Barangolások a peptidek és fehérjék világában Orbán Erika Kutató-fejlesztő, Biotechnológiai analitikai osztály, Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyrt. Magyar Tudomány Ünnepe, Kémiai Tudományok Osztálya és az Alapítvány a Magyar Peptid- és Fehérjekutatásért ünnepi előadóülése 2016.november 14.
Az irányított tumorterápia lehetséges célpontjai Tumorsejteken nagy mennyiségben kifejeződő sejtfelszíni molekulák Millar, Animal Reproduction Science, 88 (1-2), 2005. Irányító molekulák: GnRH-származékok http://www.biooncology.com/researcheducation/her/overview/receptors/index.html Irányító molekula: LTVSPWY peptid (fág-könyvtár)
A Dau=Aoa-LTVSPWY-NH 2 konjugátum az ErbB2 receptor célzására Szintézis és kémiai jellemzés Stabilitásvizsgálat (nátrium-citrát/citromsav puffer, sejttenyésztő médium, patkány máj lizoszóma preparátum) Abszorpciós és emissziós tulajdonságok DNS-kötő képesség In vitro citosztatikus hatás Sejtbejutás Hatás HL-60 sejtek protein expressziós profiljára SK-BR-3 HepG2 HL-60 MCF-7 Dau=Aoa- LTVSPWY-NH 2 37,90±2,83 3,07±0,02 0,53±0,12 7,42±0,49 Dau 3,64±0,52 0,66±0,21 0,05±0,03 0,18±0,09
Reprezentatív gélképek A: Kontroll, B: Dau Összehasoníltás: PDQuest 8.0 szoftver A: Kontroll, B: Dau=Aoa-LTVSPWY-NH 2
Összehasonlítások Kontroll 4 Dau 8 3 Dau=Aoa-LTVSPWY-NH 2
Fehérjék azonosítása A: Kontroll, B: Dau Sejtváz DNS szintézis Sejtciklus szabályozás Fehérje adatbázisban szereplő neve, eredete, rövidítése Folt száma Mennyiséggel arányos mérőszám Kontroll minta Dau-kezelt minta "Foldchange" Mascot score Mr(Da) pi Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (Cyclin) - Homo sapiens (Human) - [PCNA_HUMAN] Tubulin beta chain (Tubulin beta-5 chain) - Homo sapiens (Human) - [TBB5_HUMAN] Ran-specific GTPase-activating protein (Ranbinding protein 1) (RanBP1) - Homo sapiens (Human) - [RANG_HUMAN] Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin) - Homo sapiens (Human) - [ACTB_HUMAN] 201 1440,7 171,5 0,1 2111 28768,78 4,57 1504 1337,6 9713,9 7,3 11510 49670,82 4,78 2001 789,7 1648,5 2,1 560 23310,12 5,19 2402 11178,5 1615,8 0,1 17877 41736,73 5,29
A: Kontroll B: Dau=Aoa-LTVSPWY-NH 2 Sejtváz Sejtciklus szabályozás Anyagcsere Chaperon Jelátvitel Fehérje adatbázisban szereplő neve, eredete, rövidítése Translationally-controlled tumor protein (TCTP) (p23) (Histamine-releasing factor) (HRF) (Fortilin) - Homo sapiens (Human) - [TCTP_HUMAN] Rho GDP-dissociation inhibitor 2 (Rho GDI 2) (Rho-GDI beta) (Ly-GDI) - Homo sapiens (Human) - [GDIS_HUMAN] Ran-specific GTPase-activating protein (Ran-binding protein 1) (RanBP1) - Homo sapiens (Human) - [RANG_HUMAN] Transitional endoplasmic reticulum ATPase (TER ATPase) (15S Mg(2+)-ATPase p97 subunit) (Valosin-containing protein) (VCP) - Homo sapiens (Human) - [TERA_HUMAN] Plastin-2 (L-plastin) (Lymphocyte cytosolic protein 1) (LCP- 1) (LC64P) - Homo sapiens (Human) - [PLSL_HUMAN] Heat shock cognate 71 kda protein (Heat shock 70 kda protein 8) - Homo sapiens (Human) - [HSP7C_HUMAN] D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (EC 1.1.1.95) (3- PGDH) - Homo sapiens (Human) - [SERA_HUMAN] Folt száma Mennyiséggel arányos mérőszám Kontroll minta Dau=Aoa- LTVSPWY- NH2 kezelt minta "Foldchange" Mascot score Mr(Da) 1002 1406,2 5,6 0,004 3665 19595,34 4,84 1003 2253,9 5,6 0,002 3288 22988,01 5,10 2001 789,7 1805 2,286 560 23310,12 5,19 2802 994,4 271,7 0,273 2657 89321,8 5,14 3702 482,3 1065,6 2,209 4924 70288,39 5,29 3802 6507,8 5,6 0,001 10972 70898,09 5,37 6604 1067,9 526 0,493 4131 56650,5 6,29 pi
A: Dau B: Dau=Aoa-LTVSPWY-NH 2 Fehérje adatbázisban szereplő neve, eredete és rövidítése Folt száma Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (Cyclin) - Homo sapiens (Human) - [PCNA_HUMAN] 14-3-3 protein gamma (Protein kinase C inhibitor protein 1) (KCIP-1) - Homo sapiens (Human) - [1433G_HUMAN] Tubulin beta chain (Tubulin beta-5 chain) - Homo sapiens (Human) - [TBB5_HUMAN] Mennyiséggel arányos mérőszám Dau-kezelt minta Dau=Aoa- LTVSPWY- NH 2 kezelt minta "Foldchange" Sejtváz DNS szintézis Jelátvitel Mascot score Mr(Da) 201 171,5 2165,8 12,6 2111 28768,78 4,57 1101 157,7 1814 11,5 3116 28302,59 4,8 1504 9713,9 1981,3 0,2 11510 49670,82 4,78 pi
Kontrollhoz viszonyított különbségek Dau 2 1 1 1 2 1 1 Dau=Aoa-LTVSPWY-NH 2 2 Sejtváz DNS szintézis Sejtciklus szabályozás Anyagcsere Chaperon Jelátvitel
A GnRH receptor mint célfehérje 7TM receptor Számos tumortípuson overexpresszált (emlő-, prosztata-, ovárium és endometrium tumorok) Ligandum: GnRH (LH-RH) dekapeptid Formák: GnRH-I, GnRH-II, GnRH-III Különböző hatóanyag-gnrh-származékok alkalmazása irányított tumorterápiában Ulloa-Aguirre et al., Human Reproduction Update (10)2, 177-192 (2004)
Hogyan kötődnek az egyes származékok a receptorhoz? 1. GnRHR előállítása sejtmentes expressziós rendszerben 2. A receptor előállítása természetes közegében, membránban: nanodisc 3. Kötődésvizsgálatok az eredeti ligandummal, majd a különböző származékokkal http://www.bpc.uni-frankfurt.de/doetsch/wiki/index.php/cell-free_expression_of_membrane_proteins
Sejtmentes expresszió analitikai és preparatív mennyiségű fehérje előállításához Reakcióelegy Reakcióelegy Dialízis membrán Tápláló elegy Dialízis membrán Kevertetés Tápláló elegy
A sejtmentes expresszió különböző formái D-CF P-CF L-CF
GnRHR-nanodisc minta (L-CF mód) előállítása, célok + Üres nanodisc (Reakcióelegyben) Célfehérje (GnRHR) GnRHR-t tartalmazó nanodisc Funkcionális tesztek elvégzése a ligandumszármazékokkal (pl. kötődés meghatározása) Nincs kötődés Gyenge kötődés Erős kötődés Hatóanyag (Dau) GnRH-származékok
Kötődésvizsgálat: SPR (Biacore) SPR: Surface Plasmon Resonance - Molekulák közötti kapcsolat időbeli megfigyelése - Egyik interakciós partner immobilizálása a chip felszínére, a másik molekula az analitban, azaz a folyadék fázisban - Az interakciós partnerek kötődése változást okoz a chipen, azaz a felszínen, ami a kötődött molekulák mennyiségével arányos (megváltozott felszíni plazmon rezonancia) - Alkalmazott chip: SA chip - Felszínre immobilizált molekula: D-Lys 6 -GnRH-I- Biotin-Ahx - Analit: CF-expresszált GnRHR nanodiscben Beeső fény Szenzor chip felszíne Áramlási cella Visszaverődő fény SPR szöge Biacore sensor surface handbook
Eredmények (Biacore) RU 27580 Sensorgram 27560 27540 RR: 102.3 Response 27520 27500 Fc=2 27480 27460 27440 0 100 200 300 400 500 600 700 Response RU 120 100 80 60 40 20 0-20 Time ~0.3 nm; RR: 0.9 ~3 nm; RR: 5.1 s -200 300 800 1300 1800 Single cycle kinetics, Kd = 0,29 nm, Chi 2 : 0.637 ~30 nm; RR: 41.3 Time ~60 nm; RR: 87.8 ~150 nm; RR: 107.1 s (Affinity: Kd=61,8 nm)
Kötődésvizsgálat: MST MST: Microscale Thermophoresis - Biomolekuláris interakciót mér a molekula hidrátburkának megváltozása alapján - Közel natív körülmények: nem szükséges a ligandum immobilizálása, felhasználó által választott közeg (akár szérum, sejtliztátum vagy egyéb komplex minták) nanotemper.de
Microscale Thermophoresis - Infravörös lézer: pontos hőmérséklet gradiens-előállítás a kapillárisban - Molekulavándorlás hőmérsékleti gradiens mentén (mozagtó erő: szolvatációs entrópia, hidrátburok) - Szerkezetváltozás hidrátburok megváltozása termoforetikus mobilitás változása nanotemper.de
MST eredmények Fluoreszcens molekula: D-Lys 6 -CF-GnRH-I Kötődő molekula: GnRHR-nanodisc, GnRHR-amphipol 820 Thermophoreis hõmérsékleti ugrással (GnRHR-nanodisc) EC 50 =1.2±0.4 Fluoreszcencia 810 830 Thermophoresis hõmérsékleti ugrással (GnRHR-amphipol) 800 820 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000 Koncentráció (nm) Fluoreszcencia 810 EC 50 =46.6±7.9 800 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000 Koncentráció (nm)
ProteOn XPR36 Legújabb kihívások: rekombináns fehérjék kötődés vizsgálata 20
Erős kötődés vizsgálata (ProteOn XPR36)
Biolayer interferometria 8 csatorna 96 lyukú lemez > 180 µl térfogat 1 lemez pozíció Bioszenzor újrahasznositás FortéBio, PALL
Kötődés (nm) A mérés folyamata Octet Bioszenzorok Puffer Immobilizálni kívánt molekula Kölcsönható partner Alapvonal Alapvonal Immobilizálás Asszociáció Disszociáció Idő
Octet Red96 Eredmény: K D (M)<10-12 Erős kötés: hosszabb disszociációs idő, de bele kell férnie a teljes mérésnek 3 órába a párolgás miatt
Köszönetnyilvánítás - ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoport - Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University, Frankfurt - Biotechnológiai analitikai osztály, Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyrt.