1.ENZIMMÉRNÖI ALAPIMERETE Zemplén Géza,1915 Az enzimek és gyakorlati alkalmazásuk. A kir.magyar Term.Tud. Társulat kiadása 349 oldal evés fejezete van a chemiának, amely a legutolsó néhány év alatt olyan nagyot haladt volna, mint éppen az enzimeké. Éppen ezért a vegyész lépten-nyomon érzi, hogy megismerésük és a velük való bánásmód manapság már nélkülözhetetlen
ε ν ζ υ µ η = éleszt ben 1878 ühne A fehérjék speciális csoportjai és biológiai funkcióik: Regulátor fehérjék lac-represszor RN szintézis interferonok vírus rezisztencia inzulin glükóz metabolizmus növ. hormon Transzport fehérjék laktóz permeáz sejtmembrán transzport mioglobin O 2 - izomban hemoglogin O 2 - vérben éd fehérjék antitestek (abzymek) idegen anyag -komplex trombin véralvadás
Toxinok B.thuringiensis Cl.botulinum Tartalék ta.fehérjék ovalbumin kazein zein ontraktil fehérjék dynein zerkezeti fehérjék kollagén glikoproteinek ENZIME biol. Inszekticid ételmérgezés tojásfehérje tejfehérje kukoricacsíra cilia, flagella izületek, inak sejtfal reakciókatalízis chaperonok prionok
katalitikus hatás Regulátor fehérjék lac-represszor interferonok inzulin növ. hormon RN szintézis vírus rezisztencia glükóz metabolizmus Transzport fehérjék laktóz permeáz sejtmembrán transzport mioglobin O 2 - izomban hemoglogin O 2 - vérben éd fehérjék antitestek (abzymek) idegen anyag -komplex trombin véralvadás
BIOATALÍZI és RN RN - világ RIBOZIME & ATP, NAD +, CoA, (koenzimek) trn RNaseP 377 bp 125 kd a fehérjéje csak 119 A 14 kd Enzimek - katalitikus hatású FEHÉRJÉ sejtnek 15-55 % sz.a.
2-3000/ sejt kül.enzimfeh. Gyorsan szaporodó Escherichia coli összetétele (Watson, 1970 nyomán) ÖZETEÕ EGYÜLET COPORT % A EJTÖMEGBE N ÁTLAG MÓLTÖME G DB/EJT H 2 O 70 18 4*10 10 1 ZERETLEN IONO: +,Mg 2+,Ca 2+,Fe 2+,Cl - PO 4 4-,O 4 2- zénhidrátok és prekurzoraik Aminosavak és prekurzoraik Nukleotidok és prekurzoraik Lipidek és prekurzoraik Egyéb kis molekulák (hem,kinonok,.) 1 40 2,5*10 8 20 FAJT A/EJ T 3 150 200 0,4 120 3*10 7 100 0,4 300 1,2*10 7 200 2 750 2,5*10 7 50 0,2 150 1,5*10 7 200 Fehérjék 15 40000 10 6 2-3000 Nukleinsavak DN RN 1 2,5*10 9 500000 4 3*10 4 1 1
Eyring: 30-as évek, átmeneti állapot A + B AB* P G H* = G* + T. * * dp dt CAB = C C = k r A C C = C C A = RTln A B C AB = * B B = C krh kt AB kt h krh = RTln = H kt * T * T az abszolút hõmérséklet (elvin fok) k a Boltzmann állandó (1,37.10-16 erg/oc) h a Planck állandó ( 6,62.10-27) ( ) ( E ) nemkat E kat b k r = kt h e R e H RT konst e E RT ( k r ) ( k r ) nemkat kat
ATIÁLT OMPLEX E* FUNCIONÁLI DOMAIN-E ZUBZTRÁT ÖT HELY lehetnek azonosak is REGULÁTOR DOMAINE: Me modulátor (INHIBITOR,ATIÁTOR,,P) ovalens módositás: foszforilezés glikozilezés proteolizis atalitikus domain ATI CENTRUM
MATERLIDE ZUBZTRÁT ÖT HELY Zsák,zseb rendszerint töltés illetve hidrofób a kötést stabilizálhatja nemkovalens kölcsönhatás enztul csak egy kis felület a protein molekulán! Az enzim-katalizis általános esetei: modern elméle Linus Pauling 1946 Haldane 1930 1. sav-bázis 2.kovalens katalizis 3.fém ion katalizis Hatások, amelyek felel sek ill. jellemzik az enzimkatalizis(ér)t: proximitási effektus orientácós effektus kulcs zár hasonlat indukált illeszkedés Daniel oshland-konformációváltozás ENTRÓPIACAPDA REATI COPORTO fehérjeszerkezet
ULC ULC-ZÁR HAONLAT E komplex + szabad E ZÁR termékek + szabad E
Orientációs effektus A sztereospecifitás alapja
http://www.chem.ucsb.edu/~molvisual/able/induced_fit/index.html
Izocitrát dehidrogenáz
Asp -COO - Cys -H REATÍ COPORTO... Glu -COO- & -CONH 2 His HC C imidazol + HN NH CH Lys ε - NH 2 láncvégi NH 2 és COO - elektrosztatikus kölcsönhatás Met CH 3 - er -OH Thr CH 3 CHOH - H - kötések C O...H C O...H O N
Fehérjeszerkezet
Aktív centrum kialakulása
ENZIME TULAJDONÁGAI CA TERMODINAMIAILAG LEHETÉGE REACIÓ G <0 REERZIBILI REACIÓ de:eltolás, elvétel... DENATURÁLHATÓA T, ph, ioner sség, oldószerek PECIFIUA -specifitás csoport-specifitás sztereo-specifitás régió-specifitás ENZIME EL NYEI NAGYOBB REACIÓEBEÉG 10 6-10 12 * ENYHÉBB REACIÓÖRÜLMÉNYE NAGYOBB REACIÓ-..+ PECIFITÁ REGULÁLHATÓÁG
HOLOENZIM BIM Bc FEHÉRJE inaktív APOENZIM + OFATOR FÉMION Mg,Ca,Zn, Fe,Cu,Mo OENZIM Prosztetikus csoport stabil kovalens kötés. FAD(H 2 ), Hem, Piridoxal-P(B 6 ) oszubsztrát Ciklikus regenerálás NAD(H), ATP
ENZIME ELNEEZÉE 1. után urea + viz CO 2 + 2NH 3 ureáz ENZIME ELNEEZÉE -név + áz 2.Reakció (és ) után EtOH AcO AcOH alkohol-dehidrogenáz (-név)+reakciónév+ áz 3.Triviális nevek: + -in pepszin, tripszin, rennin fehérjebontók 4. IUB IUPAC 1964,1972,1978 Enzyme Commission IUBMB
katalógusszám koszubsztrát E.C.1.1.1.49. D-glucose-6P: NADP 1-oxydoreductase a reakció mibenléte szubsztrát a támadás helye az 1 C-atomon van
DataBank
mol/dm 3!!!! ENZIMINETIA E + P + E MIÉRT NEM MÉRHET? Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1 µmol szubsztrátot alakít át vagy 1 µmol terméket képez 1 perc alatt adott reakció körülmények között. I rendszerben: 1 atal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt. hatalmas enzim mennyiség nat = 10-9 at 1 at = 6*10 7 U, 1U =1.6*10-8 at, 1U= 1/60 µat E/tf E/mg fajlagos aktivitás Michaelis és Menten
Michaelis-Menten kinetika k 1 E + E E + P k -1 feltételezések: *k -2 =0 *els lépés gyorsan egyensúlyra jut= RAPID EILIBRIUM *stabil E komplex, EP komplex elhanyagolható *egy aktiv centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett cc használható > >E 0 vagyis E 0 / < <1 k 1 E = k -1 (E) a teljes reakciósebesség: dp dt = = k 2 (E) E (E ) E o k 2 k -2 + = anyagmérleg osszuk el ezt a kett t egymással k 1.E s = = k1 (E) az (E) disszociációs állandója
Michaelis-Menten kinetika = dp = dt k (E) 2 E o E o = = k 2 (E) E + (E) k 2 E + E s E s = = k E 2 o 1+ s + s s Rendezzük át! k k 1 s = = 1.E (E) = k E max 2 o
Michaelis-Menten kinetika = MEMO max max s = 1+ s s + terméket adó komplexek összes komplex 1. E + o max O. E o O. E + = s 1+ H. E + H H. E + H O s O. H. E. E szabad enzim terméket nem adó komplex
M és M Maud Menten 1879-1960 Leonor Michaelis 1875-1949
BRIGG-HALDANE INETIA k 1 E + E E + P k -1 k 2 k -2 d dt = k E + k 1 1 ( E) 0 d ( E) dt dp dt = k = k E k 2 1 ( E) 1 ( E) k ( E) 2 pre-st.st. E 0 (E) kvázi st.st. P steady state 0 E idõ d(e)/dt =0 > > Eo vagy Eo / << 1 és (k 1 E > k -1 (E) ill. k 1 E > k 2 (E))
BRIGG-HALDANE INETIA d ( E) dt = ( E) k ( E) 0 k1 E k 1 2 = k 1 E = ( k + k )( E) 1 2 ( E) = k 1 ( k + k ) 1 E 2 E + (E) = E o = k 2 Eo + m = max + m m =(k -1 + k 2 ) / k 1 Michaelis állandó
DIZUZIÓ Michaelis -Menten = max + s Briggs-Haldane = max + m m = k + k k 1 2 1 k 1 k 2 = + = s + k k 1 ha num(k 1 )> >num(k 2 ) a két konst. azonos! 1 k k 2 1
DIZUZIÓ max = k 2 E O =( max / )* 1.rendû tartomány derékszög hiperbola << s látszólagos els rend sebességi állandó Ha >> s 0. rend rendû tartomány k 2 E0 = k E0 m ; katalitikus effektivitás
1/ L-B, L-H, E-H ábrázolások tgα= m / max / tgα=1/ max -1/ m 1/ max = max m 1 1 = + m 1 max max * 1/ max tgα=- m m max / m m / max = m + 1 * max max /
0 értelmezése A M-M M M és B-H B H egyenletekben kezdeti reakciósebességet jelent!!! P 0 =(d/dt) t=0 0 =(dp/dt) t=0 t t
A k 2 meghatározása és max E 0 -függése max3 =k 2 E O3 max2 =k 2 E O2 tg α= k 2 max1 =k 2 E O1 m E O1 E O2 E O3 E O
A kinetikai paraméterek értelmezése 1
A kinetikai paraméterek értelmezése 2 k 1 10 7-10 10 dm 3 mol -1 min -1 [max. érték(10 11 ) kis molekulák diffúzió-sebessége ] k -1 10 2-10 6 min -1 k 2 50-10 7 min -1 m 10-6 - 10-2 mol/dm 3
biopolimer hidrolízisek - nagymértékben a jobboldali REERZIBILI irányba REACIÓ eltolt egyensúllyal 1 rendelkeznek, olyannyira, hogy gyakorlatilag k -2 valóban elhanyagolható. De például a glükóz fruktóz (glükóz izomeráz) gyakorlatban is egyensúlyi reakcióként viselkedik 1/ P k 1 k 2 E + E E + P maxs ms maxp mp k -1 k -2 maxsmp k1k2 = = = k k maxp ms 1 2 eq HALDANE összefüggés
E REERZIBILI REACIÓ 3 P MI TÖRTÉNI?? P vagy P MIT L FÜGG? netto = el re - vissza = k 2 (E) - k -2 (EP) eq,, P értéke netto = P maxs eq = P ms 1+ mp + maxs maxp ms P 1+ + ms mp P mp