A sejtes stressz-választ szabályozó genetikai útvonalak integrációja Caenorhabditis elegansban

A sejtes stressz-választ szabályozó genetikai útvonalak integrációja Caenorhabditis elegansban Doktori értekezés tézisei Barna János Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológia Doktori Iskola Doktori Iskola vezetője: Dr. Erdei Anna, akadémikus Klasszikus és Molekuláris Genetika Doktori Program Programvezető: Dr. Orosz László, akadémikus Témavezető: Dr. Vellai-Takács Krisztina, egyetemi adjunktus Konzulens: Dr. Vellai Tibor, egyetemi docens Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Genetikai Tanszék Budapest, 2012

Irodalmi áttekintés A környezeti stressz a sejtekben különböző védekező mechanizmusokat indukál, amelynek egyik fontos kimenete a fehérje szerkezet homeosztázisának fenntartása. Ilyen mechanizmusok a sejtes hősokk-válasz és a citoplazma komponensek lebontását végző autofágia. Az előbbi folyamat során ún. dajkafehérjék (molekuláris chaperone-ok) indukálódnak, amelyek elősegítik a károsodott fehérjék normális térszerkezetének helyreállítását vagy a károsodott fehérjék lebontását, megelőzve ezáltal a sejt működését károsan befolyásoló fehérje aggregátumok kialakulását. A fonálféreg Caenorhabditis elegansban az inzulin/igf-1 (insulin-like growth factor-1) és a TGF-β (transforming growth factor-beta) jelátviteli útvonalak szabályozzák az anyagcserét, az öregedést, a stressz-választ és az egyedfejlődést [1-5]. Különböző környezeti stresszkörülmények (pl. éhezés, nagy egyedsűrűség és magas hőmérséklet) hatására a fenti útvonalak aktivitása csökken, és ennek következtében az állat bizonyos sejtjeiben lipid halmozódik fel, megnövekedik az élettartama, megnő a stressz-tűrő képessége, ill. ún. kitartó (dauer) lárva állapotba alakul [6, 7]. A DAF-11 transzmembrán guanilát cikláz mindkét útvonal upstream regulátora. Az általa képezett ciklikus guanozin monofoszfát (cgmp) másodlagos jelátvivő molekula a TGF-β ligandumot kódoló daf-7 és az inzulin/igf-1 ligandumot kódoló daf-28 gének kifejeződését aktiválja [8, 9]. A három említett útvonal végeredményben a reproduktív egyedfejlődés fenntartásához szükséges szteroid hormon, a dafakronikus sav (DA) képződését szabályozza. A DA szintézis egyik kulcslépését a DAF-7/TGF- és az inzulin/igf-1 jelátvitelek szabályozása alatt álló DAF-9/citokróm P450 katalizálja [6, 10]. Az inzulin/igf-1 és a DAF-7/TGF- útvonal mutánsainak dauer konstitutív fenotípusának penetranciája hőmérséklet-függő: daf-2(-) és daf-7(-) mutáns állatokban a hőmérséklet emelkedésével nő a dauer lárvák aránya. A hőmérséklet mellett az inzulin/igf-1 és TGFjelátviteli útvonal defektív mutáns állatok dauer konstitutív (Daf-c) fenotípusának penetranciáját a tápanyag ellátottság és az egyedsűrűség is befolyásolják. Az eukarióta szervezetekben a HSF-1 hősokk transzkripciós faktor hősokk fehérjék átírásának aktiválása révén mérsékli a hő és más stresszek fehérjekárosító hatását [11-13]. A HSF-1 monomerek a hőmérséklet emelkedésének következtében trimerizálódnak, foszforilálódnak és a sejtmagba jutnak, ahol az aktív HSF-1 egy konzervált upstream 5 szabályozó hősokk elemen keresztül aktiválja célgénjeinek transzkripcióját [13]. Emellett újabban kimutatták, hogy a HSF-1 az egyedfejlődésben és az élethossz szabályozásban is 1

szerepet játszik [11, 14]. C. elegansban az inzulin/igf-1 jelátvitel gátolja a HSF-1 aktivitást [1, 14]. Csökkent inzulin/igf-1 jelátvitel esetén a HSF-1 és a DAF-16/FoxO transzkripciós faktorok a megnövekedett élethossz és stressz-rezisztencia kialakításához szükséges gének kifejeződését segítik elő [1]. Célkitűzések A stressz fehérjekárosító hatására a sejtekben különböző védelmi mechanizmusok indukálódnak (stressz-válasz). Ilyenek a sejtes komponensek lebontását végző autofágia, valamint a hősokk-válasz, amelynek során a HSF1 (heat shock transcription factor) chaperone gének kifejeződésének aktiválásán keresztül lehetővé teszi a károsodott fehérjék térszerkezetének helyreállítását vagy lebontását. Doktori munkám célja a C. elegans stresszválaszát szabályozó konzervált jelátviteli tengelyek közötti új kapcsolatok feltárása volt. HSF-1 célgének azonosítása és a szabályozási kapcsolat jellemzése Az eddig azonosított HSF1 célgének többsége klasszikus hősokk fehérjét kódol, azonban az utóbbi évek kutatásai nyomán kiderült, hogy a HSF1 a molekuláris chaperone-ok mellett az egyedfejlődésben és sejt differenciációban szerepet játszó gének kifejeződését is szabályozhatja. A HSF-1 hősokk transzkripciós faktor jól definiált, konzervált kötőhellyel rendelkezik (TTCNNGAANNTTC). Ezért célunk a HSF-1 által közvetlenül szabályozott gének meghatározása volt. Egy DNS szekvencia evolúciós konzerváltsága funkcióra utal. Ezért a potenciális célgének halmazából a Caenorhabditis fajok ortológ génjeinek szabályozó régiójának szekvencia analízisével kívántuk kiválasztani azokat a géneket, amelyekben a HSF-1 kötőhely konzervált, vagyis nagy valószínűséggel a HSF-1 közvetlen szabályozása alatt állnak. Az így megszűrt találatok közül elsősorban azokra a nem klasszikus hősokk fehérjéket kódoló potenciális HSF-1 célgénekre kívántunk koncentrálni, amelyek a stressz-választ szabályozó genetikai útvonalak elemeit kódolják, vagy az egyedfejlődés szabályozásában betöltött szerepük ismert. A HSF-1 hősokk faktor a hőmérséklet hatására aktiválódik, ezért a potenciális célgének hőmérséklet és HSF-1 függő expressziójának változását kvantitatív RT-PCR felhasználásával kívántuk megvizsgálni. Az in silico azonosított potenciális célgének és a HSF-1 közti szabályozási kapcsolatot a megfelelő riporterek in vivo expressziós analízisével terveztük megerősíteni. A HSF-1 és a potenciális célgénjei közti közvetlen transzkripcionális szabályozást olyan riporter 2

konstrukciók előállításával terveztük alátámasztani, amelyek a konszenzus kötőhely vad típusú illetve mutáns verzióját tartalmazzák. A HSF-1 és potenciális célgénjei közötti szabályozási viszonyokat, valamint a szabályozási kapcsolat biológiai jelentőségét kettős mutáns (episztázis) elemzéssel terveztük elvégezni. HSF-1 paralógok azonosítása Gerincesekben a hősokk válaszban kulcsszerepet játszó hősokk transzkripciós faktorok több fehérjéből álló családot alkotnak. Gerinctelenekben ugyanakkor eddig csak egyetlen hősokk transzkripciós faktort azonosítottak. Célom volt, hogy a C. elegans genomban bioinformatikai módszerekkel hősokk transzkripciós faktor-szerű fehérjéket kódoló géneket azonosítsak, és megkezdjem genetikai elemzésüket. Az autofágia és a TGF- jelátvitel kapcsolata A stressz-válaszban szerepet játszó autofágia szabályozását laboratóriumunkban intenzíven vizsgáltuk. Előzetes eredményeink alapján feltételeztük, hogy a TGF- jelátvitel az autofágia szabályozásán keresztül befolyásolja a sejtnövekedést. E hipotézis alátámasztásának érdekében az autofagoszómákhoz kötődő, azokat kijelölő gfp::lgg-1 riporter segítségével kívántam megvizsgálni az autofág aktivitást a hipodermális seam sejtekben különböző TGFútvonal defektív mutánsok in vivo expressziós analízisével. Módszerek HSF-1 kötőhelyek in silico azonosítása a C. elegans genomban A genomszintű kötőhely vizsgálatokat a Wormenhancer (Open genomics) illetve a cisred programok felhasználásával végeztem el. A program predikciói során nyert feltételezett kötőhelyek közül a továbbiakban kizárólag azokkal foglalkoztam, amelyek az evolúciósan közeli rokon faj, a Caenorhabditis briggsae megfelelő ortológ génjeinek genomi környezetében is hasonló pozícióban volt jelen. A kötőhely konzerváltsága ugyanis a szabályozó mechanizmus evolúciós konzervációjára, vagyis a kötőhely funkcionális voltára utal. In vivo expressziós vizsgálatok A vizsgált célgének expressziós elemzésének érdekében transzkripciós és transzlációs GFP riporter konstrukciókat állítottam elő rekombináns DNS technikai módszerekkel. A kötőhely funkcióját célzó vizsgálatokhoz in vitro mutagenezissel készítettem mutáns kötőhelyet tartalmazó konstrukciókat. A transzgenikus állatokat biolisztikus transzformáció segítségével 3

hoztam létre. A transzgenikus törzsekben az expressziós elemzéseket fluoreszcens mikroszkóppal tanulmányoztam. daf-7 expressziós aktivitásának jellemzése A daf-7 gén (HSF-1 célgén) expresszióját kvantitatív RT-PCR segítségével is vizsgáltam. A kvantitatív RT-PCR analízishez 100-200 szinkronizált L1 lárvából izoláltunk RNS-t a PureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Invitrogene) kit segítségével. A genomi DNS szennyeződést Rnáz mentes Dnáz I (Fermentas) felhasználásával távolítottuk el. A DNS mentes RNS-t ezután random hexamerekkel a Revert Aid First Strand cdna Synthesis Kit (Fermentas) alkalmazásával írtuk át cdns-sé. A PCR reakciót 20 µl-es végtérfogatban végeztük el a LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche) kittel a gyártó protokollja szerint. Az amplifikáció LightCycler 2.0 (Roche) készülékkel történt. Mérési eredményeink értékelésekor relatív génexpressziós értékeket komparatív C T módszerrel a 2 -ΔΔCT képlet segítségével határoztuk meg. Élethossz vizsgálat A fonálférgek élethosszát 25 C-on határoztuk meg. A törzseket szinkronizáltuk. L4 (4. lárvastádiumú)/fiatal felnőtt állatok élettartamát FUdR (5-fluoro-2'-deoxyuridine) tartalmú lemezeken mértük meg (a FUdR meggátolja a csíravonal aktivitását, amely sok mutánsban specifikusan befolyásolhatja az élettartamot). Az elpusztult állatokat naponta megszámoltuk és eltávolítottuk. Azokat az állatokat tekintettük halottnak, amelyek a platinatűvel való finom érintés után sem mozdultak meg, és garatjuk pumpáló mozgása is megállt. A mérést addig végeztük, míg élő állat maradt a lemezen. Dauer lárva képzés vizsgálat A dauerek százalékos arányának megállapításához a szinkronizált utódokat a vizsgálati hőmérsékleten (20 C, 23 C, 26,5 C) növesztettük. Amikor a nem dauer állatok elérték az L4 lárva/fiatal felnőtt kort (72, 60 illetve 44 óra múlva), meghatároztuk a dauer lárvák és a felnőtt állatok számát, és kiszámoltuk a dauerek százalékos arányát. 4

A doktori értekezés tézisei Doktori kutatómunkám eredményeit az alábbiakban foglalom össze: A HSF-1 traszkripciós faktor gátolja a daf-7 gén expresszióját A daf-7 5 szabályozó régiójában Caenorhabditis fajokban konzervált HSF-1 kötőhelyet azonosítottunk in silico. Kvantitatív RT-PCR segítségével megállapítottuk, hogy a daf-7 expressziója a hőmérséklet emelésével HSF-1 függő módon csökken. Episztázis analízisek segítségével megállapítottuk, hogy 20 és 23 C-on a hsf-1(sy441) hipomorf mutáció szupresszálja a daf-11(m47) és a daf-21(p673) mutánsok dauer konstitutív fenotípusát. Egy daf-7::gfp riporter (ksis2) in vivo expressziós vizsgálatával kimutattuk, hogy DAF- 11/GC és DAF-21/Hsp90 defektív állatokban HSF-1 szükséges a daf-7 expresszió gátlásához az ASI neuronokban: daf-11(-); hsf-1(sy441) és daf-21(p673); hsf-1(sy441) kettős mutáns állatokban vad típusú daf-7 expressziós szintet figyeltünk meg. Hasonló eredményt kaptunk daf-11(-); hsf-1(ok600) mutáns háttérben, illetve a daf-11(-); hsf- 1(RNSi) állatok esetén is. A HSF-1 és a daf-7 közötti közvetlen transzkripcionális szabályozás kimutatása érdekében létrehoztuk a pdaf-7::gfp és a p mut daf-7::gfp riportereket. A p mut daf-7::gfp abban különbözik a pdaf-7::gfp riportertől, hogy 6 bázispár hiányzik a feltételezett HSF-1 kötőhelyből. E riporterek in vivo expressziós vizsgálatával kimutattuk, hogy DAF-11/GC hiányában a daf-7 expresszió gátlásához intakt HSF-1 kötőhely szükséges. Összességében tehát a DAF-11/GC a daf-7 gén kifejeződését a HSF-1 transzkripciós faktor aktivitásának gátlásán keresztül aktiválja. A HSF-1 tehát a TGF- jelátvitel upstream szabályozó komponense, amely magas hőmérsékleten a daf-7 transzkripcióját gátolva segíti elő a dauer egyedfejlődést. Az inzulin/igf-1 jelátvitel a HSF-1 gátlásán keresztül aktiválja a daf-7 expresszióját Egy daf-7::gfp riporter (ksis2) in vivo expressziós vizsgálatának segítségével kimutattuk, hogy az inzulin receptort kódoló daf-2(e1370) funkcióvesztéses mutáns dauer lárvákban a daf-7 expressziója az ASI neuronokban csökken, míg ehhez képest a daf-2(e1370); hsf- 1(sy441) kettős mutáns dauer lárvákban a daf-7 szintje megemelkedik. Hasonló változást tapasztaltunk L1 lárvák vizsgálata során is. 5

Megállapítottuk, hogy az inzulin receptor mutáns daf-2(e1370) törzsben a hsf-1 túltermelése esetén a dauer lárvák aránya jelentősen megnövekedik 20 és 23 C-on. Összességében tehát a táplálék ellátottságot érzékelő inzulin/igf-1 útvonalat és a DAF- 7/TGF- jelátvitelt a HSF-1 fűzi össze, lehetővé téve, hogy a dauer fejlődést elősegítő és gátló jelek integrálódjanak. A HSF-1 a daf-7-től downstream is befolyásolja a C. elegans élethosszát és dauer egyedfejlődését Kimutattuk, hogy a daf-7(-) megnövekedett élethosszát a hsf-1(sy441) szuppresszálja, vagyis a hsf-1 a daf-7 géntől downstream hathat az élethossz szabályozásában. Eredményeink szerint hsf-1(sy441) hiányában megnő, míg a hsf-1 túlműködése esetén csökken a dauer lárvák aránya daf-7(-) mutáns háttéren, vagyis a HSF-1 a daf-7 géntől downstream gátolja a dauer egyedfejlődést. A HSF-1 aktiválja a daf-9/citokróm p450 gén kifejeződését A daf-9 cisz szabályozó régiójában Caenorhabditis fajokban konzervált HSF-1 kötőhelyet azonosítottunk in silico. A daf-9 génexpresszió magas hőmérsékleten megemelkedik az L3 lárvák hipodermiszében. A feltételezett hősokk elemet tartalmazó daf-9::gfp riporter (dhex67) segítségével kimutattuk, hogy a HSF-1 hiányában a daf-9 expressziója a hőmérséklet növelésének hatására nem emelkedik meg az L3 lárvák hipodermiszében, vagyis a HSF-1 szükséges a daf-9 átírásának hőmérséklet függő aktiválásához. A daf-9 expressziója DAF-11/GC hiányában is megemelkedik az L3 lárvák hipodermiszében. Ezzel szemben daf-11(m47); hsf-1(sy441) kettős mutáns állatokban a daf-9 gén kifejeződésének szintje nem változik. Ez azt sugallja, hogy a HSF-1 szükséges a daf-9 gén kifejeződésének aktiválásához daf-11(-) mutáns háttéren. Összességében tehát a daf-9 a HSF-1 egy másik transzkripcionális célgénje lehet, és a HSF-1 a daf-7 gátlása, valamint a daf-9 aktiválása révén több ponton, ellentétesen befolyásolja a dauer egyedfejlődést. A C. elegans HSF-2 a reproduktív egyedfejlődést segíti elő A hsf-2 gén egy HSF-1 paralóg fehérjét kódol, amely a HSF-1 klasszikus doménjei közül csak a DNS kötő doménnel rendelkezik. A hsf-2(tm4607) mutáns a TGF- jelátvitel működését befolyásoló daf-11(-) és unc- 3(e151) mutánsok dauer konstitutív fenotípusának penetranciáját erősíti. Ugyanakkor az inzulin/igf-1 jelátvitel defektív daf-2(e1370) és unc-31(e169) mutáns állatok dauer 6

konstitutív fenotípusát nem befolyásolja. Mivel a HSF-2 hiánya a TGF- mutáns daf- 7(e1372) dauer konstitutív fenotípusára sincs hatással, ezért elképzelhető, hogy a hsf-2 az unc-31-től upstream, vagy azzal párhuzamosan fejti ki hatását az inzulin/igf-1 jelátvitelre a dauer egyedfejlődés szabályozásában. A DBL-1/TGF- jelátvitel aktiválja az autofágiát C. elegansban Az autofagoszómákhoz kötődő, azokat kijelölő gfp::lgg-1 riporter segítségével megállapítottuk, hogy a hipodermális seam sejtekben a lon-1(e185) mutáns genetikai háttérben megnő az autofág aktivitás. A DBL-1/TGF- jelátvitel a lon-1 gén kifejeződését gátolja. A LON-1 hiányában megnövekedő autofág aktivitás tehát arra utal, hogy a DBL- 1/TGF- útvonal az autofágiát aktiválja. Következtetések Az eddig azonosított HSF1 célgének többsége klasszikus hősokk fehérjét kódol, amelyek a sejtet a stressz hatására kialakuló rendellenes fehérjék károsító hatásaitól védik [12]. Az elmúlt évtized kutatásai során azonban kiderült, hogy a hősokk transzkripciós faktorok a klasszikus hősokk fehérjéket kódoló gének mellett más gének átíródását is szabályozhatják [15, 16]. Néhány kivételtől eltekintve [17, 18] a HSF-1-et transzkripciós aktivátorként jellemezték. Jelen munkában kimutattuk, hogy a HSF-1 két további - nem klasszikus hősokk - fehérjét kódoló gén, a daf-7/tgf- és a daf-9/citokróm p450 expresszióját szabályozza. Megállapítottuk, hogy a HSF-1 több ponton befolyásolja a féreg posztembrionális egyedfejlődését. A daf-7 és a daf-9 gének a C. elegans dauer egyedfejlődését szabályozó TGF- és szteroid hormon útvonalak komponensei. A HSF-1 mindkét gént szabályozza: a daf-7 gén transzkripcióját gátolja, míg a daf-9 gén kifejeződését aktiválja. A HSF-1 kettős - dauer egyedfejlődést indukáló (daf-7 represszálásán keresztül), illetve azt gátló (daf-9 aktiválásán keresztül) szabályozó szerepe egyszerre teszi lehetővé, hogy a populáció biztosan túléljen (néhány dauer lárva), illetve szaporodjon (sok reproduktív felnőtt). Ez a genetikai megoldás nagyban hozzájárulhatott a C. elegans populációk fitneszének maximalizálásához és evolúciós fennmaradásához. A magas hőmérséklet, a nagy egyedsűrűség és az éhezés egyaránt dauer egyedfejlődést indukáló környezeti tényezők. Eredményeink szerint a táplálék ellátottságot érzékelő inzulin/igf-1 és az egyedsűrűséggel arányos dauer feromon szenzor DAF-11/GC, valamint a hőmérséklet egyaránt HSF-1 függő módon szabályozzák a TGF- ligandumot kódoló daf-7 gén kifejeződését. Vagyis a HSF-1 egy bonyolult szabályozási hálózat központi elemeként 7

összehangolja az egyedfejlődést, a stressz-választ és az öregedést befolyásoló konzervált jelátviteli útvonalak működését. Kimutattuk továbbá, hogy a C. elegans genomban a HSF-1 mellett egy további hősokk transzkripciós faktor-szerű fehérjét kódoló gén található. Ezen gén (hsf-2) genetikai és expressziós elemzését megkezdtük. Megállapítottuk, hogy a hsf-2 befolyásolja a C. elegans dauer egyedfejlődési programját. Alátámasztottuk továbbá korábbi feltételezésünket, miszerint a DBL-1/TGF- jelátviteli útvonal az autofág folyamatokat aktiválja. Az autofágiához hasonlóan [19, 20] a TGF- a rákban betöltött szerepe kettős: tumorszuppresszor és a tumor kialakulását elősegítő szerepe is ismert [21, 22]. A rák kialakulásának korai fázisában a sejtnövekedés gátlása révén tumorszuppresszor hatású, ugyanakkor a karcinogenezis későbbi fázisaiban a TGF- az áttétek képződését segíti elő. Mindezek arra utalnak, hogy a TGF- jelátvitel és az autofágia közti szabályozási kapcsolat a rák kialakulásában és fejlődésében is szerepet játszhat. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények: 1. Barna J, Princz A, Kosztelnik M, Takács-Vellai K, Vellai T. Heat shock factor-1 intertwines insulin/igf-1, TGF-β and cgmp signaling to control development and aging. Barna J, Princz A, Kosztelnik M, Hargitai B, Takács-Vellai K, Vellai T. BMC Dev Biol. 2012 Nov 1;12(1):32. IF: 2,78 2. Aladzsity I, Tóth ML, Sigmond T, Szabó E, Bicsák B, Barna J, Regos A, Orosz L, Kovács AL, Vellai T. Autophagy genes unc-51 and bec-1 are required for normal cell size in Caenorhabditis elegans. Genetics. 2007 Sep;177(1): 655-660. IF: 4.001 Független idéző: 13 Függő idéző: 5 Összesen: 18 További közlemények: 3. Szabó E, Hargitai B, Regos A, Tihanyi B, Barna J, Borsos E, Takács-Vellai K, Vellai T. TRA-1/GLI controls the expression of the Hox gene lin-39 during C. elegans vulval development. Dev Biol. 2009 Jun 15; 330 (2): 339-348. IF: 4.379 Független idéző: 3 Függő idéző: 3 Összesen: 6 4. Sigmond T, Barna J, Tóth ML, Takács-Vellai K, Pásti G, Kovács AL, Vellai T. Autophagy in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 2008; 451: 521-540. IF: 2.312 Független idéző: 7 Függő idéző: 2 Összesen: 9 5. Tóth ML, Sigmond T, Borsos E, Barna J, Erdélyi P, Takács-Vellai K, Orosz L, Kovács AL, Csikós G, Sass M, Vellai T. Longevity pathways converge on autophagy genes to regulate life span in Caenorhabditis elegans. Autophagy. 2008 Apr 1; 4(3): 330-338. IF: 5.479 Független idéző: 100 Függő idéző: 8 Összesen: 108 8

Felhasznált irodalom: 1. Hsu, A.L., C.T. Murphy, and C. Kenyon, Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science, 2003. 300(5622): p. 1142-5. 2. Kenyon, C.J., The genetics of ageing. Nature, 2010. 464(7288): p. 504-12. 3. Matyash, V., et al., Sterol-derived hormone(s) controls entry into diapause in Caenorhabditis elegans by consecutive activation of DAF-12 and DAF-16. PLoS Biol, 2004. 2(10): p. e280. 4. Ogg, S., et al., The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature, 1997. 389(6654): p. 994-9. 5. Shaw, W.M., et al., The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Curr Biol, 2007. 17(19): p. 1635-45. 6. Gerisch, B. and A. Antebi, Hormonal signals produced by DAF-9/cytochrome P450 regulate C. elegans dauer diapause in response to environmental cues. Development, 2004. 131(8): p. 1765-76. 7. Jia, K., P.S. Albert, and D.L. Riddle, DAF-9, a cytochrome P450 regulating C. elegans larval development and adult longevity. Development, 2002. 129(1): p. 221-31. 8. Murakami, M., M. Koga, and Y. Ohshima, DAF-7/TGF-beta expression required for the normal larval development in C. elegans is controlled by a presumed guanylyl cyclase DAF- 11. Mech Dev, 2001. 109(1): p. 27-35. 9. Li, W., S.G. Kennedy, and G. Ruvkun, daf-28 encodes a C. elegans insulin superfamily member that is regulated by environmental cues and acts in the DAF-2 signaling pathway. Genes Dev, 2003. 17(7): p. 844-58. 10. Gerisch, B., et al., A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(12): p. 5014-9. 11. Morley, J.F. and R.I. Morimoto, Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol Biol Cell, 2004. 15(2): p. 657-64. 12. Prahlad, V. and R.I. Morimoto, Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell Biol, 2009. 19(2): p. 52-61. 13. Akerfelt, M., R.I. Morimoto, and L. Sistonen, Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010. 11(8): p. 545-55. 14. Chiang, W.C., et al., HSF-1 regulators DDL-1/2 link insulin-like signaling to heat-shock responses and modulation of longevity. Cell, 2012. 148(1-2): p. 322-34. 15. Xie, Y., et al., Heat shock factor 1 represses transcription of the IL-1beta gene through physical interaction with the nuclear factor of interleukin 6. J Biol Chem, 2002. 277(14): p. 11802-10. 16. Takaki, E., et al., Maintenance of olfactory neurogenesis requires HSF1, a major heat shock transcription factor in mice. J Biol Chem, 2006. 281(8): p. 4931-7. 17. Wang, J., et al., HSF1 down-regulates XAF1 through transcriptional regulation. J Biol Chem, 2006. 281(5): p. 2451-9. 18. Xie, Y., et al., Heat shock factor 1 contains two functional domains that mediate transcriptional repression of the c-fos and c-fms genes. J Biol Chem, 2003. 278(7): p. 4687-98. 19. Kimmelman, A.C., The dynamic nature of autophagy in cancer. Genes Dev, 2011. 25(19): p. 1999-2010. 20. Rosenfeldt, M.T. and K.M. Ryan, The multiple roles of autophagy in cancer. Carcinogenesis, 2011. 32(7): p. 955-63. 21. Wakefield, L.M. and A.B. Roberts, TGF-beta signaling: positive and negative effects on tumorigenesis. Curr Opin Genet Dev, 2002. 12(1): p. 22-9. 22. Bierie, B. and H.L. Moses, Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat Rev Cancer, 2006. 6(7): p. 506-20. 9