SE, Modellmembránok 2014.04.23. Membránok és membránfehérjék Elméleti és kísérletes módszerek lipidek és membránfehérjék tanulmányozására Hegedűs Tamás tamas@hegelab.org MTA-SE Molekuláris Biofizikai Kutatócsoport SE Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Foszfolipidek membrán-lipidek Koleszterin - cholesterol
Transzmembrán fehérjék Biológiai membránok összetétele Eltérő organizmusok eltérő membrán Archaea Membrán raft sphingolipides cholesterol 1. Éter kötés (nehezebben hidrolizálható) 2. Elágazások (nehezebben oxidálódik) 3. Glicerol szterokémiailag invertált
Eltérő organizmusok eltérő membrán élesztő Lipidek kofaktor-szerepe fehérjék működésében Trp permease ABC weak organic acids Souza, C.M., and H. Riezman (2011) Metab. Eng. 13, 555-569. Eltérő organizmusok eltérő membrán rovarsejtek ATP Binding Cassette (ABC) fehérjék Spodoptera frugiperda (pl. Sf9, Sf21 sejtvonalak) Baculo vírus NBD NBD1 NBD2
A multi-rezisztencia és felfüggesztése ABCG2 koleszterin-függő működése I. membrán preparátum fehérje tisztítás sejtmag DNS célfehérje ATP MDR fehérje ADP+P i sejtmag DNS célfehérje I I I MDR fehérje I ATPase, mol Pi/sec/ mol ABCG2 20 15 10 5 0 DDM FC-16 vanadate basal Quercetin vanadate sensitive ATPase mol Pi/sec/mol ABCG2 20 15 10 5 0 E.coli E.Coli +chol Brain PC +chol basal quertecin ABCG2 koleszterin-függő működése II. A membrán fluiditása, fázisátmenetei vezikula MTX MTX MTX MTX MTX ATP 1. Hőmérséklet 2. Összetétel lánchossz cisz-kötések koleszterin fázisátalakulás MTX ATP ATP ATP
Cisztás fibrózis CFTR működésének lipid és hőmérséklet függése black membrane Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl- Cl- Cl- Cl - Cl - Cl - Cl - C O Hegedus et al. BBA 2006 Membránfehérjék nanodisc-ben Lipid-összetétel lokális működés szabályozás chol PC PE PS PI PG CL plazmamembrán 30 18 11 9 4 0 0 Golgi-komplex 8 40 15 4 6 0 0 SER 10 50 21 0 7 0 2 RER 6 55 16 3 8 0 0 magmembrán 10 55 20 3 7 0 0 lizoszóma membr. 14 25 13 0 7 0 5 mitokondriális belső membrán 3 45 24 1 6 2 18 külső membrán 5 45 23 2 13 3 4
Szerkezet meghatározás Röntgen krisztallográfia Szerkezet meghatározás cubic phase number of PDB entries 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 monoolein/water 2002 2004 2006 2008 2010 2012 year number of membrane proteins in PDB 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 all α β 0 2002 2004 2006 2008 2010 2012 year pdbtm.enzim.hu, Tudsnády Gábor a b Crystals of membrane proteins growing in the lipidic mesophase. Szerkezet meghatározás 2D kristály c d (a)bacteriorhodopsin (b) light-harvesting complex II (c) adhesin/invasin OpcA (d) vitamin B12 transporter BtuB (e) human b2 adrenergic recepton-t4 lysozyme chimera (f) Carbohydrate transporter from Pseudomonas. 2D kristály e f
Mai témák Szimulációk létjogosultsága Atomi szintű információt adnak mozgásokról. Kísérletes módszerek membránok modellezésére Elméleti módszerek membránok modellezésére Kísérletes módszerek általában nem szolgáltatnak közvetlen információt az atomi szintű történésekről Pl. NMR és MD - igen Szimulációk problémái Membránfehérjék topológiája Bakos et al. JBC 1996 A vizsgálni kíván membránfehérje térszerkezete nem ismert Általában a membránfehérjék membrán topológiája sem ismert Lipid-lipid, lipid-fehérje kölcsönhatások fizikai alapjai kevéssé ismertek Nagy rendszer, sok atom csak rövid szimulációk lehetségesek www.expasy.org Tusnády Gábor, www.enzim.hu
Aminosavak megoszlása Molekuláris dinamika Molekuláris dinamika (MD) valós potenciálfelület mozgásegyenletek idő-lépésenkénti numerikus megoldása trajektória White and Wimley Ann Rev Biophys and Biomolecular Structure, 1999 idő (CPU, valós) potenciál kiszámolása a szűk keresztmetszet numerikus integrálás hibája fs-os integrációs lépések oldószer (explicit/implicit) boundary condition White and von Heijne, Current opinion in structural biology, 2005 A force field Események időskálája Baker (2007) F. Ding and N.V. Dokholyan, TRENDS in Biotechnology, 23:450 (2005)
Diszkrét Molekuláris Dinamika (DMD) Egyszerűsített (Coarse Grain) modellek 100 50 Energy 0-50 -100 2 4 6 8 r, Å wikipedia Ding, F., Dokholyan, N. V. PLoS Comput Biol 2:e85 Sansom, Oxford University Marrink, Groningen, MARTINI force field Lipid struktúrák összeszerelődése Kettősréteg felépülése a fehérje köré Nagy méretű mozi
PIP2 kötődése Kir kálium csatornához Fehérjék konformációinak stabilitása 0 ns 20 ns ABC fehérjék konformációi Az alul nyitott apo szerkezet nem stabil alul-zárt holo (+ATP) alul-zárt apo (-ATP) alul-nyitott apo (-ATP) Gyimesi et al. BBA 2012
Az alul nyitott apo szerkezet nem stabil Hidrofób aminosavak kerülnek felszínre t = 0 ns rendszer Sav1866 ATP/ATP #1 megtartott hélixtartalom 90.04% hmdr1 holo 91.84% hmdr1 apo 64.30% t = 20 ns mmdr3 63.13% Alul nyitott apo szerkezet elemi cellája Köszönetnyilvánítás mmdr3, PDBID:3G5U MsbA, PDBID:3B5W www.hegelab.org Jakab Kristóf Sarankó Hajnalka Szöllősi Dániel Tordai Hedvig Tóth Attila Sarkadi Balázs OVSZ, MTA TTK Kellermayer Miklós SE Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Erdős Gábor Erdei Áron Harmat Zita KTIA_AIK_12-1-2012-0025