsai 1989], azzal a különbséggel, hogy az elegyhez még polimerizáció elıtt hozzámérjük a fent említett fehérjék egyikét. A mintákat forralás nélkül mérjük a gél zsebeibe, az aktivitás megóvása érdekében. A futtatás után a gélt 50 ml 2.5 % Triton X-100 oldatban mossuk. A megmosott gélt 50 ml 0.1 M glicin-naoh ph=8.3 oldatban min. 4 órát inkubáljuk, majd Coomassie Brillant Blue R-250 festékkel tesszük láthatóvá a gélben az el nem bontott fehérje hátteret. A nem specifikus festıdést színtelenítı oldattal távolítjuk el. Fotometriás úton: A keratin tartalmú reakcióelegy fehérjetartalmának változását 280 nm-en követjük nyomon, az enzimet tartalmazó oldat hozzáadását követıen. Reakcióelegy összetétele: 5 mm foszfát puffer (ph=8.0), 0,5 ml 0,3 mg/ml-es keratin oldat, 0,2 mg/ml fehérjét tartalmazó enzimoldat 3 ml végtérfogatban. III. Foszfát mobilizáció A foszfor környezetünk egyik legfontosabb eleme, a természetben ásványi formájában található meg, leggyakrabban foszfátként. Egy átlagos talajban a foszfor tartalom kb 0,05% (w/w), de ennek csak 0,1%-a hozzáférhetı a növények számára. A növények tápanyagaikat a Liebig-féle minimumtörvény szerint veszik fel környezetükbıl, atomarányt tekintve C : H : O : N : P = 106 : 263-2- : 110 : 16 : 1. A növények gyakorlatilag csak ortofoszfát ionokat (H 2 PO 4 és HPO 4 a ph-tól függıen) képesek felvenni, míg a szerves és szervetlen kondenzált (pyro-, meta-, és egyéb polifoszfátok) forma értéktelen számukra. A foszfor az élıvilág legfontosabb növekedéskorlátozó eleme, ezért a kutatók régóta próbálják növelni a növények számára hozzáférhetı foszfor frakciót foszfor mobilizáló mikroorganzimusok segítségével. Nemcsak a foszforhiány okozhat problémákat, hanem a foszforfelesleg is (rossz illetve mértéktelen mőtrágyázás). Bár ennek hatása csak közvetve érzékelhetı, de kimutatták, hogy nitrogén-, vas- és cinkhiányt indukálhat a növényekben, ezért különösen fontos, hogy a foszfor mőtrágyákat természetes folyamatokkal váltsuk ki. Ezzel elkerülhetı a nagy dózisban alkalmazott mőtrágya használata, és bizonyos mikroorganizmusok folyamatosan a szükséges mennyiségben produkálják a növények számára felvehetı foszfor tartalmú vegyületeket. Magasabb rendő szervezetekben szintén létfontosságú foszfor vegyületeket találunk. Az energia raktározó szerep (ATP) mellett megtaláljuk az örökítı nukleinsavakban, a sejtmembránt felépítı molekulákban, és létfontosságú szerepe van a csontképzésben - egy emberben átlagosan 7-800 g foszfort találunk, melynek kb. 80%-a szervetlen sója, a trikálcium foszfát formájában a csontokba épült be. Az elpusztult gerinces élılények vázrendszere komoly foszfor forrás lehet a növények számára, amennyiben baktériumok segítségével szervetlen, ortofoszfáttá tudjuk alakítani. Mivel a csontok foszfor tartalma rendkívül magas, ezért célszerő foszfor forrásként újra hasznosítani. Ezen felül a megfelelıen elıkezelt csontliszt kiváló hordozóként is hasznosítható, immobilizált sejtes eljárások esetén. Amennyiben kíméletes, oxigénmentes környezetben hıkezeljük a csontlisztet, számos értékes alkotó vegyület megtartja eredeti szerkezetét, többek között a szerves foszfor vegyületek is. Ezáltal a hordozóként alkalmazott csontlisztet egyszerre rögzítı-, és tápanyagként is tudják hasznosítani az alkalmazott mikroorganizmusok. 4
Ezt a lehetıséget kihasználva olyan eljárást dolgoztunk, melyben foszfor mobilizáló mikroorganizmusokat kötöttünk speciálisan elıkezelt csontliszt szemcsékhez, melyek a talajba kijuttatva a csontliszt hasznos molekuláit átalakítva nemcsak saját számukra, hanem környezetüknek is biztosítanak megfelelı tápanyagot. Mivel a szerves foszfor vegyületek ortofoszfáttá alakulnak, így ebben a formában a növények számára felvehetı. Foszfát tartalom mérés A keletkezı szervetlen foszfátokat fotometriás módszer segítségével mértük. ( Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. (1992) American Public Health Association, Washington. ISBN 0-87553-207-1.) A mérés azon az elven alapszik, hogy savas közegben az alkalmazott ammónium molibdát reagál az oldatban jelenlévı ortofoszfáttal heteropolisavat képezve. Vanádium jelenlétében sárga színő vegyület vanadomolibdofoszforsav keletkezik, mely 400 nm tartományban fotometriásan jól mérhetı. 1. Reaktív foszfát tartalom meghatározása Azokat a foszfátokat, melyek mérhetıek kolorimetriás teszttel elızetes hidrolizis vagy oxidatív emésztés nélkül egy mintában reaktív foszfor -nak hívjuk. 3,5 ml mintához 1 ml vanadát-molibdát reagenst mérünk, 5 ml-re kiegészítjük, 10 percig szobahımérsékleten inkubáljuk, majd 405 nm-en mérjük az abszorbanciáját a mintáknak foszfátot nem tartalmazó vak oldattal szemben. Standard foszfát oldattal felvesszük a kalibrációt, ennek segítségével határozzuk meg a minta reaktív foszát tartalmát. 700 reaktív foszfor tartalom megatározásához kalibrációs "egyenes" mért reaktív P tartalom µ g/ml 600 500 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 500 600 valós foszfor tartalom µg P/ml 1. ábra A tápoldat kolorimetriás módszerrel meghatározott foszfortartalma a valós bemérés függvényében Az 1. ábrán bemutatott egyenes azt bizonyítja, hogy a mérési módszer segítségével pontosan megkapjuk az oldott foszfátok mennyiségét a tápoldatban, hiszen a mérési pontok az egyenesre esnek. A gyakorlaton húsliszt és csontliszt szubsztrátból mobilizáljuk a foszfátot egy baktérium segítségével, különbözı koncentrációban, a kontroll a sejtmentes elegy lesz. 5