IPARI ENZIMEK 1. Enzimek mérföldkövei - Évezredek borjú gyomor tejalvasztó enzim - 1836 SCHWANN: gyomorból izolálta a pepszint, fehérjebontó enzim, triviális név - 1876 KÜHNE enzim elnevezés - 1890 TAKAMINE takadiasztase enzimpreparátum (Aspergillus oyzae) proteáz, amiláz - 1894 E. FISCHER: α - ésβ glikozidos kötéssel foglalkozott α -metil-dglükózt bont a maltóz (élesztő) β -metil-d-glükózt bont emulzim(mandula) - 1913 MICHAELIS -MENTEN: enzimkinetikai leírás - 1926 SUMMER tisztított enzim kristályos formában, ureáz babból - 1966 Lizozim térszerkezete - 1969 Enzimek és sejtek immobilizálása (de 1823 Franciao. ecetsav generátor) o 1969 TANABE D,L-Met reszolválása (enzim) japán o 1973 6-amino-penicillánsav enzimes előállítása(enzim) o 1974 NOVO HFCS enzimes előállítása Clinton Corn Proc. Co.USA o 1977 Laktáz (enzim) Snam-Progetti(Olaszország) - 1975 KLIBANOV enzimes reakció szerves fázisban, átészterezési reakció - 1999 ENZYME DATA BANK 3705 db enzimet tartalmaz 2. Enzim források 2.1. Állati szövetek: tripszin rennin emésztőcsatorna emésztőenzimei májból glutamát dehidrogenáz 2.2. Növényi eredetű: papain bromelin α -,β -amiláz- csírázó magvakból 2.3. Mikroorganizmusok: Egyenértékű vagy jobb enzimet termelnek. A géneket egy kedvezőbb tulajdonságú mikroorganizmusba teszik át Pl: Str. pneumonieval senki nem fermentálna így a számunkra fontos gént belőle pl. B. subtilisbe teszik át 1
3. Enzimek piaci helyzete Enzyme Enzyme preparation (tons/year) Sales(percent of total) Bacillus protease 6200 45 Glucoamylases 4500 13 Bacillus amylases 4200 5 Glucose isomerases 1900 6 Rennin (microbial) 1500 10 Amylases (fungal) 800 4 Pectinases 100 3 Proteases (fungal) 100 2 Others - 12 Aunstrup et al.,1979-45% baktérium proteázok mosószerekben a szálló pora allergiát okoz - termelésben volt egy hanyatló szakasz, de a problémát megoldották a porzás mentes készítményekkel - 13% glükoamiláz keményítőipar - Bacillus amiláz - Glükóz izomeráz - Rennin Tejalvasztás Tejiparban használják Borjúgyomorból izolálták, ma fermentálják - gomba eredetű amiláz söripar a malátázást kiváltják, ill rásegítenek textilipar--->növényi poliszacharidok emésztése --->írtelenítés - pektinázok gyümölcsökben található poliszacharidok gélesítőanyag lé tisztább és kezelhetőbb lesz pektináz adagolás hatására galakturonsavak kötéseit bontja - gomba proteázok 4. Enzimek alkalmazása 4.1. Ipar élelmiszeripar detergens ipar textilipar bőripar papíripar 4.2. Analitika glükóz-oxidáz, 2
alkohol dehidrogenáz, koleszterin oxidáz 4.3. Orvosi alkalmazás aszparagináz proteáz lipáz sztreptokináz 4.4. Kutatás Restrikciós endonukleázok Reverz transzkiptáz DNS-ligáz DNS-polimeráz 5. Ipari enzimek termelése 1987-ben az enzimtermelés 450 M USD 1995 kb.800 M USD illetve 1998 1600 M USD ipari enzim előállítás, és 23000 M USD terápiás enzim előállítás. 5.1. Ipari enzimek piaca Világtermelési érték (1998) Terápiás enzimek(1996) Gastro-intestinális betegségeknél Reumás betegségeknél Anyagcsere betegségeknél Trombózisnál Ráknál 1600 M USD 2300 M USD a.) Alkalmazásuk Élelmiszeripar 45% ebből keményítőipar 11% Detergens ipar 34% Textilipar 11% Bőripar 9% Papír 1,2% 60%-a rekombináns E r Chymosin (1993) 140M USD RE (1996)100 M USD Taq polimeráz (1998) 80 M USD Detergens enzimek (1997) 200 M USD A detergens enzimeket site dirested mutagenezissel állították elő, mégpedig úgy, hogy az aktív centrumtól távol eső 8 AS-at módosítottak így megnövekedett a mosóerő valamint 100 C-on a hőstabilitás 34-szeres lett. 3
b.) Rekombinás E R AQUAZYM ULTRA R : Írtelenítésnél használják B. stearothermophilus B. licheniformis PENICILLIN ACILASE R : E. coli multikópiás plazmid 28X aktivitás MAXIREN R : Tejipar használja Chymosin borjú E. coli(pfizer USA) B. subtilis (Genencor USA) Kluyveromyces lactis (Gist Brocades) NATUPHOS R : Fitáz Asp. niger Asp. niger (genomba) 25-30%-kal jobb PURADAX R : mosó celluláz Bac. BCE(lúg, C) B. subtilis CD-GLIKOZIL-TRANSZFERÁZ R ciklodextrin Kl. Pneumoniae B. subtilis-ba A teljes piac 90%-át 9 cég uralja: NOVO, GIST BROCADES, IBIS, GENECOR INTERN, RHONE-POULENC, SOLVAY ENZYM INTERN., COLLECTIVE JAP.IND.PRODUC, MILES A termelés 40%-át USA adja, Európa 35%-át és Japán 24 %-át. 5.2. Tenyésztés: a) Felületi (mold bran): tálca, forgódob (takadiastase, pektináz) b) Szubmerz Specifikum: Olcsó termék: Nagy produktivitás kell. Nagy térfogatú fermentor Folytonos: glükóz.izomeráz (NOVO) Rátáplálásos:α-amiláz, proteáz, pen aciláz Törzsfejlesztés: egy enzim bevitel kell csak O 2 limitben jó termelés: glükóz izomeráz, aspargináz, pen.aciláz De: proteáznak jó OTR kell 8% CO 2 a levegőben jó az α-amiláz termelés ( B. subtilis) Alk.proteáz (és mások is) 3 típusú fermentáció. Lebontja az extracelluláris fehérjéker: izolálás egyszerű. Katabolit represszió Cél: ne nőjön hanem fehérjét építsen a sejt Glükóz, fruktóz, sőt Glu is (glüko-amiláznál), α amiláz, celluláz, proteáz, amilo-glükozidáz Kivédés: más, lassan bomló szénhidrát:laktóz, keményítő, mannóz, (cellulóznál) glicerin (α-amiláznál) 1200-szoros aktivitás növekedés Adagolás (glükóz) Mutáns (adenil-cikláz regulációs mutáns) Nézzük meg a lac operon esetében a katabolit repressziót. Ha glükóz és laktóz egyidejűleg van jelen a táptalajban, akkor nincs erõs lac expresszió. Ezt a jelenséget nevezik katabolit repressziónak. A glükóz ugyanis jobb szén- és energiaforrás, ezért elõbb ezt használja fel a baktérium. Ekkor nincs szüksége a laktóz hasznosítási enzimekre. Ha a sejt "éhezik" kevés ATP és sok ciklikus AMP (camp) keletkezik. A keletkezõ camp a katabolit aktivátor proteinnel (CAP ) egy camp-cap komplexet alkot. Ez a komplex pedig aktivátora más cukorhasznosítási 4
géneknek, így a lac operonnak is. Ha a glükóz elegendõ, akkor a camp:atp arány eltolódik az ATP javára és így nincs elég camp-cap komplex, az egyéb cukorhasznosítási operonok (pl. lac, ara ) működése nem aktivált, azaz látszólag represszált. A lac operont már annyiszort tanították, úgyhogy itt nem anyag. 1.ára Katabolit represszió Indukció Konstitutív enzimek: állandóan termelnek Induktív enzimek:csak akkor termelnek ha kell Mit mivel indukáljunk?leginkább a szubsztráttal Amilázokat keményítővel Invertáz szacharózzal β -galaktozidáz laktózzal Glükóz-izomeráz xilóz (xilán, korpa) 5.3. Feldolgozás: 2.ábra A lac operon szerkezete és expressziója Intracelluláris enzimek (sejtfeltárás) Extracelluláris enzimek Kicsapás: Na 2 SO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, izopropanol..izoelektromos ponton csapunk ki Kromatográfia: Gél-, ioncserés-, adszorpciós-, biospecifikus-kromatográfia: S-analóg, antitest Membrán elválasztás: ultraszűrés (koncentrálás) Szárítás: dob-,fluidágyas-,porlasztva szárító,liofilezés Folyadékban szárítás: drága pl: α -amiláz (2% E+20% NaCl) és Glükoamiláz (5% E) Por ill. granulálás: extrúderes granulálás (pormentes ) pl: proteázok, a detergensben az enzim koncentráció 0,015-0,025% 5
6. Ipari enzimek 6.1. Amilázok α-amiláz β -amiláz γ -amiláz (amiloglükozidáz, glükamiláz) (pullulanáz, izo-amiláz) 3.ábra Amilázok fajtái 6.1.1. α-amiláz Jellemzői extracelluláris enzim katabolit represszió: glükóz helyett később keményítő (induktor is egyben) 6
Thermomonospora:opt C enzim(53 C) amelyet magasabb hőfokon is lehet használni B. subtilis: 27-30 C az optimális hőmérséklete Az extracelluláris enzim egy szignálpeptid segítségével jut ki a sejtből. 4.ábra Szignálpeptidek működése Minden olyan mikroba termeli amelyik keményítőt emészt: Aspergillus oryzae Bacillus licheniformis Aspergillus niger Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis Mucor nemzetség Felhasználás keményítő lebontás söripar írtelenítés Az írtelenítő enzim először a maláta volt.1917 BOIDIN EFFRONT baktérium amiláz melyet 1945 után kereskedelmileg termeltek. Majd 1950-ben NOVO-NORDISK B. subtilis kereskedelmi enzimet termeltek írtelenítéshez. Ez egy olcsó, stabil, kemikáliákra nem érzékeny, nagy aktivitású enzim AQUAZYM. Ezt követően B. stearothermophilus: egy nagy hőstabilitású és széles ph optimummal rendelkező, de kis mennyiségű enzimet termel. Mivel kis mennyiségben termeli ezt az enzimet ezért B.licheniformisba klónozták(nem patogén, maga is amiláz és proteáz termelő, kicsi a kalcium igénye, nagy az aktivitása) AQUAZYM ULTRA R 7
6.1.2. β-amiláz: Termelő mikrobák Bacillus polymyxa Streptomyces Pseudomonas sp Jellemzője nagyobb hőtolerancia Felhasználás maltóz szirup előállítás söripar erjedési ipar 6.1.3. Pullulanáz Mikrobák Pullularia pullulans Aerobacter aerogenes Jellemzői α -1,6 kötést bont,határdextrint induktor: i-maltóz, pullulán <---ma konstitutív mutánssal termelik Felhasználás: keményítő hidrolízis Glükóz előállítás (α -amiláz, pullulanáz, glüko-amiláz) 5 min 105 C Corn starch(40%w/v) Deionized water Ca 2+ (20ppm) α -amiláz Pullulanáz 60 min 95 C ph 4,5 60 C, filtration Dilution (10-20% dry weight) Glucoamylase 48h 60 C 8
Glucose (98% yield) 5.ábra Keményítő bontás Novo Industries, 1977 1 strach 2 glükóz E 1 α amiláz (Bac. licheniformis, Asp. niger) E 2 glükoamiláz (Asp. niger) E 3 pullulanase (Pullularia pullulans, Aerobacter aerogenes, Ps.) 1) Áztatás:Kukorica+víz+SO 2 + tejsavas baktérium 2) Nedves őrlés, ívsziták olaj, rost, fehérje 3) Elfolyósítás: ph: 6-6,5 T=115 C-95 C Termostabil amiláz: Ca aktivál és stabilizál 4) Elcukrosítás: ph:4,2 T=60 C Konverzió:98% Enzim:oldható de van immobilizált is Reaktor:Folyamatos kevert reaktor 9
5) Hidrolízis:48h, glükózzá alakul át, fontos, hogy higítsuk a rendszert mert ha az enzim nem talál vizet akkor transzglikoziláló enzimként működhet, mely képes a cukrokat is hidrolizálni. 6.1.4. Glükoamiláz Termelő mikrobák Aspergillus niger Aspergillus awamori Rhisopus nigrigans Jellemzői nem redukáló végen bont maltózt nem hidrolizálja Katabolit represszor: glükóz. laktóz, Glu Induktor: keményítő, dextrin 6.2. Glükóz-izomeráz (xilóz-izomeráz) Induktora:xilán (xilóz ötszénatomos cukor polimerje, fában, fűrészporban található) Konstitutív mutánsokat alkalmaznak: Bacillus coagulans NOVO: Sweetzyme: glükóz katabolit represszió, kobalt és magnézium kell az enzimtermeléshez - mutáns: nem kell! Folytonos technológia: glükóz és oxigén limitben Felhasználás: Izoszörp előállítás Izoszörp előállítás (xilóz-izomeráz,glükóz izomeráz) Az izomerizálásra kerülő glükózszirupnak tisztának kell lennie: szűrés v. aktív szenes kezelés vagy ioncserés tisztítás, különben mérgezik az enzimet Mikroorganizmus: B. coagulans, katabolit represszió, induktív enzimet termel ( ma konstitutív mutáns). Fermentáció: Folytonos fermentáció, Co és Mg ot kell adagolni a fermentációhoz, mivel az intracelluláris enzimek drágák ezért immobilizált enzimet alkalmaznak. ph: 7,5-8 T= 50-60 C ez akadályozza a M. infekciót, de lassan inaktiválja az enzimet Fix ágyas párhuzamos reaktorokat alkalmaznak ( sejt rögzített) ld.ábra 1000 t HFCS/nap: 20 reaktor t 1/2 = 100 nap ( 12%-os aktivitás-csökkenésnél csere) Konverzió: glükóz (55%)- fruktóz(45%) (egyensúlyi) 50%-os fruktóz tartalmat a melléktermékek képződése és a hosszú kontaktidő miatt nem lehet elérni, de: ioncserével 55% is elérhető. Termelés kezdete: 1967 Clinton Corn Proc.Co. 1974 Immobilizálás Felhasználás: Élelmiszeripar 10
Édesítőipar Sütőipar Tejipar Magyarország 1982 Szabadegyháza 50 000 t/év Immobilizált enzim Nettó hozam: 12M USD/év 6.3. Pektinázok 6.ábra Izoszörp előállítás Pektin: Poli-galakturonsav részlegesen metilészterezve. A monomerek béta1,4-es kötéssel kapcsolódnak össze. Ezeket a kötéseket bontják a poligalakturonázok (= pektinázok), beszélhetünk exo- és endo poligalakturonázról. 11
13.ábra Pektin 14.ábra A pektin hidrolízise Felhasználás Gyümölcsléipar a gyümölcsök húsát ezzel az enzimmel kezelve a lé mennyiségét megnövelhetik és a feldolgozhatóságot javítják Olivaolaj gyártás olajos-vizes emulziók stabilitását javítja Borászat a préselhetőséget javítja Termelő mikroorganizmusok: Aspergillus niger Rhyzopus nemzetség Botrytis cinerea 6.4. Celluláz A gyapotszálak cellulózból állnak. A celluláz általános mosó additív: a cellulózszál pelyheket (bolyhokat) eltávolítja, de nem támadja meg a cellulóz rostokat, új bolyhok nem képződnek, színes, fényes marad a textil hosszú hordás és gyakori mosás után is. 12
A celluláz ph optimuma savas, míg a mosás ph-ja lúgos. Így az lett a cél, hogy alkalikus cellulázokat kell keresni. Kelet Afrikában alkalikus tavak és hőforrások vannak (50-110 C) (ph=8-12). Mégis sok mikroorganizmus él bennük extremofilek: alkáli toleránsok, obligát alkalofilek és hőtoleráns fajok. Prokarióták. A tavak körülményei azonosak a mosáséval. Ezek a baktériumok nehezen szaporíthatóak, így a celluláz enzimüket más mikroorganizmusba kell klónozni. A Bacillus BCE103 nehezen szaporítható és kevés celluláz enzimet termel, ezért ezt az endocelluláz gént klónozták B. subtilis-be. Ez jó gazdaszervezet mert: Nem patogén Sok más enzimet is kiválaszt A celluláz extracelluláris tehát izolálása egyszerű PURADAX R hő-; alkáli- és fehérítőtűrő enzim 6.5. β galaktozidáz (laktáz) Laktóz glükóz + galaktóz Termelő mikroorganizmusok: Baktériumok, élesztők, penészek Kluyveromyces lactis: ph = 6-7, tejben laktóz hidrolízis Asp. niger: ph opt =4-5, savó hidrolízis Alkalmazás Tej, tejpor: laktóz hidrolízis, növeli az édességet (laktóz 20% < galaktóz 58% < glükóz 70%), laktóz intoleráns betegeknek Fermentált termékeknél (joghurt, sajt stb.) a fermentáció sebességét növeli Takarmányba kerülő savó hidrolízise Élelmiszerekbe kerülő savó hidrolízise: könnyebb felvétel, emészthetőség, édesség növelése, valamint megakadályozza a kristályosodást (fagylaltok, sütemények esetében) Technológia 1) Szakaszos enzimes technológia Tej+ enzim T=35 C t=4 h 70-80%-os laktóz hidrolízis UHT sterilezés Aszeptikus csomagolás Laktóz intolerancia, laktóz érzékenység 2) Folytonos enzimes technológia Immobilizált enzim Tejnél nagy a fertőzési veszély, ezért ritkán Savónál jobb, mivel kisebb a ph SNAMPROGETTI ( Olaszország) cellulóz triacetát szálon immobilizálás (szál reaktorok:plug flow), konverzió: 75-80%, kapacitás 8000l tej /nap(1977) 13
A leggyakoribb enzim hiánybetegség Európa lakosságának: 5-15%-a, Afrika 80%-a, Kína 90%-a szenved ilyen betegségben Az anyatej 7,5%-a laktóz, a tehéntej 4,5%-a A bélfal 3 éves korig mindenkinél termeli az enzimet ez bontja a tejcukrot, a csecsemő képes asszimilálni. A hiánybetegségnél az enzimtermelés ebben a korban megszűnik, a tejcukor bontatlanul a vastagbélbe kerül és megakadályozza a széklet vízleadását hasmenés. A bélbaktériumok a laktózt erjesztik gázképződés, felfúvódás. 14
6.6. Proteázok 6200 t tiszta enzim/év Mosószeripar, tejipar, gyógyszeripar, bőripar, élelmiszeripar Fehérje hidrolizátum: tápoldat, infúzió. Élelmiszer Peptid kötéseket bont (létrehoz) (Hidrolízis-szintézis) Aktiválás proteolízissel: pepszinogén, tripszinogén, proinzulin, véralvadás Fehérje lebontás: élelmiszer, tejalvadás, mosóenzimek, infúzió, vérrögoldás Fehérje/peptid szintézis: aszpartám előállítás 6.6.1. Alkalikus proteázok Jellemzői Szerin proteáz Mosószer-proteáz o Jó detergens és o hőstabilitás o Jól bírja a lúgos közeget o Nagy a kelát és perborát stabilitása Termelő mikrobák: Streptomyces nemzetség Aspergillus nemzetség B. amyloliquefaciens: szubtilizint termel, ami egy szerin proteáz és amely reverzibilis acilezésre képes Screening ph = 10-es fehérje-agaron szélesztéssel Törzsjavítás Célja: az adott törzs több enzimet termeljen (Génsebészet és a protein engineering) 1.) erős promótert teszünk az adott gén elé 2.) multikópiás plazmid: az adott gén több példányban legyen jelen törzsjavítással foglalkozó cégek: NOVO, GIST-BROCADES, PROCTER- GAMBLE Fermentáció Fed batch fermentáció NH 4 és aminosav koncentrációra figyelni kell, alacsonyan kell tartani az egész fermentáció alatt Nagy oxigén bevitel kell: 1 VVM, 48-72 h 1971-ben allergia krízis: mivel ezek por állagúak voltak allergiát okoztak így gyöngyszemcsézték őket, ezzel elkerülve allergén hatásukat. Stabilitásuk érdekében kutatások folytak melyek bebizonyították, hogy a Met 222 (mely a stabilitásért felelős) Ser-re cserélve jobb aktivitást tapasztaltak de stabilitása nem volt jobb. 6.6.2. Neutrális proteázok Jellemzői Olyan fehérjebontó enzim, amely semleges ph-n dolgozik Érzékeny: hőre 15
o Stabilizátorokra CaCl 2, NaCl o Alkalikus proteáz gyorsan lebontja Termelő mikrobák Bacillus subtilis Str. griseus Aspergillus oryzae Felhasználás Élelmiszeripar: kenyér, keksz gyártás Bőripar: Szőrtelenítésre használják mivel a bőr is egy fehérje ezért ennek egy irányított folyamatnak kell ennek lennie Régen emberi fekáliával kezelték a bőröket - emberi emésztő enzimek 6.6.3. Savas proteázok Jellemzői Cys proteáz Enzimek, melyek hasonlóak a pepszinhez (ph opt =2-4), ilyen papain, bromelin Felhasználás Emésztést elősegítő Szója szósz előállítás Glutén hidrolizátum Rennin = chimozim = gasztriktin Jellemzői: (enyhén) savas proteáz Sajtgyártás legfontosabb enzime. Ez egy alvasztó enzim, Asp van az aktív centrumban tehát aszparagin-proteáz 3-4 hetes borjú gyomorban található pre-pro chymozin formában Izoenzim: chymosin A 244. aminosav Asp, 40%, nagyobb az aktivitása chymosin B 244. aminosav Gly, 60%, A tehénben vagy A illetve vagy B van A megnövekedett igényt nem tudták fedezni( 64 Mt sajt gyártása évente), ezért arra törekedtek hogy valahogy megpróbálják pótolni a hiányzó mennyiséget. Pótlással többféleképpen próbálkoztak: 1) állati pepszinek (csirke pepszin Izrael, Csehország) 2) savas penész proteázok M. miehei M. pusillus Endothia parasitica kereskedelmi készítmény 1937 (SUPRAREN USA, Franciaország) Ez is egy savas proteáz (ph = 4-5,5) Hőstabilitása viszonylag nagy, ez itt nem jó tulajdonság, megmarad az aktivitás a hőkezelés után is. Extracelluláris enzim, kicsapódhat 3.) Rekombináns DNS technika 1980 elején a borjú renin gént klónozták RENNET R szabadalmaztatták és engedélyeztették 16
Gazdaszervezet: E. coli: az enzim oldhatatlan inclusin body formába van, Az összfehérje 15-20%-a rennin probléma, hogy nem élelmiszeripari mikroba, veszélyesnek minősül B. subtilis: élelmiszeripari mikroba, de glikozilálja az enzimet Kluyveromyces lactis Élelmiszeripari, SCP tejsavón 1950-60-ban savóból izolálták A tejiparban használatos béta galaktozidázt ezzel termelte a Gist- Brocades Aktív enzim szekrécióval rendelkezik 1988-tól ezzel termeltették az enzimet (Franciaország: Gist- Brocade, Hollandia) Rekombináns K. lactis előállítása 8. ábra Plazmid A fenti ábrán látható ez a plazmid. Az expressziós vektorba beleraktak egy laktóz promóter régiót, laktóz terminátor régiót, pro-chymosin DNS-t, egy transzpozont és egy szignál-peptid részt is. Az élesztő alfa-faktor leadert, mint szignál szekvenciát használva a prochymosint extracellulárisan termeli. Mivel a törzs kevés extracelluláris fehérjét termel, könnyű a rennint izolálni: Prochymosin chymosin MAXIREN R Scale up: könnyű mert ezzel az enzimmel termelték a β-galaktozidázt (bár az intracelluláris enzim volt). Élő sejtet nem tartalmazhat a termék, ezért azokat benzoesavval megölik, alacsony ph-n és szűrik, közben a fenti reakció végbemegy. A termék tartósítását benzoesavval vagy NaCl-dal végzik, a lényeg az, hogy DNS-t nem tartalmazhat. 17
Régebben plazmidos rekombináns élesztővel termeltették a prochymosint, ma a prochymosin gént a kromoszómába építették be. MAXIREN R : Tisztább, mint a borjú rennin, nincs kísérő enzim (pepszin+ egyéb) A rennintel kémiailag és biológiailag teljesen azonos Ez kereskedelmi termék az egész világon. Termelése olcsó Állandó tisztaságú, mentes állati szervmaradványoktól Mennyisége korlátlan 1988-tól ipari termelés Seclinben Franciaországban, ez az üzem ISO 9002 Bizonyítvánnyal rendelkezik rekombináns tenyésztésére. Sőt kóser engedéllyel is rendelkezik, oly módon, hogy növényi, vegetáriánus élelmiszernek minősítették termékeiket. Az engedélyeztetés nehéz volt sok mindent figyelembe vesznek: DNS stabilitást, patogenitást, mutagenitást, toxikusságot. Etetési tesztnek kell megfelelni. Sajtgyártási teszteket is csinálnak. Organoleptikus vizsgálatokat, valamint allergológiai vizsgálatokat is. Valamint az EC előírásokat be kell tartani, melyek a termelésre és a termékre vonatkozik. A sajtgyártás technológiái Ez az első termék amelynél enzimet és mikrobát is használnak évek óta. A fontos tej fehérjék: Fehérje % Foszfát csoportok molekulánként Kazein alfa s1-kazein 32 8 Hőstabil P miatt alfa s2- kazein 8 10-13 kalcium kötő. béta-kazein 32 5 Micella képző kappa-kazein 8 1-2 80 Savó fehérjék béta-laktoglobulin 12 0 béta laktalbumin 4 0 immunglobulin 3 0 szérum albumin 1 0 20 Ezek ultraszűréssel eltávolíthatók 0,1 kalcium jelenlétében a kazein micellában van mely a következő ábrán látható: 18
9. ábra Kazein micellában Rennin hatás: 1.fázis: κ-kazein hidrolízise 10.ábra κ-kazein hidrolízise 19
11.ábra Aktív chymosin előállítása A rennin fenilalanin-metionin hasítást csinál, mely hatására keletkezik két fehérjedarab és ez a vágás destabilizálja az egész szerkezetet. 2. fázis : koaguláció, mely a hőmérséklettel és a kalcium ionokkal nő Sajtérlelés: Bizonyos sajtokat érlelni kell (4 hét-2 év), az idővel fordított arányban változik a víztartalom. Valamint előfordulhatnak: kémiai, biokémiai, mikrobiológiai változások. Ha tejcukor maradt a rendszerben és mikrobák beleesnek akkor rossz ízt produkálnak Sok szabad zsírsav keserű ízt ad A fehérje bomlás folyamatos 6.6.4. Fémproteázok Thermolizin az aszpartám gyártás fontos enzime. Törzsizolálás: meleg helyekről BOC:Benzil-oxi-karbonil-származék, mely hidrogénezéssel eltávolítható Egyébként:random dipeptidek és oligopeptidek képződnek Aszpartám gyártás Az aszpartám egy mesterséges édesítőszer, ami a fenilalanin metilészterének és aszparaginsavnak a kondenzációjával keletkezik a Thermolizin segítségével. Ahhoz, hogy a fenilalanin-metilészter aminocsoportja reakcióba lépjen az aszparaginsav karboxil csoportjával a rajtuk lévő másik funkciós csoportokat blokkolni kell. A metilészter a karbonsavat alapból blokkolja az aszparaginsav aminocsoportját pedig egy benzoil-oxi-karbonil (BOC) csoporttal blokkolják. Tehát a szintézishez szükséges: 1) L-aszparaginsav 2) Fenilalanin a fenilalanin nem baj, ha racém, mert az enzim amúgyis csak az L konformációkat kapcsolja össze, a D-fenilalanin csapadékot képez az aszpartámmal, ami kiszűrhető. 3) Ebből a kettőből a thermolizin enzim hatására csapadék keletkezik, a reakció közel semleges ph-n és 50 C-on megy végbe. 4) A csapadékot elválasztják 5) Majd visszaoldják. Az enzimes kezelés előnyei: Nincs β -izomer képződés Az enzim tökéletesen sztereoszelektív: racém Phe is használható Nincs racemizáció a szintézis alatt 20
A reakció vizes közegben végrehajtható 21
Oldott enzimet használnak Vizes fázis Fermentáció: o Szakaszos keverős reaktor o ph=7-7,5 o T=50 C 12.ábra Aszpartám előállítás 6.7. Lipáz A zsírok fizikai tulajdonságai a zsírsav komponensektől függnek. Ezek a tulajdonságok változnak: Frakcionált kristályosításkor:szilárd és folyadék frakció Hidrogénezéssel: telítetlen telített, o. p. növekedés: margaringyártás Átészterezés: kémiai: statisztikus folyamat Enzimes: irányítható régióspecifikusság Jellemzői A lipázok a zsírok módosítását végzik, az észter kötéseket hidrolizálják A hidrolízis sebessége eltérő, függ: a hossztól, a telítetlen kötésektől valamint más sebességgel hidrolizálják a glicerin szélső és a középső észtereit. A növényolaj ipar, zsíripar számára káros a lipáz hatása, itt célszerű a lipázokat távol tartani. Az átészterezési reakciókban fontos szerepet játszanak, a trigliceridben lévő kötött és a szabad zsírsavak statikus folyamatban kicserélődnek és egyensúly alakul ki. Extracelluláris enzim Induktora a növényi olaj Represszora a glükóz és a glicerin Szubsztrát specifitás Zsírsav specifikusság: nem erős, de a specifikusság mértéke függ: a zsírsav hosszától és a telítetlen kötések helyétől és számától Glicerin specifikusság a) egyes enzimeknél nincs glicerin specifikusság, a kémiai reakcióhoz hasonlóan ez is egy statisztikus átészterezés vagy bontás. (Candida nemzetség) b) Regiospecifikusság: 1, 3-ra specifikus:.mucor és Rhizopus nemzetség tagjai Használják immobilizált enzimként vagy makropórusú hordozóhoz rögzítve (diatómaföld, akrilát, poli-propiléngyanta) Termelő mikroorganizmusok: Aspergillus nemzetség Mucor nemzetség Rhyzopus nemzetség Candida nemzetség 22
Felhasználás Emésztést elősegíti (pankreász lipáz pótló) Sajtérlelésben: ízjavító (P.raquefartii spóra) Szappan ipar (Candida lipáz) Átészterezés, észterképzés Átészterezés folyamata: Ezekben a kétfázisú rendszerekben fontos szerepe van a víznek. Ha a víz koncentrációja nagy(vizes fázis) hidrolízis Ha a víz koncentrációja kicsi(szerves fázis) szintézis Zsírok átészterezése: a) Trigliceridek között b) Triglicerid és zsírsav között A hozzáadott zsírsav beépül és új zsír képződik. 23
Esettanulmány: Pálmaolaj (olcsó) kakaóvaj (drága) Triglicerid Pálmaolajban% Enzimes termék % Kakóvaj % StStSt 5 3 1 POP 58 16 16 POSt 13 39 41 StOSt 2 28,5 27 StLnSt 9 8 8 StOO 4 4 6 St = sztearát (18) P = Palmitát (16) O = Oleát (18) Ln = Linolát (18) A kakóvaj már testhőmérsékleten olvad: - élelmiszerek - kúpok Aroma anyag előállítás Észter előállítása lipáz enzimmel (Candida antaretica) 24
15.ábra Észter előállítása lipáz enzimmel i-propanol az oldószer ph=7 T= 60 C Immobilizált enzim Hozam:99% Probléma: A képződő víz eltávolítása, itt szintézisről van szó. a) azeotróp desztillációval, a propanolt folyamatosan táplálják a reaktorba b) pervaporáció i-propil mirisztát alkalmazása: szapan, kenőcs, bőrkrém előállítása Az eljárás alkalmas más észterek előállítására is. Gyártó:UNICHEM (Hollandia) 6.8. Penicillin aciláz G penicillin 6-amino-penicillánsav + fenilecetsav Félszintetikus penicillin előállítása a 6-amino-penicillánsavból történik. Enzimfermentáció E.coli ATCC III05 mutáns Fenil-ecetsav adagolás:induktív enzim 25
Glükóz katabolit represszió Oxigénlimit szükséges a jó enzimtermeléshez Intracelluláris enzim alkalmazása esetén a sejteket nagynyomású homogenizátorral fel kell tárni. Penicillin hidrolízis: a) sejttömeggel szakaszos hidrolízis Penicillin+sejt ph=8, 37 C hidrolízis Szűrés, ph = 2 6APA extrakció(metil-izobutil keton) 6-APA kicsapás izoelektromos ponton, ph = 4, 3 b) Immobilizált sejttel vagy enzimmel. Előny: ár, tisztaság 6.9. Fitáz Fitinsav: mezoinozit-hexafoszfát Fitin: a fitinsav Ca v. Mg sója növényi sejtfal komponense Állattartás: nagy mennyiségű trágya N és P tartalma nagy probléma, mert eutrofizációt okoz Növényi fitin P az állat ezt felhasználja. De a sertés és a csirke gyomra nem termel fitázt. Így vagy foszfort vagy fitázt kell a takarmányhoz adni. Termelő mikroorganizmusok: Asp. niger kis mennyiségben termeli, gazdaságtalan. A Gist-Brocades 1985 táján klónozta a gént glüko-amiláz promóter szekvenciához, és ezt a kazettát integrálták statisztikusan Asp. niger genomjába. Ennek az lett az eredménye, hogy a titer jelentősen megnőtt, a termelés gazdaságossá vált. Szűrés után koncentrálás: folyadék (ultraszűrés+ szorbit). Por: búzakorpa hordozó NATUPHOS R = nem kell foszfort adni a takarmányba és a trágya foszfor tartalma 25-30%- kal csökken. 26