A MEPS (Microextraction by Packed Sorbent) minta-előkészítési módszer alkalmazása környezeti vízminták GC-MS áttekintésében Novák Márton Környezettudomány MSc. Témavezető: Dr. Eke Zsuzsanna 2012
A GC-MS áttekintés takarékossági és környezetvédelmi szempontok GC-MS áttekintés félkvantitatív módszer cél előválogatás GC-MS áttekintés univerzális SIM SCAN (célszerű) minta-előkészítési eljárás kvantitatív nincs analízis vizsgálat diklórmetános (DCM) folyadék-folyadék extrakció (LLE)
Célkitűzések LLE helyettesítése ~ környezettudatos eljárással: MEPS (Microextraction by Packed Sorbent) módszerfejlesztés során fenolok MEPS-es extrahálása megfelelő határértékek elérése
A MEPS (Microextraction by Packed Sorbent) Tömítés Minta Szűrőbetét Fecskendő Tű Záró gyűrű MEPS töltet (C2, C8, C18, SCX, SIL)
A nagytérfogatú injektálás kapilláris GC split/splitless injektor 1-5 μl injektálható MEPS eluálás (min. 10-30 μl) elúció ~ injektálás speciális megoldások legsokoldalúbb PTV injektor használt üzemmód: oldószer lefúvatás vezérelt sebességű injektálás
A használt készülék Agilent 6890 gázkromatográf Agilent 5973 tömegspektrométer CTC COMBI PAL automata mintaadagoló Peltier hűtéssel ellátott Gerstel CIS 4 PTV injektor
A módszerfejlesztés célkomponensei A módszer fejlesztéséhez szűkebb célkomponens csoport A válogatás szempontja: összes fenol vegyület minél jobb reprezentálása (szerkezeti + kémiai tulajdonságaikban - vízoldhatóság, polaritás, forráspont) CAS M forráspont vízoldhatóság (g/mol) ( 0 C) (g/l) log K ov pk a fenol 108-95-2 94 181,7 80 1,50 9,99 2-klórfenol 95-57-8 129 174,9 28,5 2,15 8,55 2-krezol 95-48-7 108 191 20 1,98 10,31 2-nitrofenol 88-75-5 139 214-216 2 1,77 7,21 2,4-dimetilfenol 105-67-9 122 211-212 5 2,35 10,6 2,4-diklórfenol 120-83-2 163 209-210 4,5 3,17 7,85 2,4,6-triklórfenol 88-06-2 197 246 0,8 3,69 7,42 2,4-dinitrofenol 51-25-5 184 351 6 1,53 4,09 2,3,4,6-tetraklórfenol 58-90-2 232 268 1 4,45 5,40 pentaklórfenol 87-86-5 266 309-310 0,02 5,18 4,93
A nagytérfogatú injektálás optimálása I. fenolok eluálása: etil-acetát (EtOAc) és diklórmetán (DCM) optimálandó paraméterek: 1. Injektor kiindulási T: DCM:10 0 C (fp.=40 0 C) EtOAc: 30 0 C (fp.=76,5-77,5 0 C) 2. Fejnyomás a lefúvatás alatt: stop flow beállítás ~ légköri nyomás 3. Injektor felfűtési sebessége: 12 0 C/s 4. Lefúvatás sebessége: 5. Injektálás sebessége: =>kiindulási alap megállapítása: DCM: 120 ml/perc 1,33 μl/s EtOAc: 120 ml/perc 1,00 μl/s A beállításoknál jelentős csúcstorzulások túl sok oldószer kerül az oszlopra
A nagytérfogatú injektálás optimálása II. a probléma megoldására: kétlépcsős lefúvatás második lépcső CIS - T első lépcső injektor kiindulási T split lefúvatás (1. lefúvatás) split szelep zár, első felfűtés lefúvatás az oszlopon keresztül (2. lefúvatás) IDŐ komponensek átvitele az oszlopra második felfűtés első lépcső-t: ~oldószer fp.-ja közelében DCM: 40 0 C EtOAc: 75 0 C 2. lefúvatás ideje: DCM és EtOAc: 3 perc második lépcső-t: DCM és EtOAc: 280 0 C
A nagytérfogatú injektálás optimálása III. visszanyerés (%) 260,0 240,0 220,0 200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 DCM 1,33 µl/s 1,38 µl/s 1,43 µl/s 1,48 µl/s 1,53 µl/s v injektálás optimálása: DCM: 1,48 μl/s (120ml/perc)
visszanyerés (%) A nagytérfogatú injektálás optimálása IV. 200 180 EtOAc 160 140 120 100 80 60 40 1 µl/s 1,05 µl/s 1,10 µl/s 1,15 µl/s 20 0 v injektálás optimálása: EtOAc: 1,15 μl/s (120ml/perc) 1,05 μl/s az ideális
A nagytérfogatú injektálás optimálása V. v lefúvatás optimálása: 80, 100, 120, 140, 160 ml/perc DCM: 120 ml/perc ideális EtOAc: 120 ml/perc ideális A b u n d a n c e 5 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 T I C : E T O A C _ O P T I M A L A S 2. D EtOAc 1,05 µl/s; 120 ml/perc A b u n d a n c e 7 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 T I C : D C M _ O P T I M A L A S _ 4. D DCM 1,48 µl/s; 120 ml/perc 4 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > 1 4. 0 0 1 6. 0 0 1 8. 0 0 2 0. 0 0 2 2. 0 0 2 4. 0 0 2 6. 0 0 2 8. 0 0 T im e --> 1 2. 0 0 1 4. 0 0 1 6. 0 0 1 8. 0 0 2 0. 0 0 2 2. 0 0 2 4. 0 0 2 6. 0 0 2 8. 0 0 A b u n d a n c e 5 0 0 0 0 0 0 T I C : v e n t f l o w _ 1 6 0. D EtOAc 1,05 µl/s; 160 ml/perc A b u n d a n c e 6 5 0 0 0 0 0 DCM 1,48 T I C µl/s; : v e n t f lo w 80 _ D Cml/perc M _ 8 0. D 4 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > 1 4. 0 0 1 6. 0 0 1 8. 0 0 2 0. 0 0 2 2. 0 0 2 4. 0 0 2 6. 0 0 2 8. 0 0 T im e --> 1 2. 0 0 1 4. 0 0 1 6. 0 0 1 8. 0 0 2 0. 0 0 2 2. 0 0 2 4. 0 0 2 6. 0 0 2 8. 0 0
A MEPS optimálása a megfelelő szorbens és eluens TÖLTET C8 ELUENS: extrakció 1,5 ml 500 µg/l ph=2 vízminta, 60*100 μl - V felsz = 10 μl/s eluálás 100 µl DCM-el és EtOAc-al, 5 párhuzamos mérés - V felsz = 2 μl/s Csúcsterület milliárd 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 DCM EtOAc DCM nitrofenolok fenol nagyobb szórás EtOAc nagyobb csúcsterületek kisebb szórás EtOAc a megfelelő
visszanyerés (%) A MEPS optimálása a töltet vízmentesítése mérés: a töltet vizes mosása, 100 µl 1 mg/l standard oldat eredmények: alacsony visszanyerések + magas szórás ok: V eluens reprodukálhatatlan & injektorba kerülő víz megoldás: 20*100 μl levegő átszívatása, v felsz = 20 μl/s, extrakció - elúció 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 vízmentesítés nélkül levegő átszívatás szórás csökken + visszanyerés nő
A MEPS optimálása a töltet mosása, kondicionálása kondicionálás: MeOH + deszt. víz, 5*100 μl 100 μl MeOH mosás: takarékosság, memóriaeffektus mérés: 200 µg/l vízminta, újabb 100 μl EtOAc 4-es beállítás~valós vízminták mátrixtartalma nagyobb mosó oldószer igény A módszer takarékos és hatékony kondicionálás mintafelvitel előtt mosás injektálás után felhasznált oldószer MeOH EtOAc MeOH EtOAc MeOH memória effektus 1 100 µl 9 * 70 µl 9 * 70 µl 630 µl 730 µl <LOD 2 100 µl 7 * 70 µl 7 * 70 µl 490 µl 590 µl <LOD 3 100 µl 5 * 70 µl 5 * 70 µl 350 µl 450 µl <LOD 4 100 µl 3 * 70 µl 3 * 70 µl 210 µl 310 µl <LOD 5 100 µl 2 * 70 µl 2 * 70 µl 140 µl 240 µl <LOD 6 100 µl 1 * 70 µl 1 * 70 µl 70 µl 170 µl <LOD 7 100 µl - - - - táblázat komponens visszanyerés (%) fenol <LOD 2-klórfenol <LOD 2-krezol <LOD 2-nitrofenol <LOD 2,4-dimetilfenol <LOD 2,4-diklórfenol <LOD 2,4,6-triklórfenol 2,80 2,4-dinitrofenol <LOD 2,3,4,6-tetraklórfenol 2,48 pentaklórfenol 1,38
A MEPS optimálása a mintafelvitel, folyamatos átpumpálás folyamatos átpumpálás megszakított átpumpálás mintamennyiség 20 ml (általában 1-2 ml; előny hátrány) átmozgatások száma: 100; 200; 300; 400; 500 ~ v felsz =10 μl/s, 50 µg/l 0,7 2,4,6-triklórfenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol Csúcsterület milliárd 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 100 200 300 400 500 Átmozgatások száma 400 ~ maximális kinyerés közelében időigények v felsz befolyásol cél: nagyobb sebességek
A MEPS optimálása a mintafelvitel, folyamatos átpumpálás felszívási sebesség: optimálás 200, 300, 400 átmozgatás; 10, 15, 20 μl/s Átmozgatások száma 200 300 400 Felszívási sebesség (µl/s) Szükséges idő (perc) 10 48 66 82 15 28 42 55 20 18 33 48 megfigyelés folyadékfront lemarad~a töltet ellenállása V gőztér 15 és 20 μl/s-nál V minta reprodukálhatatlan jelentős hiba megoldás: V gőztér szabályozó módszer kifejlesztése V minta reprodukálható mérések: a 9 beállításnál 3 párhuzamos, 50 µg/l 20 ml
A MEPS optimálása a mintafelvitel, folyamatos átpumpálás 15 μl/s-nál is alacsony szórások 20 μl/s csak korlátozva alkalmazható (időnyereség elvész) leghatékonyabb: 300*10 μl/s & 400*15 μl/s (~10 p. nyereség) Csúcsterület milliárd 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 200 10 µl/s 15 µl/s 20 µl/s Csúcsterület milliárd 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 300 10 µl/s 15 µl/s 20 µl/s 0 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol 0 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol Csúcstzerület milliárd 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 400 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol 10 µl/s 15 µl/s 20 µl/s
A MEPS optimálása a mintafelvitel, megszakított átpumpálás 1,2 folyamatos megszakított Csúcsterület milliárd 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol a feldolgozható minta mennyisége a tű behatolási mélysége ~a 20 ml-ből 10,5 ml mozgatható át Az extrakció hatásfoka a folyamatos módszerrel nagyobb
Az optimált MEPS módszer MINTA-ELŐKÉSZÍTÉS INJEKTÁLÁS GC MS PARAMÉTER Fecskendő & töltet Kondicionálás Mintafelvitel Vízmentesítés Eluálás Mosás CIS T-program Injektor beállítások v inj. & v lefúvatás Oszlop Vivőgáz, v áramlási T-program Üzemmód Adatgyűjtés kezdete Transfer line-t Kvadrupol -T Ionforrás-T OPTIMÁLT BEÁLLÍTÁS 100 μl-es MEPS fecskendő; C8 5*100 μl MeOH és 5*100 μl deszt. víz 20 ml; 400*100 μl ; v felsz = 15 μl/s; V gőztér szabályozó folyamatos átpumpálás 20*100 µl levegő, 20 µl/s 100 µl EtOAc, v felsz =2 µl/s 3*70 μl EtOAc és 3*70 μl MeOH 30 0 C (1,59 perc), 12 0 C/s 75 0 C (3 perc), 12 0 C/s 280 0 C (10 perc) stop flow (1,59 perc), splitless time (5 perc) 1,05 µl/s - 120 ml/perc DB5-MS; 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm 5.0-ás tisztaságú He; 1,0 ml/perc 50 0 C (6,94 perc); 10 0 C/perc 100 0 C; 6 0 C/perc 180 0 C; 40 0 C/perc 300 0 C (2 perc) SCAN (41-400 AMU) 10 perc 300 0 C 150 0 C 230 0 C
A folyadék-folyadék extrakciós eljárás 500 ml vízminta feldolgozása rázótölcsérben 100-150 g NaCl mintánként ~ habosodás megelőzése, fázisok szételegyedése extrakcó 2 * 10 ml DCM, részletenként 5 perces kirázás vízmentesítés 2-3 g Na 2 SO 4 szűrés 0,45 μm papírszűrő koncentrálás nitrogénáramban történő bepárlás 1 ml-re injektálás 1 μl, hideg splitless
A MEPS eljárás összehasonlítása az LLE-vel I. A MEPS előnyei: + alacsony mintaigény + alacsony oldószerigény + időtakarékos + automatizálható MEPS LLE Mintaigény 1-20 ml 500 ml Oldószerigény 0,6 ml 20 ml Időigény 40 perc 2-3 óra Költség $ $$$ Automatizálás + szorbens többször használható
A MEPS eljárás összehasonlítása az LLE-vel II. 6/2009 (IV. 14.) KVVM-EÜM-FVM EGYÜTTES RENDELET, 2. melléklet szimultán SIM/SCAN
Az optimált módszer alkalmazása valós vízmintákra mintavétel Duna valós vízminta & adalékolt vízminta (10-300 μg/l) jelentős mátrixtartalom nem okoz problémát: ~ töltet nem tömődik ~ könnyen mosható Az extrakció és az elúció zavartalanul kivitelezhető
Összefoglalás nagytérfogatú injektálás optimálása DCM és EtOAc esetén MEPS optimálása (töltet & eluens; vízmentesítés; mosás; időigény ) MEPS összehasonlítása az LLE-vel (minta- oldószer- időigények; LOD) MEPS alkalmazhatósága valós vízmintákra tervek: MEPS alkalmazása fenolok kvantitatív analízise más vegyületcsoportok GC-MS áttekintése Az elért eredmények alapján a MEPS minta-előkészítési eljárás korszerű, takarékos és praktikus helyettesítője lehet az eddigiekben alkalmazott technológiáknak. KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
1. Magyarázza el, hogy mit ért a diszkrimináció fogalma alatt (pl. 9. lap). a mérendő komponensek a mintában lévő arányoknak megfelelően kerüljenek az oszlopra torzítatlanul, ellenkező esetben diszkrimináció leggyakrabban: forráspont-diszkrimináció (magasabb fp. vegyületek) tű-diszkrimináció (illékonyabb vegyületek) hőbomlás okozta diszkrimináció (hőre érzékeny vegyületek)
2. Sajnálatos, hogy pont a katekolt kihagyta a módszerfejlesztésből, hiszen a klórbenzolok biológiai bomlásterméke. Jelenléte nagyon jó indikátora lehet a szennyezésnek. A töltet megfelelő kiválasztása nem jelenthet megoldást a vízoldhatóság problémájára? katekol és rezorcin extrém magas vízoldhatóság 430 g/l és 717 g/l kereskedelemben kapható MEPS töltetek : SIL, C2, C8, C18, SCX ~ vízből nem dúsítható a probléma megoldása: extrahálás előtt származékképzés szükséges (MSZ 1484-9:2009 szabvány: fenolok vízmintából való meghatározása) acetilezés ecetsavanhidriddel
3. A dinitrofenol ellentmondásos viselkedését mi magyarázza? Nagyon érdekes lett volna e tekintetben az átmozgatás hatásvizsgálatánál alkalmazása! Miért nem tette? fenolok ~ savas tulajdonságúak (OH-csoport könnyen disszociál fenolát ion képződik) a fenolok savi erőssége ~ aromás gyűrűhöz kapcsolódó szubsztituensek függvénye ~ nitrocsoport savi erősség nő LOD értéke nagy nagy töménységű oldatot igényel (~3000 μg/l) nagy szórás az extrakció paramétereinek változtatása kevéssé befolyásol vízoldhatóság (g/l) log K ov pk a fenol 80 1,50 9,99 2-klórfenol 28,5 2,15 8,55 2-krezol 20 1,98 10,31 2-nitrofenol 2 1,77 7,21 2,4-dimetilfenol 5 2,35 10,6 2,4-diklórfenol 4,5 3,17 7,85 2,4,6-triklórfenol 0,8 3,69 7,42 2,4-dinitrofenol 6 1,53 4,09 2,3,4,6-tetraklórfenol 1 4,45 5,40 pentaklórfenol 0,02 5,18 4,93