A virb gének azonosítása Agrobacterium vitis törzsekben

1 A virb gének azonosítása Agrobacterium vitis törzsekben DIPLOMADOLGOZAT Készítette: HOSNYÁNSZKI DIÁNA Biológus MSc szakos hallgató Témavezetők: Dr. PUTNOKY PÉTER, egyetemi tanár Dr. GALAMBOS ANIKÓ, tanársegéd PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2014.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. Irodalmi áttekintés... 3 1.1. Az Agrobacterium fajok fertőzési folyamata... 3 1.1.1. A fertőzés okai és lépései... 3 1.1.2. Ti-plazmid felépítése... 5 1.1.3. A T-DNS felépítése és szerepe... 5 1.2. A vir gének szabályozása... 6 1.3. A Vir fehérjék szerepe a növényi sejt transzformációjában... 8 1.4. A virb géncsoport... 11 2. Célkitűzések... 14 3. Anyagok és Módszerek... 15 3.1. A munkánk során használt baktériumtörzsek és plazmidok... 15 3.2. A baktériumok növesztése, tárolása... 15 3.3. Bioinformatikai eszközök, primer tervezés... 16 3.4. Polimeráz láncreakció (PCR) és szekvencia meghatározás... 17 3.5. Restrikciós emésztések, T4 polimeráz kezelés, ligálási reakciók... 17 3.6. Transzformálás... 18 3.7. Plazmid DNS izolálás... 18 3.8. Baktériumok keresztezése... 19 3.9. A mutáns törzsek virulenciájának ellenőrzése... 19 4. Eredmények és megvitatásuk... 20 4.1. Primerek tervezése a virb régió felsokszorozására... 20 4.2. A. vitis AT1 törzs virb régiójának szekvencia értékelése... 21 4.3. Mutáció elkészítése a virb régióban... 22 4.4. Kalancoe virulencia teszt... 26 5. Összefoglalás... 28 6. Felhasznált irodalom... 29 7. Köszönetnyilvánítás... 34 8. Függelék... 35

3 1. Irodalmi áttekintés Az agrobaktériumok Gram-negatív, talajlakó baktériumok, melyek sokféle növényt képesek megbetegíteni. Elsősorban a kétszikű növényeket támadják, de néhány egyszikűt is meg tudnak fertőzni. Gazdanövényeik főleg csonthéjasok, málna, szőlő, dísznövények, répafélék. Az agrobaktériumok által okozott tumorok az egyes növények esetén máshol alakulnak ki [2]. Gyümölcsfáknál a gyökéren, málnánál és a szőlőnél pedig a fás vesszőkön (1. ábra). A fertőzött növények gyengébben fejlődnek, leveleik elszíneződnek, sárgászöld vagy vöröses színűek lesznek. A tumorképzés folyamata alatt a növény genetikai transzformáción esik át. Ma a különböző tumoros burjánzásokat okozó agrobaktériumokat az A. tumefaciens, az A. vitis és az A. rhizogenes fajok közé sorolják be. Mindegyik fajnak számos törzse ismert [13]. 1. ábra: Agrobacterium által okozott tumor [19]. 1.1. Az Agrobacterium fajok fertőzési folyamata 1.1.1. A fertőzés okai és lépései Természetes körülmények között a baktérium csak a sérült növényeket betegíti meg. A sérülést okozhatja természeti jelenség (például jégeső) vagy más élőlény (például rovarrágás). A növény sérülése esetén nagyobb mennyiségben szabadulnak fel fenolos vegyületek (például acetosziringon) és monoszacharid típusú vegyületek a sebzett növényi sejtekből [13]. Ezeket az anyagokat az agrobaktériumok érzékelik és odatapadnak a növényhez. Az agrobaktériumok rendelkeznek egy Tumor-indukáló plazmiddal (Ti-plazmid), amelyen van egy transzfer-dns (T-DNS) nevű régió. Erről a régióról készít a baktérium másolatokat, amiket különféle

4 virulencia (Vir) fehérjék segítségével juttat be a növényi sejtekbe. A virulencia fehérjéket a baktérium Ti-plazmidja kódolja (vir gének). Miután a T-DNS bejutott a növényi sejtek citoplazmájába, egy további folyamat révén bekerül a sejtmagba és ott beépül a kromoszómába (2. ábra) [21]. 2. ábra: A. tumefaciens általi genetikai transzformáció. A transzformáció folyamata 10 fontos lépésből áll: 1. Felismerés és kapcsolódás; 2. Szignál érzékelés, VirA/VirG rendszer; 3. A vir régió aktiválódása; 4. A T-DNS-ről másolatok készülnek; 5. Az éretlen T-DNS a gazdasejt citoplazmájába jut; 6. Létrejön a normál szerkezetű T-DNS; 7. A T-DNS bejut a sejtmagba; 8. Integrációs pont megkeresése; 9. A T- DNS-t kísérő fehérjék leválnak; 10. Beépülés a gazdasejt genomjába [32]. A fertőzés során az agrobaktériumok befolyásolják a növényi sejt anyagcseréjét. Egyes növekedési hormonok túltermelését illetve opinok bioszintézisét idézik elő a sejtben. A hormonok túltermelésével felborul a normál sejtosztódás, sejtburjánzás indul meg és a növény szárán vagy gyökerén tumorok alakulnak ki. Az opinvegyületek tápanyagforrásként szolgálnak az agrobaktériumok számára. A baktériumok a tumorszövetben szaporodnak el [10].

5 1.1.2. Ti-plazmid felépítése A Ti-plazmid fontosabb részei: a virulencia (vir) gének, a replikációs origó, az opin hasznosítási gének és a T-DNS régió (3. ábra). 3. ábra: A Ti-plazmid és a fertőzés szempontjából fontos régiói. A vir gének kódolják a bakteriális virulencia fehérjéket, amelyeket a baktérium a T-DNS kivágására használ, illetve a T-DNS bejuttatására a növényi sejtekbe. A vizsgálatok azt mutatták, hogy egy fehérjekomplex alkotja meg az origin-of-transzfer (orit) szekvenciát, amely katalizálja a szupercsavart plazmid DNS kicsavarását. Ez a fehérjekomplex, mely létrehozza az orit-t, a relaxoszóma. A relaxoszóma egyik alegysége felelős azért, hogy a relaxáz enzim által kitekert rész a plazmidon meg is maradjon. A relaxáz egy transzészteráz típusú enzim [10]. 1.1.3. A T-DNS felépítése és szerepe A Ti-plazmid része a transzfer-dns (T-DNS). A T-DNS fontosabb részei: a baloldali és jobboldali határoló szekvenciák, a hormonszintézis gének és az opinszintézis gének (3. ábra). A T-DNS-t mindkét oldalról egy körülbelül 25 bázispár hosszú határszakasz zárja le (LB: left border, RB: right border). A hormonszintézis gének az auxin és a citokinin termelésért

6 felelősek. Ha ezekből az anyagokból túl sok van, felborul a növényi sejtek normál osztódása és differenciációja, sejtburjánzás indul meg, azaz daganat alakul ki a növényen. Az opinszintézisért felelős gének kódolják a különböző, törzs-specifikus opinok bioszintézisét. Az opintermelés a transzformált növényi sejtekben létrehoz egy külön ökológiai nichet a fertőző Agrobacterium törzs számára, mert csak az általa hasznosítható opint termelteti a sejtekkel. Egy adott Agrobacterium törzs általában csak kétféle opin szintézisét indukálja a növényi sejtben. Az egyik nagyobb mennyiségben termelődik és katabolikus jellegű (pl. nopalin, agropin), míg a másik kisebb mennyiségben van jelen és konjugatív jellegű (pl. oktopin) [10]. A Vir fehérjék szerepéről részletesen az 1.3. fejezet számol be. 1.2. A vir gének szabályozása A szabályozó rendszer komponensei a vira és virg virulencia gének, illetve a róluk képződő VirA és VirG fehérjék. Az összes vir gén a VirA-VirG kétkomponensű szabályozó rendszer révén indukálódik, növényi szignálok hatására (4. ábra). Ilyen növényi szignálok lehetnek az acetosziringon vagy más fenolos vegyületek. A szabályozó gének, a vira és a virg konstitutív módon fejeződnek ki, de növényi induktorok jelenlétében ezen gének kifejeződése fokozódik. A VirA fehérje az a molekula, amely érzékeli a kedvező körülményeket a T-DNS átadásához, és elindítja a transzformációs folyamatot. A VirA aktiválja a transzkripciós aktivátor VirG fehérjét, tehát a vira gén kódolja az érzékelő fehérjét, míg a VirG fehérje közvetíti a választ a vir gének (virbcdefgh) felé [15,17]. 4. ábra: A VirA-VirG aktiválási folyamat. A VirA egy integráns membránfehérje, mely autofoszforilációs aktivitással rendelkezik. A VirA fehérje részei: a periplazmikus "érzékelő" domén, a linker régió, a kináz régió, a szignált

7 érzékelő terület és a transzmembrán részek (5. ábra). A VirA fehérjének N-terminális része a periplazma felé áll, a C-terminális része pedig a citoplazma felé. A VirA a transzmembrán érzékelő hisztidin kinázok csoportjába tartozik. A periplazmikus "érzékelő" része ismeri fel és köti meg a növényi szignálmolekulákat. A linker régió vagy domén felelős az acetosziringon és más fenolos vegyületek specifikus érzékeléséért [18,23]. 5. ábra: A VirA fehérje funkcionálisan fontos doménjei. Transzmembrán, periplazmikus, összekötő (zöld), kináz (piros) és vevő (sárga) domének. A VirA fehérje C-terminális végén egy úgynevezett vevő domén található. Ezt a domént már korábban is leírták, mint gátló elemet, mert csökkenti a vir gének expresszióját. Viszont más kísérletek azt mutatták, hogy ez a vevő domén egy aktiváló tényező is lehet, mert képes kiváltani a vir gének transzkripcióját monoszacharidok hatására, a szükséges fenolos vegyületek hiányában. Illetve azt is kimutatták, hogy a VirA vevő doménje szükséges a vir gének hatékony expressziójához. Azt is megállapították, hogy ez a vevő domén képes kapcsolatba lépni a VirG fehérje DNS-kötő régiójával. A VirA vevő doménje általi vir gén expresszió aktiválásához magas sejtbeli VirG fehérje koncentráció szükséges. Ez arra utal, hogy ha a virg konstitutív módon fejeződik ki, bőséges VirG fehérje érhető el, ami megkönnyíti a VirA vevő doménje és a VirG fehérje közötti interakciót, illetve mutatja, hogy a VirA vevő doménje is szükséges a vir gén expresszióhoz [1,5]. A VirG egy szekvenciaspecifikus DNS-kötő fehérje, specifikusan felismer és megköt egy dodecamer DNS szekvenciát, amely jelen van minden vir operon előtt és amit úgy nevezünk,

8 hogy vir box (6. ábra). A vir boxot a különböző vir promóterek szekvenciájának összehasonlításával találták meg a transzkripciós starthelytől (+1) nagyjából 70 bázispárral feljebb (-70). Funkcióját genetikai kísérletekben, mutációk létrehozásával és hatásuk elemzésével bizonyították. A vir box deléciója megszünteti az utána következő vir operon indukálhatóságát. 6. ábra: A vir box konszenzus szekvenciája a virb gének előtt. Az illesztésben felhasznált szekvenciák: AvS4 A. vitis S4; Ar2659 A. rhizogenes 2659; AtAB2 A. tumefaciens AB2; AtA6 - A. tumefaciens A6; AtBo542 - A. tumefaciens Bo542; AtC58 - A. tumefaciens C58; AtA4 - A. tumefaciens A4. A csillagok a konzerválódott bázisokat jelölik. Ahhoz, hogy a VirG fehérje működni tudjon, foszforilálni kell. Ezt a folyamatot a foszforilált állapotban lévő VirA (foszfo-vira) fehérje végzi (4. ábra), mely közvetlenül átadja a foszfát csoportot a VirG fehérjének. A VirG csak VirA jelenlétében tud foszforilálódni [14]. Hiába van jelen az ATP, ha a VirA fehérje hiányzik, nem történik semmi. Illetőleg azt is kimutatták, hogy ha ATP nincs, de foszfo-vira van, akkor a VirA a saját foszfát csoportját adja át. A folyamat nagyon gyors, másodpercek alatt lezajlik. A VirG fehérje foszforilációja elengedhetetlen a megfelelő működéséhez. A foszforilált VirG (foszfo-virg) aktiválja legalább 14 vir operon kifejeződését, amelyek összesen kb. 30 gént tartalmaznak [18]. 1.3. A Vir fehérjék szerepe a növényi sejt transzformációjában A vir gének kódolják a bakteriális virulencia fehérjéket, amelyek a T-DNS kivágását, illetve a T-DNS növényi sejtekbe juttatását végzik. A már említett T-DNS egyszálú DNS-fehérje komplexszé (éretlen T-komplex vagy T-szál) alakul a VirD1 és VirD2 fehérjék kombinált működése eredményeként. Ezek a fehérjék egy helyspecifikus nukleáz-aktivitással rendelkeznek, így képesek kivágni a T-DNS-t a plazmidból, majd a VirD2 kovalensen megköti az egyszálú (ss) T-DNS-molekulát. A T-komplex kialakításában több más Vir fehérje is részt vesz. Megint más Vir fehérjék egy speciális konjugációs csatornát, a IV-es típusú

9 szekréciós rendszert (T4SS) alakítják ki (7. ábra). Ennek segítségével jut át a T-DNS a növénybe, majd szintén Vir fehérjéknek köszönhetően, és néhány gazdaszervezet specifikus fehérje segítségével épül be a növényi genomba [20,21]. 7. ábra: Az A. tumefaciens VirB/D4 T4SS rendszere [24]. A baktériumok a IV-es típusú szekréciós rendszert (T4SS) arra használják, hogy szállítsák a T-DNS-t, illetve a szükséges fehérjéket a donor sejtektől a célsejtekbe. A T4SS egy strukturálisan komplex rendszer, mely számos membránfehérjéből áll össze és reagál a környezeti szignálokra. A T-pílus egy konjugációs pílus, melynek segítségével a T-DNS át tud jutni a növényi sejtbe. A pílus növesztése a sejt felszínén valószínűleg arra szolgál, hogy közelebb hozza egymáshoz a sejteket, hogy kialakuljon a párosodási csomópont. Ezt két módon lehet elérni. Az egyik mód, hogy a VirB/D4 T4SS által kialakított konjugatív pílust, a sejt a pílus hosszabbító-behúzó mozgatására használja. A T-pílus hozzákapcsolódik a recipiens sejthez, majd visszahúzódik, a sejtet húzza magával. Ez a folyamat valószínűleg energiaigényes. Miután a sejtmembránok között kialakult a közvetlen kapcsolat, létrejön a stabil párosodási csomópont, amely kiváltja a szekréciós csatorna megnyílását és megindul a szubsztrátok áramlása a külső membránon keresztül. A másik mód az lehet, hogy a konjugatív pílusokat plazmidok kódolják. Ebben az esetben a pílus nem húzódik vissza, hanem

10 csoportosulás (sloughing) jön létre a pílusok összetapadása révén. A csoportosulás lehet annyira szoros, hogy a sejtek közötti pílusokat nehéz felismerni még mikroszkóppal is. Nagymennyiségű adhezív (ragadós) filamentum halmozódik fel a csoporton belül, amely valószínűleg serkenti a sejtaggregátumok kialakulását és ezzel a párosodási csomópont létrejöttét. Ez a formáció csak szilárd felületen jön létre. Ha a párosodási csomópont kialakult, megtörténik a T-szál átjutása a növényi sejt citoplazmájába. A kutatók úgy gondolják, hogy a gazdasejt citoplazmájában az éretlen T-komplex egy érési folyamaton megy keresztül, melynek révén teljes hosszúságú egyszálú (ss) T-DNS-molekula jön létre rajta számos VirE2 fehérjével. A VirE2 molekulák biztosítják a T-DNS szerkezetét és védik, amíg el nem jut a gazdasejt sejtmagjáig [11]. Általában elmondható, hogy a vir gének elrendeződése más és más a különböző típusú Tiplazmidokon, de az egy promóterről átíródó géncsoportok egyben maradnak [16]. Az virb és vird operonok kódolják a VirB/D4 T4SS konjugációs pílust (7. ábra). A virb operon 11 gént kódol, virb1-től virb11-ig. A virb gének termékei az úgy nevezett párosodási pár formációs (mating pair formation protein=mpf) fehérjék, melyek létrehozzák a T-pílust és azt a struktúrát, amely a szubsztrát transzferhez szükséges. A vird operon 5 gént kódol, vird1-től vird5-ig. A vird1 és vird2 azokat a fehérjéket kódolják, melyek a T-DNS sejtbe való átjutásáért felelnek, ezek az úgynevezett DNS-transzfer és a replikáció (Dtr) fehérjék. A vird3 és a vird5 olyan fehérjéket kódolnak, melyek nem esszenciálisak a transzfer folyamatának szempontjából. A vird4 egy kapcsoló fehérjét (coupling protein=cp) kódol. A VirD4 CP nem a T-DNS kivágásában vagy biogenezisében vesz részt, hanem együttműködik a VirB fehérjékkel a konjugációs pílus kialakításában [21]. Nagyon valószínű, hogy a T- komplexet a fertőzött növényi sejtek a saját transzport rendszerükön keresztül szállítják a sejtmaghoz. Az érett T-DNS nagy mérete azt sugallja, hogy a nukleáris import egy aktív mechanizmus és nagy valószínűséggel a fertőzött növényi sejtek saját folyamatai is részt vesznek benne. Mind a T-DNS mind a VirD1 és VirE2 fehérjék kapcsolatba lépnek a fertőzött növényi sejtek fehérjéivel, hogy megtörténjen a nukleáris import. A VirD2-re és a VirE2-re is szükség van az egyszálú DNS sejtmagba való bejutásához. Mindkét fehérje rendelkezik nukleáris lokalizációs szekvenciával (NLS), hogy megkönnyítsék a T-DNS bejutását a sejtmagba [4]. A sejtmagon belül a T-DNS-nek az integráció helyéhez kell jutnia és el kell távolítania a kísérő fehérjéket még az integráció előtt. A genetikai transzformáció összes lépése közül, a T- DNS integráció függ leginkább a növényi sejt folyamataitól. Több DNS repair és csomagoló fehérje elengedhetetlen a T-DNS integrációhoz a növényi sejtekben, és szerepük van a

11 kromoszómák kettős törésében, amik odavonzzák a T-DNS-t az integráció helyéhez. Bár a T- DNS integráció pontos molekuláris mechanizmusa még mindig vita tárgyát képezi, van egy feltételezés, miszerint a baktérium a növényi sejt DNS-repair mechanizmusára támaszkodik, amely képes az egyszálú T-DNS-t kétszálúvá alakítani és így egy integrációs intermediert létrehozni. A növény a T-DNS-t saját DNS-töredékként ismeri fel és beépíti a genomjába. 1.4. A virb géncsoport A virb gének a Ti-plazmidon találhatók. Az agrobaktériumokban a virb promóter átíródását növényi szignálok szabályozzák. Számos szorosan egymás mellé, vagy egymást átfedő virb gén, pl.: virb1/virb2/virb3/virb4 és virb7/virb8/virb9/virb10 valószínűleg transzlációs szinten kapcsolt [7]. Több VirB fehérje képes egymást kölcsönösen stabilizálni. Ezek a kontrollmechanizmusok valószínűleg azért alakultak ki, hogy maximalizálják a géntranszfer gyakoriságát és minimalizálják a baktérium által felhasznált energiát. A virb gének termékei részt vesznek a T-DNS szállításában a baktériumtól a növényi sejt belsejéig. A VirB1 fehérje a virb operon első génterméke, ami csak részlegesen kapcsolódik a VirB/D4 T4SS rendszerhez. Ez azt jelenti, hogy VirB1 nem feltétlenül szükséges a DNS átviteléhez [20]. A virb1 gén eltávolítása csupán a virulencia csökkenésével jár 3%-kal, míg más virb gének deléciója a DNS átvitel teljes megszűnését eredményezi. Mindazonáltal ezek az adatok arra utalnak, hogy a VirB1 jelentős szerepet játszik az Agrobacterium által közvetített DNStranszferben. Ugyanis ez a fehérje biztosítja a peptidoglükán sejtfal lokális lízisét, lebontását, hogy megteremtse a szükséges helyet a VirB/D4 T4SS komplexnek. A VirB1 fehérje egy N- terminális, lítikus, transzglikoziláz aktivitással rendelkező fehérje [17]. A VirB1 és VirB8, valamint VirB9 és VirB10 fehérjék közötti kölcsönhatások kijelölhetik a VirB1 aktivitásának helyét a VirB/D4 T4SS összeszerelésekor, ami arra utal, hogy a VirB1 fehérje periplazmás funkcióval is rendelkezik [13]. A VirB1 feladata azért olyan jelentős, mert a virulencia proteinek nagyobbak, mint 25-50 kda, így nem tudnak áthatolni a természetes körülmények között meglévő intakt peptidoglükán-mátrix csatornáin, mert a mátrix megakadályozná a VirB/D4 T4SS kialakulását, amely legalább 230 kda nagyságú fehérjéket tartalmaz. A VirB2 fehérje a T-pílus felépítésében részt vevő pilin alegység [10]. A pilin alegység előalakja a propilin. A propilin vagy bejut a belső membránba vagy átjut rajta az általános szekretoros út (General Secretory Pathway, GSP) révén. A VirB/D4 T4SS konjugációs rendszernél egy pilin molekula épül be a belső membránba. Az integrálódott pilinről azt feltételezik, hogy a pilin monomerek gyűjtőhelye, melyekből polimerizáció révén alakul ki a

12 T-pílus váza [12]. Kísérletesen igazolták, hogy a VirB2 pilin elengedhetetlen a szubsztrát transzferhez. Több tanulmány is azt írja, hogy a pilin monomerek egy része más módon is összeállhat úgy, mint egy szekréciós csatorna szerkezeti alegysége a periplazmában. Így T- pílus nélkül a VirB/D4 T4SS be tudja juttatni a DNS-t a növényi sejtbe, de pilin fehérje nélkül nem [9]. A VirB3 és VirB5 fehérjék a szubsztrát transzferhez szükségesek a növényi sejtből a baktériumsejtbe. Szerepet játszanak a T-pílus biogenezisében [25]. Mindkét fehérjét a belső membrán exportálja, hogy kialakítsák a periplazma és a külső membrán megfelelő rendezettségét. A VirB5-ről bebizonyították, hogy kölcsönhatásba kerül a sejt-asszociált VirB2-vel és a T-pílus extracelluláris részével. Arról viszont még nem bizonyosodtak meg, hogy a VirB3 is kölcsönhatásba lépne más VirB fehérjékkel. A VirB6 termelődése fokozza a VirB5 és VirB3 fehérjék steady-state állapotát, tehát ezen fehérjék között egyfajta stabilizáló kölcsönhatás alakult ki [7]. A VirB4 fehérje feltehetően két membránon átívelő doménnel rendelkezik, az egyik közel van az N-terminális véghez, a másik a centrumban helyezkedik el [27]. NTP-kötő hely is található rajta, amiről úgy gondolják, hogy a T4SS belépési pórusát képezi a növényi sejten. A VirB4, a VirB7 és VirB11 fehérjékkel együtt alkotja a legkonzervatívabb T4SS alkotórészeket a legkülönbözőbb patogén agrobaktériumokban. A VirB6 egy erősen hidrofób fehérje öt, hat vagy kilenc lehetséges transzmembrán egységgel. A transzport csatornák alkotó része. Ha a VirB6 fehérjét elvonták, akkor a többi VirB fehérje szintje lecsökkent, amely összhangban van a T4SS szerkezeti integritásával. Továbbá kimutatták detergensekkel készített sejtextraktumokból, hogy a VirB6 más VirB fehérjékkel képes komplexet létrehozni. Ezek a komplexek stabil szupramolekuláris szerkezettel rendelkeznek. A fehérje-fehérje kölcsönhatásokra vonatkozó vizsgálatok arra is szolgáltattak bizonyítékot, hogy a VirB6, a VirB7 és a VirB9 fehérjékkel is kölcsönhatásba kerül. Ezek a kölcsönhatások befolyásolják a diszulfid-hidakkal rendelkező, térhálós szerkezetű VirB7 homodimer kialakulását, valamint a VirB9 multimerek létrejöttét [7]. A VirB7 fehérje egy lipoprotein. A VirB9 kapcsolja hozzá a lipoproteinhez a diszulfid térhálós polimert. A VirB7 képezhet diszulfid térhálós homodimert annak érdekében, hogy a külső és belső membránt valamint a hozzájuk kapcsolódó fehérjéket kiszabadítsa az extracelluláris térből. A pílus-termelő sejtekben a VirB7 homodimer hozzákapcsolódik a T- pílus kezdeti szakaszához és lehetővé teszi, hogy a pílus kijusson a baktériumsejt felszínére. A VirB8 és a VirB10 bitopikus, belső membránfehérjék, N-terminális és proximális transzmembrán egységekkel, és hosszú C-terminális, periplazmikus doménekkel. A VirB8 és

13 VirB10 fehérjék kölcsönhatásban vannak egymással és a VirB9 fehérjével. Mutációk révén befolyásolták ezeket a kölcsönhatásokat, melyek eredményeként megszűnt a virulencia, ami megerősítette, hogy VirB8-VirB9-VirB10 komplex képződése elengedhetetlen a teljes transzformációs folyamat működéséhez. A különböző A. tumefaciens mutánsokkal végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a VirB8 fehérje termelődése szükséges a VirB9 és VirB10 fehérjék megfelelő formációjának kialakulásához [7].

14 2. Célkitűzések Munkánk hosszabb távú célja a virb gének megismerése és esetleges speciális szabályozásuk vizsgálata, különböző A. vitis törzsekben. Ennek megfelelően a következőket terveztük: 1. Nukleotidszekvencia adatbázisokból kigyűjtjük az ismert virb gének szekvenciáit. Majd a szekvenciák illesztése után olyan konzerválódott régiókat keresünk, melyek alkalmasak PCR primerek tervezésére. 2. A tervezett primerek segítségével a rendelkezésünkre álló A. vitis baktériumtörzsekből megpróbáljuk izolálni a virb régiót és szekvenciáját meghatározni. 3. virb mutáns Agrobacteriumot készítünk egy kanamicin rezisztencia kazetta beépítésével, hogy bizonyítsuk, valóban funkcionális virb géneket azonosítottunk. Ahhoz, hogy az A. vitis törzsek virb génjeinek szabályozását összehasonlítsuk az eddig ismert eredményekkel, ismernünk kell a promóter régiók szekvenciáját. A kanamicin rezisztencia gén beépítése lehetővé teszi számunkra, hogy a mutáns baktériumból később visszaizoláljuk a rezisztenciagén közelében lévő promóter régiót is.

15 3. Anyagok és Módszerek 3.1. A munkánk során használt baktériumtörzsek és plazmidok Az alkalmazott törzsek és plazmidok jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: A munkánk során használt baktériumtörzsek és plazmidok TÖRZS JELLEMZŐK REFERENCIA E. coli törzsek: XL1-blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe4 rela1 lacz M15 Tc R [5] PP4304 E. coli pcu101 Cm R - ppag160 konjugációhoz helper törzs Papp Péter A. tumefaciens törzsek: C58 vad típus, nopalin Ti-plazmid [7] A. vitis törzsek: PP4664 AT1 Rif R Putnoky Péter AB3 vad típus, oktopin Ti-plazmid [30] AB4 vad típus, nopalin Ti-plazmid [30] Sz1 vad típus, vitopin Ti-plazmid [30] Plazmidok: pbs pbluescript II SK (+) klónozó vektor Amp R Strategene ppag160 szűk gazdaspecifitású konjugatív vektor, Spc R /Str R Papp Péter PP4491 pbs HincII::Neo R Putnoky Péter PP4692 pbs::virb-pcr (AT1) Putnoky Péter PP4701 pbs SphI:: Km R gén ez a munka PP4702 pbs SphI:: Km R gén ez a munka 3.2. A baktériumok növesztése, tárolása Az Agrobacterium törzseket 28 C-on TA [23] táptalajon, az E. coli törzseket pedig 37 C-on LB [28] tápközegben növesztettük. A táptalajok megfelelő mennyiségű antibiotikumot tartalmaztak, amit a 2. táblázatban foglaltunk össze. A baktériumtörzseket 15%-os glicerines TA-ban -20 C-on lefagyasztva tároljuk.

16 2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk (µg/ml) Antibiotikum Rövidítés E.coli Agrobacterium ampicillin Amp 100 - rifampicin Rif - 30 kanamicin Km 200 - spectinomicin Spc 100-3.3. Bioinformatikai eszközök, primer tervezés A már meglévő Agrobacterium virb szekvenciák kigyűjtéséhez először egy kulcsszavas keresést végeztünk az NCBI honlapján, szűkítve csak a nukleotid szekvenciákra (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Az alkalmazott kulcsszavak a következők voltak: Agrobacterium, virb gene, A. tumefaciens, A. rhizogenes, virb sequences. Az általunk kiválsztott szekvenciák hasonlóságát az EMBL honlapján elérhető ClustalW program segítségével vizsgáltuk meg (http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/). Ehhez a kiválasztott szekvenciákat FASTA formátumban egymás alá írtuk és beillesztettük az adatbeviteli ablakba. A program alapbeállításain nem változtattunk. A többszörös illesztés eredménye a Függelékben található. Az elemzés után a szekvenciák konzerválódottabb szakaszaira terveztünk primereket (3. táblázat és Függelék). A munkánk során a Sequence Manipulation Suite oldalán található PCR Primer Stats nevű programot használtuk (http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html). 3. táblázat: A tervezett primerek jellemzői NÉV SZEKVENCIA Tm ( C) PCR termék * virb-31 catgacaataccaccggcgaaac 67,16 - virb-31r gaagcccggccgaacatcca 69,97 832 bp virb-32 ACAATACCACCGGCGAAAC 63,51 - virb-32r GCCCGGCCGAACATCCA 67,61 829 bp virb-33r cattacgccattcctctccctcg 67,63 1248 bp virb-34r GCCATTCCTCTCCCTCG 61,65 1242 bp virb-11 CAATACGACCGGTGAAACTCTTCa 65,93 - virb-11r TGACGGACGAGATGGGCATATa 65,67 1496bp (*) A PCR termék nagysága a virb-33r és virb-34r esetén a virb-31 primerrel párban értendő

17 3.4. Polimeráz láncreakció (PCR) és szekvencia meghatározás Kísérleteinkben az 1. táblázatban feltüntetett A. vitis és A. tumefaciens C58 törzsekből kívántuk a tervezett primerek által behatárolt virb régiót felsokszorozni és szekvenciájukat meghatározni. A primerek paramétereinek megfelelően a PCR reakciókat 2 perc 94 C elődenaturáció után a következőek szerint kívánjuk végrehajtani: [30sec. 94 C / 30sec. 56 C / 40sec. 72 C] x33 ciklus. A PCR fragment vektorba klónozását Kuczmog Anett végezte. Ezután ezt a fragmentet mindkét irányból megszekvenáltattuk, majd a CAP3 program révén összeillesztettük őket (http://doua.prabi.fr/software/cap3), így megkaptuk a konszenzus szekvenciát. Ezt a szekvenciát különböző bioinformatikai módszerek segítségével ellenőriztük, hogy valóban virb szekvenciát tartalmaz-e. Ehhez először az NCBI honlapján elérhető BLASTN programot használtuk (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi), mellyel igazoltuk, hogy nukleotid szinten valóban virb szekvencia. Majd a BLASTX program segítségével (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi?program=blastx&page_type=blastsearch&bl BLA_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastn) bizonyítottuk, hogy valóban VirB fehérjéket kódol. Végül az ORF Finder révén megállapítottuk, mely virb géneket tartalmazza (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). 3.5. Restrikciós emésztések, T4 polimeráz kezelés, ligálási reakciók Az izolált és tisztított DNS minták emésztését a FERMENTAS cég termékeit használva a megadott protokollok szerint hajtottuk végre. Az emésztéseket 15µl-es térfogatban végeztük, melyhez 1µl DNS mintát használtunk fel. Az emésztés után ragadós végek keletkeztek, ezért T4 polimeráz kezelést végeztünk. A reakcióhoz a fragmentet tartalmazó DNS oldat, 2mM-os dntp-k, puffer és desztillált víz szükséges, 10µl térfogatban dolgoztunk. A T4 polimeráz enzim hozzáadása után 10 perc 22 C-os, majd 15 perc 68 C-os inkubálás következett. Ezután a T4 polimeráz kezelt mintát összeligáltuk a kanamicin rezisztencia fragmentet tartalmazó oldattal. A ligálási reakciókat általában 20µl térfogatban végeztük, 5x ligáz puffer segítségével.

18 3.6. Transzformálás Az inszertet tartalmazó ppag vektort betranszformáltuk E.coli baktériumba. A transzformációhoz szükséges kompetens sejt elkészítéséhez E.coli XL1-Blue törzset használtunk (1. táblázat). Egy transzformáláshoz általában 200µl kompetens sejtet és 5µl transzformálni kívánt DNS-t használtunk fel. A kompetens sejteket -80 C-os hőmérsékleten tároljuk. Miután a hűtőből a sejteket kivesszük, 15 percig jégen állni hagyjuk. Közben a transzformálni kívánt DNS-t bemérjük az előkészített, hűtött csőbe, majd hozzámérjük a 200µl kompetens sejtet. Ismét jégen állni hagyjuk 20 percig. Majd egy hősokk következik, 3 percig 37 C-ra tesszük. Ezután 800µl LB tápoldatot adunk hozzá és 60 percig 37 C-on inkubáljuk a sejteket. Az inkubálás után a csöveket 1 percig centrifugáljuk, leöntjük a felülúszót, 100µl friss LB tápoldatot adunk hozzá, melyben ismét feloldjuk a sejteket, majd táptalajra szélesztjük. A táptalaj spectinomicin és kanamicin antibiotikumokat tartalmazott. 3.7. Plazmid DNS izolálás A ppag vektort tartalmazó E.coli törzset 3ml LB tápfolyadékban növesztettük, rázatva, 37 Con, egy éjszakán keresztül. A tápfolyadék spectinomicin és kanamicin antibiotikumokat tartalmazott. Eppendorf csövekben 1,5ml kultúrából a sejteket centrifugálás révén leülepítettük, a felülúszót leöntöttük, majd 100µl TEG oldatban (25mM TrisHCl, 10mM EDTA, 50mM glükóz ph 8,0) vettük fel. Ezután a sejteket NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) segítségével tártuk fel. Utána inkubáció következett 5 percig 0 C-on, majd 160µl 3M Naacetát oldatot adtunk hozzá. Ismét inkubáltuk a mintákat 5 percig 0 C-on, majd 5 percig centrifugáltuk 12000 rpm fordulatszámon és a felülúszót (kb. 400µl) új csövekbe öntöttük át, melyekbe már előre bemértük a 320µl izopropanolt. Az oldatot jól összekevertük a csöveket fel-le forgatva, majd 5 percig jégen állni hagytuk őket. Ismét 5 percig centrifugáltuk a mintákat, majd leöntöttük a felülúszót. Ezután alkoholos kicsapással tisztítottuk tovább a plazmid DNS-t. Először 400µl 70%-os etanolt adtunk a mintákhoz, majd 5 perc centrifugálás következett, leöntöttük az alkoholt és pár percig szárítottuk. Ezt követően 100µl Tris-acetát pufferben (50mM Tris, 100 mm Na-acetát, ph 8,0) oldottuk fel a DNS-t. Ezután 200µl abszolút etanol segítségével ismét kicsaptuk a DNS-t, 5 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd 5 percig centrifugáltuk, leöntöttük az alkoholt és pár percig szárítottuk. Végül a plazmid DNS-t 50µl RNáz enzimet tartalmazó desztillált vízben (100µg/ml) oldottuk fel. A restrikciós emésztésekhez 1µl (500-600 ng/µl koncentrációjú) preparátumot használtunk fel.

19 3.8. Baktériumok keresztezése A donor, a helper és a recipiens baktérium törzseket TA táptalajon növesztettük, a megfelelő antibiotikumok jelenlétében, egy- illetve két napon keresztül. A felnőtt baktériumokból 0,5ml fiziológiás sóoldatban szuszpenziót készítettünk, TA lemezen azonos arányban összecseppentve 28 C-on egy napig inkubáltuk őket. Az így felnőtt baktériumokból ismételten szuszpenziót készítettünk, majd az antibiotikumokat tartalmazó lemezekre szélesztettük őket, a megfelelő hígításban. Két napon keresztül növesztettük őket. 3.9. A mutáns törzsek virulenciájának ellenőrzése A vad típusú és a mutáns Agrobacterium törzseket 2 napig, 28 C-on, a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó TA táptalajon növesztettük. Ezután 0,9%-os NaCl oldatban szuszpenziót készítettünk, a sejtszámot OD 590 =1,5 denzitásra állítottuk be. Lándzsatűt mártottunk a szuszpenzióba, majd két helyen megszúrtuk a Kalancoe növények szárait. A fertőzés után a növényeket növénynevelő szobában 20 C-on, 14 órás megvilágítás mellett neveltük. A tumorképződést 6 hét elteltével értékeltük ki.

20 4. Eredmények és megvitatásuk 4.1. Primerek tervezése a virb régió felsokszorozására Mivel olyan A. vitis törzsekből szeretnénk felsokszorozni a virb régiót, amelyeknél ez a szekvencia még nem ismert, ezért a primereket más agrobaktériumok már ismert szekvenciái alapján terveztük meg. Ehhez először nukleotidszekvenciákat gyűjtöttünk az NCBI honlapján, a Genbank adatbázisából. Számos virb szekvenciát tartalmazó rekordot találtunk, melyekből kiválasztottuk a nekünk megfelelőket. A szekvenciák hasonlóságának vizsgálatára az EMBL honlapján elérhető ClustalW programot használtuk (a sokszoros illesztés eredménye a Függelékben található). Az illesztésből látható, hogy az egyes virb szekvenciák nagyon különböznek egymástól, ezért nehéz volt primer tervezésre alkalmas régiót találni (8. ábra). A promóter régió nagymértékben eltér az egyes törzsekben, így ez a rész nem alkalmas primertervezésre. Megvizsgáltuk a vir box szekvenciáját is, de csak maga a vir box régiója konzerválódott, az előtte és utána lévő szakaszokban nagy az eltérés az egyes szekvenciák között, ezért nem volt célszerű arra a területre primert tervezni. Az illesztésből az is látszik, hogy a virb1 szekvenciák kevésbé konzerválódottak, míg a virb2 gén második felétől gyakoribbak a primer tervezésre is alkalmas konzerválódottabb szakaszok egészen a virb3 gén végéig (Függelék). A virb4 génnél ismételten azt láthatjuk, hogy kevés konzerválódott szakasz van, és azok is csak néhány bázispár hosszúságúak. 8. ábra: Egy primer tervezésre alkalmas, konzerválódott virb régió. At= A. tumefaciens, Av= A. vitis, Ar= A. rhizogenes. A csillagok a konzerválódott bázisokat jelölik. A szürke területek a primer tervezésre alkalmas konzerválódott részeket jelzik. A sárga színnel kiemelt bázisok a konzerválódott szekvenciától való eltéréseket jelzik a primer helyeken. Az elemzés után a szekvenciák konzerválódottabb szakaszaira terveztünk primereket és azt feltételeztük, hogy a távolabbi rokonságban lévő A. vitis törzsekben is működni fognak. Több primer párt is terveztünk (3.3. fejezet, 3. tálázat), mivel az erősebben konzerválódott régióknál

21 is vannak báziseltérések. Több primert és ezeknél több változatot is terveztünk, hogy ezek kombinálásával, nagyobb eséllyel tudjuk a kísérleteket sikeresen elvégezni. Az egyes Agrobacterium törzseknél több primerpár kombinációval és különböző PCR programokkal próbálkoztunk (3.3. fejezet, 3. táblázat). Egy sikeres PCR eredményét mutatja a 9. ábra. Látható, hogy az alkalmazott primer mindegyik A. vitis törzsnél terméket eredményezett, csak az A. tumefaciens C58 törzs esetében kaptunk gyengébb reakciót. Ahogy vártuk, a fragment mérete körülbelül 1500bp. Az A. vitis AT1 törzs virb régiójának vektorba klónozását Kuczmog Anett végezte. 9. ábra: Egy PCR eredménye a virb-11 és virb-11r primerekkel. L= Ladder (kontroll), 1: A. tumefaciens C58, 2: A. vitis AB3, 3: A. vitis Sz1, 4: A. vitis AB4, 5: A. vitis AT1. 4.2. A. vitis AT1 törzs virb régiójának szekvencia értékelése A klónozott PCR terméket megszekvenáltattuk (10. ábra), majd több program segítségével is ellenőriztük, hogy a szekvencia valóban a virb régiót tartalmazza-e. Először BLASTN és BLASTX elemzésekkel bizonyítottuk nukleotid és fehérje szinten is, hogy a szekvencia ténylegesen virb géneket tartalmaz, és különböző VirB fehérjéket kódol. Majd az ORF Finder program révén megállapítottuk, hogy pontosan melyek ezek a gének. Az elvárásainkkal megegyezően, 4 gént találtunk: a virb1 gén 3 végét, a teljes virb2 és virb3 gént, valamint a virb4 gén 5 részét.

22 >AT1 virb contig aagcttgatacgaccggtgaaactcttcactggactgatcaggcggatgccaggcgaagtgtggaagatcgtctc GTAGCAGGGCATTCAATCGATGTCGGCCTTATGCAGGTGAACTCGAGCAATTTCGCGATGCTGGGTTTGACGTCT AGCAATGCATTTGAGCCCTGTGCGTCTCTATCAGCCGCGGCGCGACTGCTTGTACGGCACTTTACGGGCGGGAAC ACGGCGCAAGAAGAACAGCTCGCGCTTCGGCGAGCAATCTCGGCGTACAATACCGGCAATCTCAAGCGCGGCTTC ACGAACGGATATGTGCGAAGGGTCGAGTTGGCGGCTCAGCAACTCGTGCCTCCACTAGCTCAGTCGGCGAAAAAT CAAGATCATGATGAGCAGAGCCCAGAAGAACCGTGGAATGTCTGGCGTTCTTACGACAACACCCGCTCAGCAGGT GGGGCAGGCGGTTCATCTGGTTCGCCAGAGCCGCAGGAGCCGAATGAACACAGAACTCCGGAAGACGATCAAGTT TTTTGAattgagtaatggagatgtaccctcATGGCATGCTTTGAAAAATACCGCGTGCGTTCGACGTTGCGTTGC CTCAGGGAGTTGGTTGTGCGCCTGGCGGTTACTTACCTGCCGAGCCTCAGCGGCGCGATCGGCTGGAGTTTGCTT TTCTCTGAGCCAGCCGCTGCACAAGCGGCGGGCGGAACCcGATCCCGCCACCATGGTCAACAATATCTGCACCTT TATTCTTGGTCCGTTTGGTCAATCGCTCGCAGTTCTTGGCATCGTAGCCATCGGCATATCATGGATGTTCGGTCG AGCTTCTCTTGGGTCTCGTAGCTGGGCGTCGTCGGCGGGATCGTTATTATGTTTGGAGCCAGCTTTCTCGGCCAA ACGCTCACCGGGGGCGGCGGATGAAGGACCGTCTCGAAGAAGCCACACTCTATTTAGCGGCGACGAGACCTGCAT TGTTCTTTGGCGTGCCGCTTACGCTGGCTGGATTGTTCATGATGTTGGCTGGCTTTCTTATCGTTATTGTCCAGA ATCCGCTCTACGAAATCGTTCTCTTGCCGCTGTGGCTTGGAGCCCGGCTCGTCGTAGAGCGCGACTACAACGCCG CAAGTGTGGTCTTTCTGTTTCTCCAGACGGCGGGGAGAAGTGTTGACAGCCATACGTGGGGCGGGGCGAGTGTCA GTCCCAACCCAATCAGAGTGCCGCCGCGAGGAAGAGGAATGGCGTGATGTTCGGAACAAATGGAGCGACCGAGCG ATCTGGCGAAATCTACCTGCCTTACATTGGACACCTCAGCGACCATGTCGTCCTTTTGGAGGACGGCTCCATCTT GACCATGGCACATATCAGTGGTGTGCCCTTCGAACTGGAGGAGGTTGAAGTCCGAAATGCGCGCTGCCGTGCCTT CAACACGCTCTTTCGCAATATCGCCGACGACAACGTCTCGGTATATGCCCATCTCGTCCGTCatcgaattc 10. ábra: A PCR termék teljes szekvenciája. A kék kisbetűk jelölik a pbs vektorból származó részt, ami segít a fragment orientációjának meghatározásában. Pirossal jelöltük a primer szekvenciáját, sárgával pedig az egyes virb gének start kodonjait. Az általunk meghatározott szekvencia részletet összehasonlítottuk már ismert szekvenciákkal (11. ábra). A fragment több Agrobacterium törzzsel is homológiát mutatott, vagyis ez egy további bizonyíték arra, hogy egy virb génrészletet sokszoroztunk fel. 4.3. Mutáció elkészítése a virb régióban További célunk volt egy virb mutáns törzs létrehozása, hogy ezzel is igazoljuk, hogy egy funkcionális géncsoportot sikerült azonosítanunk. A meghatározott szekvenciát elemezve kerestünk egy olyan egyedi restrikciós hasítóhelyet (SphI), ahova egy kanamicin rezisztencia kazettát (Neomicin-foszfotranszferáz-2, MPT-2) be tudunk építeni (12. ábra). Az SphI hely közvetlenül a virb2 gén start kodonja után található.

23 11. ábra: A meghatározott szekvencia hasonlósága ismert virb szekvenciákhoz. A filogrammon látható, hogy a legnagyobb hasonlóságot az A. rhizogenes 2659 törzzsel mutatja. Az illesztésben használt törzsek: A. tumefaciens C58 (J03320); A. tumefaciens A6 (J03216); A. tumefaciens Bo542 (DQ058764); A. tumefaciens AB2 (AF329849); A. vitis S4 (CP000637); A. rhizogenes 2659 (EU186381). A kanamicin rezisztencia gént EcoRV emésztéssel vágtuk ki a pbs vektorból, majd SphI emésztéssel a virb fragmentet tartalmazó pbs plazmidot linearizáltuk. Mivel az SphI emésztés révén nem ragadós végek keletkeznek, ezért T4-polimeráz kezelést végeztünk. Az eljárás eredményeként tompa végek alakulnak ki. Ezután összeligáltuk a kanamicin rezisztencia kazettát a linearizált virb fragmenttel, majd ezt a konstrukciót beklónoztuk pbs vektorba, az EcoRV hasító helyre (12. ábra). A kanamicin rezisztencia gén két féle orientációban épülhet be a virb régióba (12. ábra): I. a virb gén átíródásának irányával megegyezően; II. a virb gén átíródásának irányával ellentétesen. Az orientációt PstI emésztéssel ellenőriztük (13. ábra). Az I-es orientációt mutató mintákkal dolgoztunk tovább.

24 12. ábra: Az A. vitis AT1 törzsből származó virb régióba beépítettük a kanamicin rezisztencia gént az SphI helyre. Az általunk készített konstrukciót pbs vektorba klónoztuk be (EcoRV). 13. ábra: A kanamicin rezisztencia gén orinetációjának meghatározása. λ= kontroll, 1-10: a kanamicin rezisztencia kazettát tartalmazó miniprep minták. Az I-es orientációnál 1600 bázispárnál látható bend (2, 4, 6, 8, 10), míg a II-es orientáció esetén 1300 bázispárnál (1, 3, 5, 7, 9). A pbs plazmid nem képes bejutni az Agrobacterium sejtbe, ezért a konstrukciót át kell klónozni ppag vektorba. A ppag egy konjugatív plazmid, mely helper plazmid segítségével képes bejutni Gram negatív baktériumokba, ilyen módon az Agrobacterium sejtekbe is.

25 Az egész inszertet a pbs plazmidból EcoRI-KpnI emésztéssel vágtuk ki. A ppag vektort pedig szintén EcoRI-KpnI emésztésnek vetettük alá (14. ábra). A két hasítóhely a plazmidon közel helyezkedik el egymáshoz, ezért olyan, mintha a plazmidot linearizáltuk volna. Mivel két különböző enzimmel dolgoztunk, így a két hasítási vég is különbözik, ezért ligáláskor a plazmid nem tud magával összekapcsolódni. 14. ábra: Az általunk készített inszertet beklónoztuk ppag vektorba, mert csak ez a típusú plazmid képes bejutni az Agrobacterium sejtbe. A ppag vektorba klónozott és kanamicin rezisztenciával rendelkező virb fragmentet sikerült bejuttatnunk egy rifampicin rezisztens A. vitis AT1 törzsbe, a helper plazmid segítségével (3. fejezet, 1. táblázat). Mivel a keresztezett partnerek közül csak az A. vitis törzs rifampicin rezisztens, illetve a kanamicin rezisztens virb mutációt tartalmazó ppag plazmid nem képes ezekben az Agrobacterium sejtekben replikálódni, így csak azok a baktériumok lesznek mindkét antibiotikummal szemben rezisztensek, ahol a mutáció homológ rekombinációval épül be az agrobaktériumok Ti-plazmidjába. A homológ rekombináció két módon mehet végbe: 1) kétszeres rekombináció révén csak a beépíteni kívánt virb mutáció integrálódik a kromoszómába, a plazmid többi része és a rekombináció által kiejtett vad típusú szekvencia elvész; 2) egyszeres rekombináció révén az egész ppag vektor beépül a kromoszómába és úgynevezett kointegrát képződik. Csak az első esetben jön létre a számunkra értékes mutáns, a második esetben a vad típusú gén és a mutáció együtt vannak jelen, így általában nem alakul ki mutáns fenotípus.

26 Az előbb leírtak miatt fontos, hogy a rifampicin és kanamicin rezisztens mutáns jelölteket több szempontból is megvizsgáljuk és bebizonyítsuk, hogy kettős homológ rekombinációval jöttek létre, így ppag vektorból származó szekvenciát nem tartalmaznak. A ppag plazmid jelenlétét az jelzi, hogy ha a keletkezett agrobaktériumok spectinomicin rezisztensek, mivel ez a marker a vektoron található, illetve ha a beépült fragment jóval nagyobb méretű a vártnál. Ezt kolónia PCR segítségével ellenőriztük le, virb specifikus primerekkel (15. ábra). 15. ábra: Kolónia PCR. L=Ladder (kontroll), 1: a vad típusú virb régiót tartalmazó miniprep minta, 2-10: a kanamicin rezisztencia kazettát tartalmazó miniprep minták. A virb mutánsok esetében 2,5 kb nagyságú ez a fragment, ami megegyzik az elvárásainkkal. Tehát nem tartalmaznak szekvenciát a ppag vektorból. 4.4. Kalancoe virulencia teszt Ebben a növényi tesztben azt vizsgáltuk, hogy a létrehozott mutáns agrobaktériumok (PP4701, PP4702) képesek-e tumort okozni a növényen. Kontrollként a vad típusú A. vitis AT1 törzset használtuk. Kísérleteink során azt láttuk, hogy a mutáns törzsek nem okoztak tumort a növényeken, csak a sebzési hely látszott (16. ábra). Ez azt jelenti, hogy sikeresen elrontottuk a virb gént, illetve arra is utal, hogy nincs több funkcióképes virb gén a Tiplazmidon.

16. ábra: A növények fertőzése az egyes Agrobacterium törzsekkel. A: vad típusú A. vitis AT1; B: mutáns A. vitis AT1 törzsek (PP4701, PP4702); C: kontroll (0,9%-os NaCl oldat). 27

28 5. Összefoglalás Az agrobaktériumok Gram-negatív talajbaktériumok, melyek főként a kétszikű növényeket támadják. A fertőzés során a Ti-plazmidon lévő T-DNS kivágódik és bejut a növényi sejtbe. Megváltoztatja a sejt anyagcseréjét, illetve egyes növekedési hormonok túltermelését idézi elő. Ennek következtében a növényi sejtben felborul a normál sejtosztódás, sejtburjánzás indul meg és a növény szárán vagy gyökerén tumorok alakulnak ki. A fertőzésben fontos szerepet játszanak a vir gének. Ezek a gének kódolják a bakteriális virulencia fehérjéket, amelyek a T-DNS kivágását, illetve annak növényi sejtekbe való juttatását végzik. Ezek közül a virb gének feladata, hogy kialakítsák a VirB/D4 T4SS konjugációs pílust. A baktériumok ezt a pílust arra használják, hogy szállítsák a T-DNS-t, illetve a szükséges fehérjéket a baktériumsejtektől a növényi sejtekbe. A virb promóter átíródását növényi szignálok szabályozzák. Célul tűztük ki a virb régiók izolálását olyan A. vitis törzsekből, amelyeknél ez a szekvencia még nem ismert. Azért, hogy ezen szekvenciák segítségével a promóter régiókat izolálhassuk és később a virb gének szabályozását vizsgálhassuk. Ehhez összehasonlítottuk a már meghatározott nukleotidszekvenciákat, majd primereket terveztünk a konzerválódottabb régiókra. PCR segítségével sikerült az A. vitis AT1 törzsből egy fragmentet felsokszoroznunk. Ezt a fragmentet megszekvenáltattuk és a szekvencia bioinformatikai elemzése igazolta, hogy a fragment valóban virb szekvenciát tartalmaz. Ezek után az izolált fragmentbe beépítettünk egy kanamicin rezisztencia kazettát, majd ezt a konstrukciót homológ rekombinációval visszajuttatuk A. vitis AT1 törzsbe. Az így létrehozott mutáns törzsek nem okoztak tumort a növényen, ezzel igazoltuk, hogy valóban a virb gént rontottuk el. A mutánsokból a kanamicin rezisztenciagén segítségével később vissza tudjuk izolálni a közelében lévő promóter régiót is.

29 6. Felhasznált irodalom 1. A. A. WISE, F. FANG, Y. LIN, F. HE, D. G. LYNN, A. N. BINNS (2009): The receiver domain of hybrid histidine kinase VirA: an enhancing factor for vir gene expression in Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology: 1534 1542. 2. A. PITZSCHKE, H. HIRT (2010): New insights into an old story: Agrobacterium induced tumour formation in plants by plant transformation. The Embo Journal: 1021 1032. 3. A. ZALTSMAN, A. KRICHEVSKY, S. V. KOZLOVSKY, F. YASMIN, V. CITOVSKY (2010): Plant defense pathways subverted by Agrobacterium for genetic transformation. Landes Bioscience: 1245-1248. 4. B. SCHRAMMEIJER, A. DEN DULK-RAS, A. C. VERGUNST, E. J. JAÂCOME, P. J. J. HOOYKAAS (2003): Analysis of Vir protein translocation from Agrobacterium tumefaciens using Saccharomyces cerevisiae as a model: evidence for transport of a novel effector protein VirE3. Nucleic Acids Research: 860-868. 5. J.M. FERNANDEZ, J.M. SHORT, W.O. BULLOCK (1987): A high efficiency plasmid transforming reca Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques: 376-379. 6. CH. CHANG, S. WINANS (1992): Functional roles assigned to the periplasmic, linker, and receiver domains of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein. Journal of Bacteriology: 7033-7039. 7. CH. BARON, N. DOMKE, M. BEINHOFER, S. HAPFELMEIER (2001): Elevated temperature differentially affects virulence, VirB protein accumulation, and T-pilus formation in different Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium vitis strains. Journal of Bacteriology: 6852 6861. 8. A. DAS, S. STACHEL, P. EBERT, P. ALLENZA, A. MONTOYA, E. NESTER (1986): Promoters of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid virulence genes. Nucleic Acids Research: 1355-1364.

30 9. D. SIVANESAN, CH. BARON (2011): The dimer interface of Agrobacterium tumefaciens VirB8 is important for type IV secretion system function, stability, and association of VirB2 with the core complex. Journal of Bacteriology: 2097 2106. 10. E. LAI, C. I. KADO (1998): Processed VirB2 is the major subunit of the promiscuous pilus of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology: 2711 2717. 11. PJ. HOOYKAAS, H. D. DULK-RAS, G. OOMS, R. SCHILPEROORT (1980): Interactions between octopine and nopaline plasmids in Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology: 1295-1306. 12. J. E. KERR, P. J. CHRISTIE (2010): Evidence for VirB4-mediated dislocation of membraneintegrated VirB2 pilin during biogenesis of the Agrobacterium VirB/VirD4 type IV secretion system. Journal of Bacteriology: 4923 4934. 13. J. E. WARD, JR. E. M. DALE, P. J. CHRISTIE, E. W. NESTER, A. N. BINNS (1990): Complementation analysis of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid virb genes by use of a vir promoter expression vector: virb9, virb10, and virb11 are essential virulence genes. Journal of Bacteriology: 5187-5199. 14. SG. JIN, T. ROITSCH, P. J. CHRISTIE, E. NESTER (1990): The regulatory VirG protein specifically binds to a cis-acting regulatory sequence involved in transcriptional activation of Agrobacterium tumefaciens virulence genes. Journal of Bacteriology: 531-537. 15. J. E. WARD, E. M. DALE, P. J. CHRISTIE, E. W. NESTER, A. N. BINNS (1990): Complementation analysis of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid virb genes by use of a vir promoter expression vector: virb9, virb10, and virb1l are essential virulence genes. Journal of Bacteriology: 5187-5199. 16. J. R. ZUPAN, P. ZAMBRYSKI (1995): Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell. Journal of Plant Physiology: 1041-1047.

31 17. J. ZUPAN, C. A. HACKWORTH, J. AGUILAR, D. WARD, P. ZAMBRYSKI (2007): VirB1 promotes T-pilus formation in the vir-type IV Secretion System of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology: 6551 6563. 18. K. VELUTHAMBI, M. KRISHNAN, J. H. GOULD, R. H. SMITH, S. B. GELVIN (1989): Opines stimulate induction of the vir genes of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Journal of Bacteriology: 3696-3703. 19. M. A. ESCOBAR, A. M. DANDEKAR (2003): Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Science: 380-386. 20. M. LLOSA, J. ZUPAN, CH. BARON, P. ZAMBRYSKI (2000): The N- and C-terminal portions of the Agrobacterium VirB1 protein independently enhance tumorgenesis. Journal of Bacteriology: 3437 3445. 21. N. J. MANTIS, S. C. WINANS (1991): The Agrobacterium tumefaciens vir gene transcriptional activator virg is transcriptionally induced by acid ph and other stress stimuli. Journal of Bacteriology: 1189-1196. 22. N. SHIMODA, A. TOYODA-YAMAMOTO, J. NAGAMINE, S. USAMIT, M. KATAYAMAT, Y. SAKAGAMIT, Y. MACHIDA (1990): Control of expression of Agrobacterium vir genes by synergistic actions of phenolic signal molecules and monosaccharides. Biochemistry: 6684-6688. 23. L. Orosz, Z. Sváb, A. Kondorosi, T. Sik (1973): Genetic studies on Rhizobio-phage 16-3. Molecular Genetics: 341-350. 24. P. J. CHRISTIE (2004): Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochimica et Biophysica Acta: 219 234. 25. P. MOSSEY, A. HUDACEK, A. DAS (2010): Agrobacterium tumefaciens type IV secretion protein VirB3 is an inner membrane protein and requires VirB4, VirB7, and VirB8 for stabilization. Journal of Bacteriology: 2830 2838.

32 26. P. M. ROGOWSKY, T. J. CLOSE, J. A. CHIMERA, J. J. SHAW, C. I. KADO (1987): Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid ptic58. Journal of Bacteriology: 5101-5112. 27. R. MIDDLETON, K. S. LANDER, N. KRISHNAMURTHY, J. FOLEY, P. ZAMBRYSKI (2004): Predicted hexameric structure of the Agrobacterium VirB4 C-terminus suggests VirB4 acts as a docking site during type IV secretion. PNAS: 1685-1690. 28. J. SAMBROOK, E. FRITSCH, T. MANIATIS (1989): Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 29. S. JIN, R. K. PRUSTI, T. ROITSCH, R. G. ANKENBAUER, E. W. NESTER (1990): Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology: 4945-4950. 30. E. SZEGEDI, M. CZAKÓ, L. OTTEN, C. KONCZ (1988): Opines in crown gall tumors induced by biotype 3 isolates of Agrobacterium tumefaciens. Physiology Molecular Plant Pathology: 237-247. 31. T. TZFIRA, J. LI, B. LACROIX, V. CITOVSKY (2004): Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models. Trends in Genetics: 375-383. 32. T. TZFIRA, V. CITOVSKY (2006): Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Science Direct: 147-154. 33. S. TURK, R. VAN LANGE, T. REGENSBURG-TUÏNK, P. HOOYKAAS (1994): Localization of the VirA domain involved in acetosyringone-mediated vir gene induction in Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biolology: 899-907. 34. Y. LEE, S. JIN, W. SIRE, E. W. NESTER (1996): The sensing of plant signal molecules by Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the VirA protein. Gene: 83-88.