A proteomikai módszerek fejlõdési irányai Janáky Tamás Orvosi Vegytani Intézet, Szegedi Tudományegyetem
360 Degree CEO Perspective Of The Global Healthcare Industry 2008 Frost & Sullivan. All rights reserved. This document contains highly confidential information and is the sole property of Frost & Sullivan. No part of it may be circulated, quoted, copied or otherwise reproduced without the written approval of Frost & Sullivan
Top 10 Global Healthcare Trends 2007 2020 High Impact Projected Impact on the Healthcare Industry Low Impact Low Certainty High
Information based medicine A betegségek molekuláris szintû pathomechanizmusának és az egyéni fehérjeprofilnak ismeretében molekuláris szintû diagnózis racionális terápia tervezése personalized medicine right drug at the right dose for the right disease to the right patient
U.S. Balanced National Biomedical Research Portfolio, FY2008 Clinical Research Clinical Research Translational Research Basic Research Translational Research Basic Research NIH $29 B Private Sector $59 B
Gyógyszermolekulák célpontjai túlnyomó többségükben fehérjék Quelle: Hopkins & Groom, Nat.Rev.Drug.Disc. 1 (2002) 727
Biológiai információ-áramlás Bioinformatika Adat Adat Adat Adat Genomika Transcriptomika Proteomika Metabolomika Gének mrns Fehérjék Metabolitok Rendszerbiológia A genomika, proteomika és metabolomika eredményeinek átfogó értelmezése.
Miért lenne jó ismerni a fehérjéket? biológiai útvonalak, hálózatok, jelátviteli mechanizmusok felderítése, megértése betegségek pathomechanizmusának jobb megértése fehérje biomarkerek felfedezése új gyógyszer-célpontok felfedezése fehérjealapú terápiás szerek felfedezése és elõállítása
Proteomika Strukturális proteomika: a proteom fehérjéinek kvalitatív analízise (3D szerkezetének meghatározása) Expressziós proteomika: (különbségi) Külsõ, v. belsõ tényezõk hatására bekövetkezõ fehérjeexpresszió változásainak minõségi és mennyiségi meghatározása Funkcionális proteomika: a fehérjék sejtbeni lokalizációjának, poszt-transzlációs módosításainak, fehérje-fehérje kölcsönhatásoknak és funkcióinak meghatározása
Az expressziós proteomikában alkalmazott technológiák Elválasztástechnika Tömegspektrometria Bioinformatika
Milyen nehézségekkel találkozunk a proteomikai vizsgálatoknál? Fehérjék nagy száma: 100-500.000 sejtekben: 10-30.000 plazmában: 50-100.000 Óriási kihívás az Fehérjék nagysága: 50 100,000 aminósav 5,000-1,000,000 Da elválasztástechnika és a Relatív elõfordulás: széles határok ~ 10-1,000,000 molekula / sejt mennyiségi meghatározás elõtt Fehérjék koncentrációtartománya: sejtekben: 10 2 10 6 M testfolyadékokban : 10 2 10 12 M
Sample preparation Sample collection (i.e. Laser capture microdissection) Homogenation and protein isolation Contaminant removal/ cleanup Fractionation
Humán plazma fehérjeösszetétele Immunoglobulin G 16.61% a1-antitrypsin 3.83% a2-macroglobulin 3.64% 10% Immunoglobulin A 3.45% Transferrin 3.32% Haploglobin 2.94% Gc-Globulin 0.48% Immunoglobulin M 1.98% a-trypsin inhibitor 0.58% Other 9.91% a1-antichymotrypsin 0.58% Complement C4 0.45% Ceruloplasmin 0.48% Fibronectin 0.42% Prealbumin (thyroxine-binding) 0.32% C1 Esterase inhibitor 0.32% a1b- Glycoprotein 0.29% b2-glycoprotein I 0.29% 1% b2-glycoprotein II 0.27% Complement C1 0.22% maradék a2hs-glycoprotein 0.80% Albumin 54.31% Hemopexin 1.05% Complement C3 1.12% a1-acid glycoprotein 1.25% Fehérjék koncentrációtartománya: 1 to 10-12 M Klinikailag informatív fehérjék mennyisége 10 nagyságrendben változhat!
Multiple Affinity Removal Column High-Abundant Proteins 2500 2000 1500 Low-Abundant Proteins Elution Buffer Equilibration Buffer Absorbance (mau) 1000 500 0 Inj 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min)
ProteoMiner (Bio-Rad)
IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) O O O O N Fe 3+ O O OH P OR OH 2 His tartalmú fehérjék Foszfopeptidek
Preparatív izoelektromos fókuszálás ph gradiens vízoldható amfolitokkal 3 g fehérjéig
OFFGEL elektroforézis
Fehérjék azonosítási lehetõségei
Elválasztástechnikai módszerek Elektroforézis izoelektromos fókuszálás poliakrilamid elektroforézis 2D elektroforézis kromatofókuszálás Kromatográfia 1D 2D Multi D
Applications for Gel-based Proteomics Establishing reference maps Organellar fractions Total soluble fraction Qualitative differences Comparison of genotypes Comparison of different organelles Biomarker discovery Quantitative differences Total soluble Protein Response to drugs Changes during development Response to stimulation Secreted Protein
A 2D ELEKTROFORÉZIS KORLÁTAI PROBLÉMA MEGOLDÁS felbontás nem elég jó low-abundant fehérjék (1-10 6 dinamikus tartomány membránfehérjék (oldhatóság!) bázikus fehérjék detektálás IEF szûkebb ph tartományban szelektív dúsítás, v. elõfrakcionálás új detergensek új IPG gélek (izotóp), új festékek
2D Fluoreszcens Differenciál Gél Elektroforézis (2D-DIGE)
Kromatográfiás technikák peptidek, fehérjék analíziséhez Gélszûrés Hidrofób kölcsönhatás Ioncserés Fordított fázisú Affinitási
Multidimenzionális elválasztások
ProteomeLab PF2D Chromatofocusing column Isocratic pump ph monitor Gradient pump Column oven Reverse Phase Non Porous Silica column UV monitor UV monitor 96 well fxn collector/ autosampler
Kromatográfia nanohplc nanouplc Oszlop: 75 μm Áramlási sebesség: 200 nl/perc
HPLC-Chip/MS Fluid connections 6 port rotary valve Rotor Stator Microfluidics Side View Top view Waste Sample in Sample enrichment column Top View Nano LC Pump LC Column Nanoelectrospray tip
Waters Trizaic nanotile
Tömegspektrometriás ionizációs módszerek ESI (electrospray ionization) MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization)
Tandem tömegspektrométerek a proteomikában Kvadrupól-kvadrupól (QQQ) Kvadrupól-ioncsapda (QIT) Kvadrupól-TOF (QTOF) TOF-TOF Ioncsapda-TOF Ioncsapda-Orbitrap Ioncsapda-FTICR
Main demands for mass spectrometers Accuracy (ppm-ppb) Sensitivity (fmol-amol) Speed (20 spectra/sec) Quantitative Wide-linearity Wide dynamic range...
Tömegmérés pontossága (Mass Accuracy) Növekedésével egyre javul a fehérjeazonosítás megbízhatósága Lehetõség nyílik izobár peptidek azonosítása, polimorfizmus, poszttranszlációs módosítások, stb. pontos meghatározására
Kvantitatív fehérjeprofil meghatározása peptidek kvantitálása Label-free quantitation fehérjék kvantitálása
Targeted, Hypothesis-Driven Mass Spectrometry Multiple Reaction Monitoring (MRM) on QQQ v. QTRAP tömegspektrométeren
Thermo Scientific LTQ Velos Dual-Pressure Linear Ion Trap
Thermo Scientific Orbitrap Velos
SYNAPT G2 from Waters Over 40,000 FWHM resolution Linear dynamic range of up to 10 5 Exact mass (1 ppm RMS) Class-leading sensitivity 20 spectra/sec
Waters Xevo TM QTof, QQQ MS
Agilent 6540 Ultra-High-Definition (UHD) Accurate Mass Q-TOF far the highest-performing benchtop Q-TOF on the market Agilent 6430 Triple Quadrupole LC/MS
maxis QTOF MS Speed, accuracy and sensitivity Fast chromatography applications Small molecule ID Trace analysis studies Metabolomics Quantitative proteomics
AB SCIEX QTRAP 5500
4800 MALDI TOF/TOF Analyzer
Tömegspektrométerek kiválasztása Megfelelõ tömegspektrométert a megfelelõ célra!
A bioinformatika jövõje A biológiai rendszerekrõl nyert adatok olyan rendszerezése, amely lehetõvé teszi a már meglévõ információk széleskörû elérését, ill. új információk beépítését. Olyan új eszközök (algoritmusok) kifejlesztését, amelyek segítik a biológiai adatok analízisét. A rendelkezésre álló adatok olyan globális analízise, mely lehetõvé teszi közös elvek érvényesülésének felderítését különbözõ rendszerekben, ill. új összefüggések megvilágítását.
Identification of Protein-Protein Interaction Yeast two-hybrid system Immunoassay Protein chip Biosensor system Molecular image Tandem affinity purification (TAP) and mass spectrometry (MS)
Adatbázisok a fehérje-fehérje kölcsönhatásokról Interactions Databases
Protein Chip (microarray) Antibody Chip Detect Ag-Ab interactions Protein Chip Protein:protein Protein:drug Enzyme:substrate Ligand Chip And more.
Jövõ 10-6 M 10-9 M 10-12 M 10-15 M 10-18 M 10-21 M
Összefoglalás 1/ A proteomika eredményes mûveléséhez az elválasztástechnika, a tömegspektrometriás fehérjeazonosítás és a bioinformatika szoros együttmûködésére van szükség. 2/ Ideális az a megoldás, ha a proteomikai szakember már a kísérlet megtervezésétõl részt vesz a kutatási feladat megoldásában. 3/ Versenyképes csak olyan 6-10 tagú csoportok lehetnek a proteomika területén, amelyeknek rendelkezésére áll a teljes mûszeres háttér és a fenti 3 terület szaktudása. 4/ A proteomika egyre inkább egy adott szemléletmódot is jelent, az egymással komplex kapcsolatban (hálózatban) álló fehérjék mûködésének megértését. 5/ Van már Magyarországon egy olyan proteomikai centrum (DNT-Kromat Kft., MTA-SzBK, ELTE), amelyik sikeresen mûködik, elsõsorban a neuroproteomika területén.