POSEIDON DNS PRÓBÁK Felhasználói Kézikönyv Használati útmutató Használati útmutató A Poseidon fluoreszcensen jelölt próbáinak használata A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) genomi célszekvenciákat azonosít, vagy jelöl meg úgy, hogy azok elhelyezkedése is tanulmányozható. A megfelelő kromoszóma-specifikus DNS szekvenciát először jelzőmolekulákkal dekoráljuk. A jelölt DNS próbát metafázisos kromoszómához vagy interfázisos sejtmaghoz hibridizáltatjuk tárgylemezen. Mosás után a mintában a jelölõ molekulák fluoreszcens jeleit keressük fluoreszcens mikroszkópiával. Lemez előkezelés: Perifériás vér kultúrából vagy közvetlen preparátumokból származó metafázison vagy interfázisos sejteken való használathoz lásd az: ACT cytogenetics laboratory manual. 2nd ed. New York: Raven Press; 1991 (kézikönyv). Végezzünk előkezelést száraz minta lemezen 2 x SSC-vel, ph 7,0-en, 37 C-on 2 percig. Dehidráljuk a mintát 70%-os, 85%-os és 100%-os etanol sorban, mindegyikben 1 percig tartva. Szobahőmérsékleten, levegőn szárítsuk meg a mintát. Paraffinba ágyazott szöveti metszetek esetén alkalmazzuk az I. sz. Mellékletet. Az erős citoplazmás háttérfestést mutató és nehéz minták esetén használjuk a II. sz. Mellékletet. Próba előkészítés: Minden egyes POSEIDON próbát (kivéve a teljes kromoszóma festő próbákat, Whole Chromosome Paint, WC, lásd lejjebb) higítani kell. 2 μl próbát 8 μl Cell Hybridization Buffer-rel (CHB, sejthibridizáló puffer) higítsunk. Paraffinba ágyazott szövetekhez a higításhoz használjunk 7 μl Tissue Hybridization Buffer-t (THB, szöveti hibridizáló puffer) + 1 μl KREAboostot. Teljes kromoszóma festésekor 2 μl próbát higítsunk 8 μl Whole Chromosome Hybridization Buffer-rel (WHB, teljes kromoszóma hibridizáló puffer). Minden próbából 2 μl-t használjunk, ennek megfelelően csökkentsük a higítópuffer mennyiségét is 2 μl-rel. 2
Együttes vagy kodenaturáció: Használjunk 10 μl próbát, vagy próba mixet minden egyes 22 x 22 mm-es mezőre. Fedjük le a mintát üveg fedőlemezzel és zárjuk le Fixogum-mal vagy gumi cementtel. Denaturáljuk a mintát és a próbát 75 C-os forró lapon 5 percig (vagy 10 percig előkezelt szöveti metszeteknél, lásd II. sz. Melléklet. Következik a hibridizációs lépés. Figyelem: A próbák félutomata hibridizációs készülékeken (pl. Hybrite, Thermobrite ) is validáltak. Alternatíva: Denaturáció külön-külön, opcionális: Denaturáljuk a lemezt 70%-os Formamid/2 x SSC-vel, ph 7,0 72 Con (±1 C) 2 percig. Dehidráljuk a lemezeket jéghideg (-20 C) 70%- os, 80%-os és 95%-os etanol sorban, 2 percig minden állomáson. Levegőn szárítsuk ki a lemezt. Denaturáljuk a próba keveréket 75 C-on 10 percig. Pipettázzuk a próbát a denaturált lemezre, fedjük le üveg fedőlemezzel, zárjuk le gumi cementtel, majd menjünk tovább a hibridizálási lépésre. Hibridizáció: Inkubáljuk a mintát (próbával) 37 C-on éjszakán át, nedves kamrában. Hibridizálás utáni mosás: Távolítsuk el a gumi cementet majd csúsztassuk le a fedőlemezt. Ha a fedőlemez nem jönne le, akkor inkubáljuk a lemezeket 1 x Wash Buffer II-ben (Mosó puffer II) szobahőmérsékleten. Mossuk a lemezeket 1 x Post Wash Buffer I-ben (Utómosó puffer I) 2 percig 72 C-on (±1 C) mozgatás nélkül. Ezután mossuk a lemezeket 1 x Wash Buffer II-ben (Mosópuffer II) 1 percig szobahőmérsékleten, mozgatás nélkül. Lépjünk tovább a háttérfestésre. Háttérfestés: Alkalmazzunk 15 μl DAPI/Antifade-et (végkoncentráció 0,02 μg/ml) vagy szövet festésekor higítatlan DAPI/Antifade-et 0,1 μg/ml) majd fedjük le a lemezt. Préseljük ki a maradék puffert a fedőlemez alól úgy, hogy papírvattán keresztül enyhén nyomjuk a fedőlemezt. Lépjünk tovább a mikroszkópiához. Ajánlások az eljárás során: A hibridizációs és mosópuffer koncentrációja és hőmérséklete (stringency, szigorúság) fontos tényező. Enyhébb stringency/szigorúság nem specifikus próba kötést eredményezhet, míg szigorúbb körülmények esetén elvész a szignál. A cél DNS inkomplett denaturációja is szignál vesztést eredményezhet. A próbával adott anyagok: 10 tesztes formátum: 20 μl próba és 100 μl Cell Hybridization Buffer (Sejt Hibridizációs Puffer). Opcionális: 100 μl Tissue Hybridization Buffer (Szöveti Hibridizáló Puffer) + 10 μl KREAboost. 5 tesztes formátum: 10 μl próba és 50 μl CHB vagy WHB. Megjegyzés: Néhány próba szöveti hibridizációra optimalizált, ebben az esetben Szöveti Hibridizációs Puffer (Tissue Hybridization Buffer) van a próba mellett, más próbák esetén a THB-t csak kérésre szállítják. A próbák zöld (PlatinumBright 495), vörös (PlatinumBright 550) vagy kék fluorofórral (PlatinumBright 415) jelöltek. Ajánlások a fluoreszcens mikroszkópiához Az optimális vizualizációhoz jól karbantartott és rendszeresen kalibrált mikroszkóp használata javasolt, 100W-os higany lámpával. Ajánlott a 63 x- os és 100 x-os fluoreszcens objektív használata. 3-szoros áteresztő szűrőt (DAPI/FITC/Texas Red or DAPI/FITC/Rhodamine) használhatunk több szín egyidejű vizsgálatához illetve 1x-es áteresztő szűrőt az egyedi színek vizualizálásához. Fluorofór Gerjesztés Kibocsátás PlatinumBright 415 415 ±20 nm 475 ±30 nm PlatinumBright 495 495 ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright 550 546 ±12 nm 580 ±30 nm A Poseidon próbák gerjesztési, kibocsátási maximumai a 8. oldalon található ábrán láthatók. 3 4
I. sz. Melléklet Paraffinba ágyazott szöveti metszetek FISH-hez való használatához A KB-60001 POSEIDON Tissue Pretreatment Kit-tel 1. Süssünk a lemezekre 4-5 μm-es formalin fixált paraffinos metszeteket 2-16 órán keresztül 56 C-on 2. Deparaffináljuk a lemezeket xilolos (rendszeresen cserélt) mosással kétszer 10 percig. Rehidráljuk a mintát 100%-os, 85%-os, 70%-os etanol sorban (3 perces mosás minden állomáson). A végén 3 percig mossuk a lemezt desztillált vízben. 3. Előkezelésként mossuk a lemezeket 0,2 M HCl-lel 20 percig, majd mossuk 3 percig dh 2 O-ban. 4. Helyezzük a lemezeket 8%-os nátrium tiocianát vizes oldatába 30 percre 80 C-on, majd öblítsük a lemezeket 2xSSC-ben 3 percig. 5. Emésszük a mintát 0,025%-os pepszin 0,2 M HCl-es oldatában 30 percig 37 C-on. (Az inkubációs idő függ a szövettől, fixálástól és pepszin aktivitásától.) Ezután mossuk a lemezt dh 2 O-val 1 percig, majd 2xSSC-vel 5 percig. 6. Dehidráljuk a lemezeket 70%-os, 85%-os és 100%-os etanol sorban (1 perc minden állomáson). Levegőn szárítsuk meg a lemezt. Figyelem: Ellenőrizzük a fehérje emésztést és előkezelést 15 μl DAPI festéssel, és értékeljük ki a lemezeket fluoreszcens mikroszkóppal DAPI szűrő alkalmazásával. Alapesetben 30 perces fehérje emésztés elegendő a mellrákok széles körében. Távolítsuk el a fedőlemezt, öblítsük a metszetet 2xSSC-ben 2 percig, majd növeljük az emésztést 2-20 perccel, ha a minta alulemésztett. Túlemésztettség esetén új mintával csökkentsük az emésztési időt 20 percre. 7. Juttassunk 10μl próbát, vagy próba mixet egy 22 x 22 mm-es mezőre. Forrasszuk le gumicementtel. Denaturáljuk a mintát forró lapon 75 Con 10 percig. 8. 37 C-on inkubáljuk a lemezeket egy éjszakán át nedvesített kamrában. 9. Távolítsuk el a gumicementet és csúsztassuk le a fedőlemezt. 10. Mossuk a lemezeket 1 x-es Post Wash Buffer I-ben (0,4 x SSC/0,3% NP-40) 2 percig 72 C-on (±1 C) mozgatás nélkül. 11. Mossuk a lemezeket 1x-es Wash Buffer II-ben (2xSSC/0,1% NP-40) 1 percig szobahőn rázatás nélkül. Folytassuk a háttérfestéssel. 12. Alkalmazzunk 15 μl háttérfestőt (0,15 μg/ml DAPI/Antifade) a metszetre, majd fedjük le a lemezeket 22 x 50 mm üveg fedőlemezzel. II. sz. Melléklet Előkezelés nehéz mintákhoz vagy ahol erős a citoplazmás háttérfestődés A KB-60003 POSEIDON FISH & Digestion Kit-tel való használatra javasolt 1. Előkezeljük a száraz mintalemezt 2xSSC vel (ph 7,0) 37 C-on 2 percig. 2. Inkubáljuk a lemezeket 3-10 percig 0,005%-os pepszin oldatban (0,01 M HCl-ban oldott) 37 C-on. 3. Mossuk a lemezeket 3 percig 1xPBS-ben szobahőmérsékleten. 4. Utófixáljuk a lemezeket 1%-os pufferolt formaldehidben (1xPBS/20 mm MgCl 2 -ban oldva) 10 percig szobahőmérsékleten. 5. Mossuk a lemezeket 3 percig 1xPBS-ben szobahőmérsékleten. 6. Dehidráljuk a mintát 70%-os, 85%-os és 100%-os etanol sorban történő mosással (1 perc minden állomáson). Levegőn szárítsuk meg a lemezeket Folytassuk a kodenaturációval a 3. oldalon leírtak szerint. A FISH-hez szükséges, de a kitben nem szállított anyagok: - 1% pufferolt formaldehid/1 x PBS/20mM MgCl 2 - PBS - Xilol - Formamid - Etanol 100%, 85% és 70% - Fixogum (LK-071A) vagy gumi cement - Forró lap (pontos hőmérsékletszabályozással egészen 80 C-ig) - Inkubátor 37 C-tól 60 C-ig - Vízfürdő pontos hőmérsékletszabályozással 72 C és/vagy 37 C-on 5 6
- Műanyag vagy üveg lemeztartó edény - Állítható mikropipetták (1 μl - 200 μl) - Fluoreszcens mikroszkóp a megfelelő szűrőkkel felszerelve (lásd a fluoreszcens mikroszkópia ajánlásait). Szükséges, nem szállított, de a POSEIDON Tissue Pretreatment kit-ben (KB-60001) elérhető anyagok: - Nátrium tiocianát - Pepszin - 0.2 M HCL Szükséges, nem szállított, de a POSEIDON FISH kit-ben (KB- 60002) elérhető anyagok: vagy POSEIDON FISH & Digestion kit (KB-60003): - Pepszin - 0.01 M HCL Minden oldat a KB-60001, KB-60002 és KB-60003 kitekben 10x-es töménységben található, kivéve a háttérfestőt, amely felhasználásra kész oldat. 7 8
9