TÉZISEK 1. Bevezetés Az elmúlt két évtizedben az apoptozisra vonatkozó ismereteink bovültek. Több mint 30 új molekulát fedeztek fel, melyekrol tudott, hogy az apoptozis keltésében és szabályozásában fontos szerepet játszanak. További mint egy 20 olyan molekuláról, melyek köztudottan a jelátvitelben, a DNS replikációjában, transzkripcióban vagy riperben fejtik ki hatásukat, az is kiderült, hogy az apoptozis szabályozásában is jelentos szerepük van. Apoptotikus sejthalál figyelheto meg az egyed fejlodés során, a normál szövetek turnover-ében, az endocrin vagy más behatásokra bekövetkezo atrophiában, az immunrendszer negatív szelekciós mechanizmusaiban és a T-sejtek által kiváltott sejtölo folyamatokban. Hasonlóan cytotoxikus vegyületek, hypoxia és vírusfertozések is okozhatnak apoptozist. Jelentos szerepe van az apoptozisnak a daganatokon belül észlelheto sejtkinetikában, mind növekedés, mind regresszió során. Számos daganatnövekedést gátló szer apoptozis keltése révén fejti ki hatását és a daganatkeletkezés folyamatát is jelentosen befolyásolja az apoptosis szelektív kritikus hiánya, mely lehetové teszi mutagen DNS károsodást szenvedett sejtek túlélését. Felismerték, hogy a fiziológiás sejthalál legtöbb ha nem minden esetben apoptozisnak felel meg és az apoptozis élettani mértékének megváltozása számos betegség kialakulásához vezethet. Az apoptozis alapveto mechanizmusát illetoen számos génszerepére mutattak rá. Vizsgálataink során figyelmünket elsosorban a P53-ra, a Bcl 2 -re és a Bax-ra fordítottuk. A retinolsavról kimutatták, hogy apoptosist indukál. A magunk részérol a retinolsav receptor (RAR) kapcsolatát tanulmányoztuk a neuroblastomákban és a ritkán eloforduló peripheriás neuroektodermal tumorokban (PNET) észlelheto apoptozissal. A tumor suppressor P53 gén a human tumorokban leggyakoribb mutáns gén. A P53 protein szint genotoxikus károsító hatásokra emelkedik. Ez az emelkedés fokozott transcriptio és protein stabilizáció eredménye és felelos a G 1 /S fázisban bekövetkezo sejtciklus leállásért, majd a DNS repair-ért vagy az apoptozisért. Mivel a P53 a genotoxikus károsításra adott sejtválasz elsodleges mediátora, ezen gén megváltozott kifejezodése és funkciója utat nyithat potenciálisan káros genetikai károsodások tovább terjedésének, mely végül is onkogenezishez vezet. A P53 muködése sejttípustól és az élettani körülményektol függhet. Cytokinek és növekedési faktorok befolyásolják a P53 apoptozist indukáló vagy sejtproliferációt gátló képességét. Ezek az adatok vezettek ahhoz a következtetéshez, hogy a genotoxikus hatásra a P53 un. checkpoint control ként viselkedik, leállítva a sejtciklus további haladását és így fenntartva a genom integritását. A Bcl 2 volt egyike a legkorábban felfedezett apoptozist szabályozó géneknek, emlosökben. Számos olyan Bcl 2 -szeru gént is felismertek, melyek inkább gátolják, mint serkentik az apoptozist. Ezek legjobban jellemezett prototípusa a Bax. A Bax fokozott kifejezodése apoptozist kelthet, kölcsönhatásba léphet antiapoptotikus génekkel, mint a Bcl 2. A Bcl család pro- és antiapoptotikus tagjainak kölcsönhatása, egyensúlya, vagy valamelyik gén túlsúlya meghatározója lehet a sejt további sorsának. A Retinoidok mélyreható befolyással rendelkeznek a gerincesek normál fejlodésére és bizonyos felnott egyedekben található szövetek élettani muködésének fenntartására. Számos gyógyszerként
alkalmazott kémiai anyag apoptozist indukál neuroblastoma sejtekben, így pl. a retinoidok. Az ALL-trans retinolsav (ATRA) bizonyítottan rendelkezik ilyen hatással. A magi retinolsav receptorok (RAR) és a magi retinoid X receptorok (RXR) felfedezése nagyban elosegítette a retinolsav (RA) muködése biológiai alapjainak megértését. Ezek a receptorok a steroid/thyroid hormon receptorok multigén családjába tartoznak, és pedig olyan, RA által indukálható transzkriptios szabályozó faktorok, melyek génexpresszio szintjén továbbítják a RA szignált. Három altípusuk ismert (?,?,?) melyek közül mi a RAR-? -t vizsgáltuk. Vizsgálataink során néhány endokrin ill. neurendokrin tumor (pajzsmirigy, mellékpajzsmirigy daganatok, ill. neuroblastoma és PNET) peripheral neuroektodermal tumor) apoptotikus és proliferatív aktivitásának olyan sajátosságait ismertetik meg, melyek lehetové tették néhány új szempont felvetését ezen tumorok differenciáldiagnosztikájában és therapiájában. A Neuroblastoma gyermekkori embryonalis tumor, mely a neural crest származéka. Ez a daganat azzal a ritka tulajdonsággal rendelkezik, hogy elvétve spontán regressziót, ill. differnciálódást mutat. Egyes esetekben a differenciálódás egészen a jóindulatú ganglioneuroma fokát is elérheti. A neuroblastomák tehát genetikailag és klinikailag heterogének. Egyes esetekben viszont rezisztensek. Ez a jelenség is oka volt annak, hogy a neuroblastomákban észlelheto spontán apoptozis mértékét tanulmányozzuk. A pajzsmirigy göbös elváltozásai a malignitás lehetséges veszélye miatt régóta különös figyelmet érdemeltek. Ezek az elváltozások nokben gyakoribbak, mint férfiakban (3-4:1) és a daganatnak bizonyuló göbök nem ritkán multinodularis golyva, továbbá más a szimmetrikus, nem daganatos pajzsmirigy laesiok, pl. Hashimoto struma mellett észlelhetok. A daganatok több, mint 90 %-a a pajzsmirigyben adenoma. A pajzsmirigy rák középkorúak többségében nok betegsége, de a ritka, pubertas elotti és menopausa utáni esetekben ez nem érvényesül. A fentiekkel összefügghet, hogy a legtöbb, jól differenciált pajzsmirigy rák sejtjei oestrogen receptorral bírnak. Vizsgálataink során adenomák és carcinomák spontán apoptotikus aktivitását, P53, Bcl 2 és Bax expresszioját tanulmányoztuk. A mellékpajzsmirigy elváltozásai körül a hyperparathyreozis keltette fel érdeklodésünket. Ezen belül primaer és sekundaer hyperparathyreozisban vizsgáltuk adenomák és hyperplaziák szöveti szerkezetét, továbbá a P53, Bcl 2 és Bax expressziot a fenti elváltozások különbözo sejtjeiben. A mellékpajzsmirigy meghatározó sejtes eleme a fosejt, melybol több, átmeneti jellegu sejtforma származik. A fosejtek parathormont tartalmazó secretoros granulumokkal rendelkeznek és lipofuscint is tartalmaznak. A fosejtekbol cytoplasmájukban glycogent felhalmozó un. Világos sejtek alakulhatnak ki. Nagytömeg Mitochondriummal rendelkeznek az oxyphil sejtek, melyek elszórtan vagy csoportokban találhatók a mirigyben. A mellékpajzsmirigy adenomái majdnem mindig solitaerek és 0,5-5 g súlyúak, de lehetnek még ennél is nagyobbak. Ha egynél több adenomát találunk, mindig ki kell zárni a nodularis hyperplasia lehetoségét. A primaer hyperplasia lehet sporadicus, vagy a MEN I, ill. MEN II/a szindróma része. A hyperplasiát lehet diffúz vagy nodularis, többségében fosejtek alkotják, de mindig megtalálhatók az oxyphil sejtek és kisebb számban a világos sejtek is. A mellékpajzsmirigy hyperplasiája az esetek dönto többségében sekundaer, idült veseelégtelenségben, szenvedo betegekben figyelheto meg (uraemiás hyperparathyreozis). Néha súlyos D vitaminhiány és osteomalacia állhat a háttérben.
Veseelégtelenségben a hyperparathyreozist foszfát visszatartás és hypokalcaemia váltja ki, mely a mellékpajzsmirigy fokozott muködését követeli meg. Az endokrin szervek, ill. endokrin szervdaganatok spontán apoptozis-indexe alacsony. Ismeretes azonban, hogy az endokrin sejtek által termelt hormonok, mint pl. a parathormon és a luteinizáló hormon más szervekben apoptozist keltenek. Ez önmagában egy védekezo mechanizmust tételez fel az endokrin sejtekben, az apoptozissal szemben. Kutató munkám fo célját ez az elképzelés adta és célom volt, hogy foként a Bcl 2 -Bax viszonylatában ezt a kérdést jobban megvilágító vizsgálatokat végezzek. Célkituzés Munkám célkituzései a következok voltak: 1. Apoptotikus és proliferatív aktivitás pajzsmirigy tumorokban. 1.1. Spontán apoptotikus aktivitás vizsgálata pajzsmirigy papillaris carcinomákban, follicularis adencarcinomákban és adenomákban. 1.2. A pajzsmirigy fent nevezett tumoraiban a P53 expressió vizsgálata. 1.3. A Bcl2 expressiója fenti tumorokban. 1.4. A Bax expressió vizsgálata a fenti tumorokban. 2. A mellékpajzsmirigy tumorokban észlelheto apoptotikus és proliferativ aktivitás vizsgálata. 2.1. Apoptotikus és proliferativ aktivitás vizsgálata, mint primaer, mint sekundaer hyperparatireozisban, hyperplaziában, adenomákban és carcinomákban, szövettani módszerekkel. 2.2. A metszetek TUNEL reakció elvégzése után (Apop Detec) történo vizsgálata az apoptotikus index megállapítása céljából. 2.3. Az apoptotikus és mitotikus index megállapítása során 3 különbözo sejttípust, azaz a fosejteket, oxiphil sejteket és a világos sejteket külön-külön vettük figyelembe. 2.4. P53 expresszió vizsgálata a mellékpajzsmirigy fent nevezett elváltozásaiban. 2.5. Bcl2 expresszió vizsgálata. 2.6. Bax expresszió vizsgálata. 2.7. A hisztológiai leletek és a hyperparathyreozisban szenvedo betegek klinikai adatainak összehasonlítása és egymáshoz viszonyítása. 3. Apoptotikus és proliferatív aktivitás vizsgálata neuroblastomában és PNET-ben, a retinolsav receptor kifejezodésével összevetve. Bizonyos, különbözo hatásmechanizmusú gyógyszerek apoptozist tudnak indukálni neuroblastoma sejtekben. Ezen gyógyszercsoporton belül az egyik igen érdekes tag a retinolsav. Az al-tran retinolsav (ATRA) a neuroblastoma sejtek differenciálódását és apoptosisát is elosegíti. Az apoptotikus indexet vizsgáltuk neuroblastomában és PNET-ben, párhuzamosan a RAR béta meghatározásával, mivel a retinolsav receptor jelenléte a fenti tumorok kezelésében irányadó lehet. 3.1. Apoptotikus index vizsgálata neuroblastomákban és primaer neuroektodermalis tumorokban, hematoxilin eosin festéssel és TUNEL reakcióval fénymikroszkóposan. 3.2. A retinol sav receptor? kifejezodésének vizsgálata és az eredmény összevetése az apoptotikus indexel. 3.3. A betegek klinikai adatainak és a tumorok stádium beosztásának összevetése a fenti morphologiai vizsgálatok eredményeivel.
ANYAG ÉS MÓDSZER A pajzsmirigy és mellékpajzsmirigy tumorainak valamint a neuroblastomák és PNET-ek apoptotikus és proliferativ aktivitásának tanulmányozásához felhasznált módszerek: Szövettani vizsgálatok A szövettani metszeteket 4%-os neutralis formalin fixálás és paraffin beágyazás után készítettük. A metszetek vastagsága 8? m volt. Eloször valamennyi metszetet Haematoxin Eosinnal festettük meg és fénymikroszkóposan tanulmányoztuk az apoptotikus és mitotikus indexet határoztuk meg. A TUNEL enzimatikus jelölo módszer: Vizsgálataink során az úgynevezett TUNEL enzimatikus jelölo rendszert használtuk az apoptotikus sejtek kimutatására. Az apoptozis jellemzoje az extensiv DNS degradáció, mely már az apoptozis kezdeti szakában is megjelenik. A DNS törése mono- és oligo nucleozomák határai mentén következik be és ilyen módon ugynevezett single strand törések (NICKS) jönnek létre. Az Apop Detect azaz simple sensitive in situ detection kit, (DAKO Denmark) került felhasználásra. Az apop detect egy kit, amely a TUNEL módszert alkalmazza, amely a nucleozomák menti töréseket mutatja ki és általános felfogás szerint specifikusan jelöli az apoptoticus sejtek magvait. A metszeteket proteinase-k-val elokezeltük, hogy a szövetet permiabilissá tegyük a reagensek számára. Az apoptotikus indexet a daganatszöveten belül 2000 tumor sejt figyelembe vételével határoztuk meg és %-ban fejeztük ki. P53, Bcl 2, Bax immunhisztokémiai vizsgálata A szöveteket sebészi excisio során nyertük a primaer tumorokból és 4%-os neutralis formalin fixálás és paraffin beágyazás után 8? m vékony metszeteket készítettünk. Eloször valamennyi blokkból hematoxilin eosin festett metszeteket készítettünk. A metszeteket mutáns P53, Bax és Bcl 2 immunperoxidase reakció után vizsgáltuk. A P53, Bax ill. Bcl 2 ellenes antitesteket DAKO-tól (Dánia) szereztük be és az antitesteket 1:100 hígításban alkalmaztuk egy éjszakán át 37 o C homérsékleten. A metszeteket proteinase-k-ban elokezeltük, majd, hogy az endogen peroxidasét gátoljuk, metanolban és hidrogén peroxidban inkubáltuk. A sekundaer anti egér IGG (DAKO) 1:100 hígításban került alkalmazásra, a következo napon. Diaminobenzidin (DAB) szolgált chromogénként és metil-zöld háttér festésként. A P53, Bcl 2 és Bax pozitivitást 2000 sejt vizsgálata alapján állapítottuk meg, a pozitív sejtek arányát %-ban fejeztük ki. RAR-? vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel A retinol sav receptor jelenlétét immunperoxidase módszerrel vizsgáltuk, RAR-? Ab (BIOMOL, Németország, Co: SA-17) alkalmazásával. Errol az antitestrol azt közölték, hogy a RAR western blott módszerrel történo kimutatására alkalmas. Vizsgálataink során 4% -os neutralis formalinban fixált és paraffinba ágyazott 8? m vékony metszeteken használtunk. A metszeteket proteinase-k-val kezeltük elo és az endogen peroxidase gátlása érdekében metanolban és hidrogén-peroxidban inkubáltuk. Az antiretinol sav receptor? -ellenes antitestet hígítatlanul alkalmaztuk, mint primaer antitestet. És ezzel a metszeteket egy éjszakán át -4 o C- on inkubáltuk. A secundaer anti egér immunglobulin 1:100 hígításban került alkalmazásra a következo nap. Chromogenként
diaminobenzidint használtunk, a conrtast festést metil-zölddel végeztük. Hasonló módszert alkalmaztunk 1:5 és 1:10 hígítású RAR-? felhasználásával, hogy a reakció sensitivitását tanulmányozzuk, mivel legjobb tudomásunk szerint ez volt az elso kísérlet arra vonatkozólag, hogy a retinolsav receptort immunhisztokémiailag kimutassák. A RAR indexet a tumorszövetben 2000 sejt leszámolása alapján határoztuk meg és %-ban fejeztük ki. EREDMÉNYEK Apoptoticus és proliferatív aktivitás vizsgálata neuroblastomában és PNET-ben: Az apoptoticus index neuroblastomában és PNET-ben parallel változott a RAR indexel, azaz amikor az apoptosis gyakori volt, a RAR index szintén emelkedettnek bizonyult. Az apoptosis és RAR index közötti korrelációs koefficiens a következo képen alakult: R = 0,47 pearson bravis módszere szerint. Amennyiben az antitestet hígítatlanul alkalmaztuk a RAR pozitivitás a sejtek magvaiban jelentkezett, de 1:5 vagy 1:10 hígítás esetén a reakció a sejtfelszínen és gyengébb mértékben a cytoplasmában is megjelent, ugyanazon sejtekben a nuclearis pozitivitás mellett, valószínuleg a sejt organellumok jobb láthatóvá tétele miatt. Az apoptotikus index 0-1 % között váltakozott 8 beteg gyermek esetében és a többi esetben is relatíve alacsony (2-4 %) volt, míg PNET eseteinkben magasabbnak bizonyult (4,1-10,5 %). A RAR index a PNET esetekben 16-68 % között változott. A neuroblastomákat tekintve, nem minden tumor volt RAR pozitív anyagunkban. Az apoptoticus index általában alacsonyabb volt neuroblastomában mint más malignus tumorokban, de megemelkedett azokban az esetekben, melyekben a RAR jelentos pozitivitást adott. Valamennyi PNET esetben azonban relatíve magas apoptoticus index és jelentos RAR pozitivitás volt megfigyelheto. Legjobb tudomásunk szerint, a retinol sav receptor immunhisztokémiai megjelenítését még nem közölték. Eredményeink azt mutatják, hogy a RAR? antitestet eredményesen felhasználhatjuk immunhisztokémiai célokra is. Eredményeink arra is utalnak, hogy a neuroblastomákban a spontán apoptotikus aktivitás esetleg az endogen retinolsav hatására alakul ki és azt a retinol sav receptor mediálja. Gyakorlati szempontból jelentosnek tartjuk, hogy beteganyagunkban a RAR pozitív eseteket a gyermek klinikán retinol sav kezelésben részesítették. Az apoptoticus és proliferatív aktivitás vizsgálata a pajzsmirigy tumoraiban A pajzsmirigy különbözo daganatos elváltozásaiban vizsgáltuk a P53, Bcl 2 és Bax expressiót és a vizsgálatok eredményeként a következoket állapíthatjuk meg. A mutáns P53 expressiója igen alacsony adenomákban, összehasonlítva a papillaris és follikularis pajzsmirigy carcinomákban észleltekhez. A Bcl 2 kifejezodés magas volt adenomákban és alacsony carcinomákban, vizsgálataink szerint. Ezzel szemben a Bax expressió relatíve magas adenomákban, bár még mindig alacsonyabb, mint a Bcl 2 expressió, és carcinomákban igen alacsony Bax expresszió volt megfigyelheto.
A magas fokú Bcl2 expresszió magyarázhatja az apoptotikus sejtek igen alacsony arányát az általunk vizsgált pajzsmirigy tumorokban, legyenek azok jóindulatúak vagy rosszindulatúak. Az adenomákban észlelt magas szintu Bcl2 kifejezodés a malignus transzformáció irányába történo elmozdulásra utalhat. A daganatokban észlelt alacsony apoptoticus tumorsejt arány összefügghet a különbözo szinteken expresszált Bcl2 jelenlétével, mely gén közismerten anti-apoptoticus és a sejtek túlélését biztosítja. Gyakorlati szempontból a P53, Bax és Bcl2 index meghatározása a pajzsmirigy daganataiban hozzájárulhat az adenomák és foként a follicularis carcinomák differenciál diagnósisához. Apoptoticus és proliferatív aktivitás vizsgálata mellékpajzsmirigy tumorokban. Primaer mellékpajzsmirigy laesiók esetében a betegek túlnyomó többsége no volt. A secundaer hyperparathyreozis nokben és férfiakban közel azonos arányban fordult elo. Primaer hyperparathyreozisban szenvedo betegeink életkora átlagban magasabb volt, mint a secundaer hyperparathyreozisban szenvedo betegek életkora. A primaer laesiok túlnyomó többsége adenoma volt és csak 3 carcinomát észleltünk. Sekundaer hyperparathyreozis esetén hyperplasia volt a leggyakoribb szövettani lelet. Az apoptotikus indexet egyaránt alacsonynak találtuk adenomákban és hyperplasiákban, és ugyanezt állapíthattuk meg a mitoticus indexel kapcsolatban. A carcinomákban enyhén emelkedett mitotikus és apoptotikus aktivitást figyeltünk meg. Jelentos számú mellékpajzsmirigy és adenoma vizsgálata után megállapítható volt, hogy a mitoticus és apoptoticus activitás meghatározása nem alkalmas az adenomák és hyperplaziák közötti differenciál diagnózis kiegészítésére sem. Mind hyperplaziákban, mind adenomákban megfigyelhettünk Bcl2 és Bax activitást és néhány esetben a P53 expresszió is megjelent. A P53, Bcl2 pozitív sejtek aránya enyhén magasabb volt adenomákban, mint hyperplasiákban, de erre a leletre sem lehet differenciál diagnosztikát alapozni. Ugyanezt állapíthattuk meg a Bax expressióra vonatkozóan. Legjobb tudásunk szerint Bax expressiót eddig nem vizsgáltak a fent jelzett mellékpajzsmirigy elváltozása esetében. Vizsgálatain legérdekesebb eredménye volt annak megállapítása, hogy legtöbb hyperplasiában és adenomában a Bcl2 és Bax co-expressiója volt található. Az oxiphil sejteket és fosejteket külön tanulmányoztuk a Bcl2 és a Bax expressiójára, valamint a P53 megjelenésére való tekintettel. Az oxiphil sejtek magasabb arányban voltak pozitívak valamennyi gépprodukt vonatkozásában, mint a fo sejtek ill. a módosult (világos). Ez a tény valószínuleg azzal magyarázható, hogy az oxiphil sejtekben sok a mitochondrium. A P53 cytoplasmaticus pozitivitásának megjelenése néhány hyperplasiában és adenomában a P53 aminosav terminalis, nuclearis signal inhibitor emelkedett aktivitására mutathat, ami a mutáns P53 protein magba történo transzportja elleni fokozott védekezésnek felelhet meg. Az általunk használt antitest elsosorban mutáns P53-at mutat ki immunhisztokémiai módszerrel. Néhány adenoma és hyperplazia nuklearis P53 pozitivitása a malignus transzformáció felé történo tendencia megjelenésére utalhat.
Az igen kevés számú carcinoma nem teszi lehetové, hogy definitív konkluziókat vonjunk le a carcinomák és adenomák összehasonlítása alapján. A carcinomákban, mind a mitoticus, mind az apoptotikus aktivitás enyhén emelkedett volt. A klinikai észlelések a hyperplazia és adenoma elkülöníto diagnózisában segítségünkre lehet. Ha csak egy laesiót észlelünk, ez többnyire adenoma. Az adenomák dönto többsége nokben alakult ki. Beteganyagunkban a sekundaer hyperparathyreozis esetekben kronikus veseelégtelenség, dializis vagy veseátültetés szerepelt az anamnesisiben és a kórszövettani lelet legtöbb esetben hyperplasia volt. A primaer és secundaer hyperparathyreosis esetekben nagy számban figyelheto meg csont és izületi elváltozás. A tünetek fellépte és a klinikai diagnózis felállítása között eltelt igen hosszú ido felhívja a figyelmet a mellékpajzsmirigy adenomák és hyperplasiák jelentoségére és különösen fontos annak felderítése, hogy osteoporosis esetében hyperparathyreosis áll-e fenn. AZ EREDMÉNYEK TÉZISSZERU ÖSSZEFOGLALÁSA. Apoptotikus proliferatív aktivitás neuroblastomában: 1. Neuroblastomákban és PNET-ekben az apoptotikus index egymással párhuzamosan alakul, azaz az apoptozis gyakori, a RAR index is emelkedett. 2. Vizsgálatainkban nem minden neuroblastoma volt RAR pozitív. Az apoptotikus index általában alacsony volt más rossz indulatú daganatokhoz viszonyítva, de megemelkedett azokban az esetekben, amikor eros RAR pozitivitást észleltünk. Ezzel szemben minden PNET esetünkben relatíve magas apoptotikus indexet és eros RAR pozitivitást észleltünk. 3. Legjobb tudomásunk szerint a RAR immunhisztokémiai demonstratióját még nem közölték. Eredményeink azt mutatják, hogy az általunk alkalmazott RAR-? Ab eredményesen alkalmazható immunhisztokémiai célokra is. Eredményeink felvetik annak lehetoségét, hogy a spontán apoptotikus aktivitást neuroblastomákban és PNET-ben az endogen retinol sav váltja ki és a retinol sav receptor medialja. Apoptoticus és proliferative aktivitás vizsgálata pajzsmirigy tumorokban: 1. A Bcl2 fokozott expressziója magyarázhatja az apoptotikus sejtek alacsony arányát a pajzsmirigy daganataiban, elso sorban az adenomákban. 2. Az adenomákban észlelt jelentos Bcl2 expressió feltételezi a malignus transzformáció irányában történo elmozdulást. 3. A mutáns P53 expresszió igen alacsony volt adenomákban, összehasonlítva a papilláris és follikularis carcinomákban észlelt expresszióval. 4. A Bcl2 expressió magas volt adenomákban és alacsony carcinomákban. Ezzel szemben a Bax expressió is relatíve magasnak bizonyult adenomákban, bár nem érte el a Bcl2 expressió mértékét. Bax kifejezodés carcinomákban alacsonynak bizonyult. 5. Gyakorlati szempontból alacsony P53 index adenomákban összehasonlítva papillaris és follikularis carcinomákkal, valamint magas Bcl2 expresszió adenomában és alacsony fokú Bcl2 expresszió carcinomákban hozzá járulhat
pajzsmirigy tumorok esetében az adenomák és foként a follikularis carcinomák közti elkülöníto diagnózishoz. Apoptotikus és proliferatív aktivitás mellékpajzsmirigy tumorokban: 1. Mind az apoptotikus, mind a mitoticus index alacsony hyperplasiákban és adenomákban. 2. Mind Bcl2, mind Bax aktivitást figyeltünk meg hyperplaziákban és adenomákban, néhány esetben a mutáns P53 expresszió is megjelent. A P53 és Bcl2 pozitív sejtek aránya enyhén, nem signifikánsan magasabb volt adenomákban mint hyperplasiákban, de erre differenciál diagnosztikát alkalmazni nem lehet. Hasonlóan nem alkalmazhatunk differenciál diagnosztikát a Bax expresszióra sem. Tudomásunk szerint Bax expressziót eddig még nem vizsgáltak mellékpajzsmirigy hyperplaziák és daganatok esetében. Az oxiphil sejtek valamennyi génprodukt esetében szignifikánsan magasabb arányban voltak pozitívak, mint a fosejtek, vagy a módosult (világos) fosejtek. 3. A fentiekhez hasonló következtetés vonható le a Bax expresszió vonatkozásában is. 4. A mellékpajzsmirigy proliferatív elváltozásaira vonatkozóan legérdekesebb leletünk a Bcl2 és Bax co-expressziója mely egyben magyarázatot adhat az ezekben a laesiókban észlelt alacsony apoptotikus és mitotikus aktivitásra is. Abstracts 1. Szende B., Lovasz S., Farid P., Romics I. Follow-up of the effect of decapeptyl on prostate carcinoma by assessing apoptosis and cell proloferation. Apoptosis 2003. Luxemburg, 29.01-01.02.2003 2. Hauser P., Farid P., Schuler D., Szende B. The examination of Retinoic acid receptor and spontaneous apoptosis in neuroblastoma and peripheral neuroectodermal tumors. Padiatriche forschung mitteleuropaischer Lander. In der Universitatsklinik fur kinder-und jugendheilkunde im AKH,Wien die neunte Tagung.16.06,2000. 3. Szende B., Farid P., Kopper L., Vegso Gy., Perner F. Morphology, P53, Bcl-2 and Bax spectrum of 125, surgically removed parathyroid lesions. 19 ESP Congress Ljubljana, 06.09-11.09,2003.
1. Bevezetés Az elmúlt két évtizedben az apoptozisra vonatkozó ismereteink bovültek. Több mint 30 új molekulát fedeztek fel, melyekrol tudott, hogy az apoptosis keltésében és szabályozásában fontos szerepet játszanak. További mint egy 20 olyan molekuláról, melyek köztudottan a jelátvitelben, a DNS replikációjában, transkripcióban vagy riperben fejtik ki hatásukat, az is kiderült, hogy az apoptozis szabályozásában is jelentos szerepük van. Neuroblastomában, PNET-ben, a pajzsmirigy tumoraiban és a mellékpajzsmirigy tumoraiban vizsgálataink egyik célja az volt, hogy tanulmányozzuk retinoblastomákban és néhány PNET esetben a retinolsav receptor megjelenését, továbbá az apoptozist és felderítsük a két jelenség közötti kapcsolatokat. A pajzsmirigy daganatokban is tanulmányoztuk az apoptotikus aktivitást, a P53, Bcl2 és Bax kifejezodési arányt. A mellékpajzsmirigy daganatok tanulmányozása során az apoptotikus és a proliferatív aktivitás mellett a P53, Bcl2 és Bax expressziót is vizsgáltuk. Neuroblastomákban és PNET-ben az apoptotikus index és a RAR (retinolsav receptor) index párhuzamosan változott egymással azaz, hogy ha az apoptozis gyakori volt a RAR index is megemelkedett. A neuroblastomák közül nem mindegyik volt RAR pozitív. Az apoptotikus index általában alacsony volt, összehasonlítva más rosszindulatú daganatokkal, de megemelkedett azokban az esetekben, melyekben a RAR erosen pozitívnak bizonyult. Azonban a PNET valamennyi esetében relatíve magas apoptotikus és eros RAR pozitivitást találtunk. Legjobb tudomásunk szerint a RAR immunhisztokémiai kimutatását még eddig nem kezelték. Eredményeink azt mutatják, hogy a RAR? -Ab eredményesen használható immunhisztokémiai célokra is. Eredményeink arra utalhatnak, hogy az esetenként magasabb apoptotikus aktivitást neuroblastomákban endogen retinolsav válthatja ki, a retinolsav receptorok által medialtan. Eredményeink gyakorlati alkalmazást is nyertek, mivel retinolsav receptor pozitivitás esetén, a klinikán retinolsav kezelésben részesítették a betegeket. A P53, Bcl2 és Bax expresszió vizsgálata során különbözo pajzsmirigy daganatokban új dimenziók nyíltak meg. A mutáns P53 igen alacsony szinten fejezodik ki adenomákban összehasonlítva a papillaris és follikularis carcinomákkal. A mutáns P53 köztudottan a programozott sejthalál gátlója. A Bcl2 kifejezodése emelkedett volt adenomákban és alacsony carcinomákban. Ismeretes, hogy a Bcl2 a sejt túlélést segíti elo. Vizsgálatinkban kimutattuk, hogy a Bax expresszió relatíve magas adenomákban (de alacsonyabb, mint a Bcl2 expresszió) éa alacsony a carcinomákban. Ismeretes, hogy a Bax a programozott sejthalált elosegíto gén. A Bcl2 magas expressziója megmagyarázza az apoptotikus sejtek arányának alacsony volták, akár benignus, akár malignus tumorokban. Az adenomákban észlelheto emelkedett Bcl2 expresszió a malignus transformatio irányában történo átalakulás lehetoségét rejti magában. Bár vizsgálataink során kevés apoptotikus tumorsejtet észleltünk, mind a benignus mind a malignus pajzsmirigy daganatokban ez az észlelés összefüggésbe hozható a Bcl2 ill. a Bax megjelenésével a daganatsejtekben. Gyakorlati szempontból a P53, Bax és Bcl2 arány meghatározása pajzsmirigy daganatokban hozzájárulhat az adenomák, és különösképpen a follikularis carcinomák differencial diagnosztikájához. A mellékpajzsmirigy elváltozásokat tekintve a primaer laesiók esetében a betegek dönto többsége no volt. A sekundaer hyperparathyreoidizmus nokben és férfiakban gyakorlatilag azonos számban fordult elo. A primaer hyperparathyreozisban szenvedo betegek életkora magasabb volt, mint a sekundaer
hyperparathyreozisban szenvedo betegeké. A primaer laesiók többsége adenoma volt és csak három carcinomát észleltünk beteganyagunkban. A sekundaer hyperparathyreozis esetében a leggyakoribb pathologiai lelet a hyperplazia volt. Az apoptotikus indexet, mind adenomákban, mind hyperplaziákban alacsonynak találtuk és ugyanígy alacsony volt az osztódási arány is. A carcinomákban enyhe emelkedést mutatott az apoptotikus ill. az osztódási aktivitás. A relatíve nagy számú mellékpajzsmirigy hyperplazia és adenoma esetek tanulmányozása során arra a következtetésekre jutottunk, hogy az apoptotikus vagy osztódási aktivitás ezen két pathologiai entitiás között nem tud különbséget tenni. Bcl2 és Bax valamint néhány esetben a P53 expresszió egyaránt fellelheto volt hyperplaziákban és adenomákban. Bár adenomában a Bcl2 és P53 expresszió enyhén meghaladta a hyperplaziában észlelt mértéket, differenciál diagnózist nem alapozhatunk P53 vagy Bcl2 immunfestésre. A fentieket a Bax expresszióra is vonatkoztathatjuk. Legjobb tudásunk szerint mellékpajzsmirigy hyperplaziákban ill. adenomákban a Bax expressziót még nem vizsgálták. Eredményeink közül a legfigyelemreméltóbbnak tartjuk a Bcl2 és Bax coexpresszióját a mellékpajzsmirigy hyperplaziájában és adenomájában. Az endokrin szervek daganataiban a spontán apoptozis általában alacsony. Ugyanekkor több az endokrin szervek által termelt hormon, mint a parathormon és a luteinizáló hormon apoptozist indukál. Ez a körülmény nagy valószínuség szerint az endokrin sejtek részérol egy protektiv mechanizmus kialakulásához vezet, mely ezeket a sejteket az apoptotikus hatások ellen védi. Vizsgálataim eredményei ehhez a feltevéshez szolgáltattak adatokat, elsosorban a Bcl2 és Bax co-expresszióját figyelembe véve, mely jelenség az apoptozis kialakulását nagy valószínuséggel gátolja.