BIOLÓGIA és BIOTECHNOLÓGIA 5. rész

Átírás

1 BIOLÓGIA és BIOTECHNOLÓGIA 5. rész Előadó: Ballagi András, c. egyetemi tanár Richter Gedeon NyRt. - BME Írásos segédanyag található a: /oktatas /konyvek /mezgaz /Biol-biotech-vegyész-MSc címen 1

2 Itt járunk: 2

3 Enzim mérnöki ismeretek Zemplén Géza,1915 Az enzimek és gyakorlati alkalmazásuk. A kir.magyar Term.Tud. Társulat kiadása Kevés fejezete van a chemiának, amely a legutolsó néhány év alatt olyan nagyot haladt volna, mint éppen az enzimeké. Éppen ezért a vegyész lépten-nyomon érzi, hogy megismerésük és a velük való bánásmód manapság már nélkülözhetetlen 3

4 Enzimek tulajdonságai Csak termodinamikailag lehetséges reakciók ( G <0) Reverzibilis reakciók (de eltolás. elvétel ) Denaturálhatóak (T, ph, ionerősség, oldószerek) Specifikusak: S-specifitás, csoport-specifitás, sztereo-specifitás Nagyobb reakcióképesség Enyhébb reakciókörülmények Nagyobb reakció specificitás Regulálhatóság 4

5 Enzimek tulajdonságai Az enzimek NEM változtatják meg az egyensúlyi állandót. Az enzimek NEM befolyásolják a reakcióban felhasznált vagy felszabaduló energia mennyiségét (G) Az enzimek csökkentik a reakciók aktivációs energiáját Az enzimek növelik az egyébként is lezajló reakciók sebességét 5

6 Kulcs zár hasonlat ES komplex KULCS + S ZÁR szabad E + termékek szabad E 6

7 Az aktív centrum kialakulása Ser Arg Ser Thr Glu 7

8 Enzimes alapfogalmak HOLOENZIM APOENZIM + KOFAKTOR Inaktív fehérje FÉMION Mg,Ca,Zn, Fe,Cu,Mo KOENZIM Prosztetikus csoport stabil kovalens kötés Pl. : FAD(H 2 ), Hem, Piridoxal-P(B 6 ) Koszubsztrát Ciklikus regenerálás NAD(H), ATP 8

9 Itt járunk: 9

10 Enzimkinetika E + S E + P mol/dm 3! SI rendszerben: 1 Katal az az enzim aktivitás (mennyiség), amely 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt. a hatalmas enzim mennyiség miatt nkat = 10-9 Kat használatos A gyakorlatban: 1 egység (Unit, azaz U) az az enzim aktivitás (mennyiség), amely: 1 µmol szubsztrátot alakít át, (vagy 1 µmol terméket képez) 1 perc alatt adott reakció körülmények között. 1 Kat = 6*10 7 U, 1U =1.6*10-8 Kat, 1U= 1/60 µkat E/tf, E/mg fajlagos aktivitások, ha az enzim molekulasúlya nem ismert 10

11 Enzimkinetika: Michaelis Menten kinetika E + S k 1 k -1 k 2 ES E + P feltételezések: k -2 =0 első lépés gyorsan egyensúlyra jut = Rapid ekv. stabil ES komplex, EP komplex elhanyagolható egy aktiv centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett cc. használható S> > >E 0 vagyis E 0 / S < <1 k -2 k 1 S.E = k -1 (ES) K k k 1 s = = 1 S.E (ES) az (ES) disszociációs állandója a teljes reakciósebesség: dp = = k (ES) E + (ES ) = E o dt V 2 osszuk el ezt a kettőt egymással anyagmérleg: 11

12 Michaelis Menten kinetika V = dp = dt k (ES) 2 E + (ES ) = E o V = k E max 2 o V E o V E o = = k 2 (ES) E + (ES) k 2 E + S K E s S E K S V Ks S = = k E S 2 o 1+ Ks + S K s s K Rendezzük át! V = k k 1 s = = V 1 max S.E (ES) K s S + S E + S k 1 k -1 k 2 ES E + P k -2 12

13 Maud Menten Leonor Michaelis

14 Briggs - Haldane kinetika E + S k 1 k -1 k 2 ES E + P k -2 ds dt = k 1 ES + k 1 ( ES) S 0 S ( ES) d dt = k 1 ES k 1 ( ES) k ( ES) 2 pre-st.st. (ES) kvázi st.st. P dp dt = k 2 ( ES) E 0 0 E idõ steady state: d(es)/dt =0 S > > Eo vagy Eo / S << 1 és (k 1 ES > k -1 (ES) ill. k 1 ES > k 2 (ES)) 14

15 E E + (ES) = E o = E o (ES) d ( ES) dt Briggs - Haldane kinetika = ( ES) k ( ES) 0. k1 E S k 1 2 = k 1( ES) k ( ES) 0 ( ) ( ) 0 k (E0 - ES) S 2 1 = k 1 1 E0S = (k 1 + k2) ES + k ES S = V = V max k K 2 m (ES) S + S = k k2 E + k k -1 1 o 2 S + S K m k 1 = + k k Michaelis állandó 1 2 E + S k 1 k -1 k 2 ES E + P k -2 15

16 Az M-M és B-H kinetika diszkussziója Michaelis Menten S V = Vmax K + S s Briggs-Haldane V = V max K S + S m K m k + k k k = = + = Ks + k k k k k ha num(k 1 )> >num(k 2 ) K m = K s 1 a két konst. azonos! E + S k 1 k -1 k 2 ES E + P k -2 16

17 Diszkusszió V V max = k 2 E O V=(V max /K S )*S 1.rendû Rendű tartomány S << Ks derékszögű hiperbola Ha S >> Ks 0. rendű rendû tartomány 0-ad Rendű tartomány K m ; K S V = V max K m S + S S 17

18 Linewaver Burk ábrázolás 18

19 Itt járunk: 19

20 Enzimek elnevezése 1. S után : urea + viz CO 2 + 2NH 3 ureáz S-név + áz 2. Reakció (és S) után: EtOH AcO AcOH alkohol-dehidrogenáz (S-név)+reakciónév+ áz 3. Reakció (és P): után Glutamát + ATP + NH3 Glutamin + ADP + foszfát Glutamin szintetáz (P-név)+reakciónév+ áz 4.Triviális nevek: alapnév + -in pepszin, tripszin, rennin fehérjebontók 20

21 Enzimek elnevezése katalógusszám koszubsztrát E.C D-glucose-6P: NADP 1-oxydoreductase szubsztrát a támadás helye az 1 C-atomon van a reakció mibenléte A glükózoxidáz szisztematikus neve 21

22 Itt járunk: 22

23 Kompetitív inhibíció A kompetitív inhibíció egy olyan gátlás amelynél az inhibitor az aktív centrumba kötődik és megakadályozza a szubsztrát bekötődését (és viszont: a szubsztrát az inhibitor bekötődését.) Vmax változatlan, mert sok szubsztrát legyőzi a kevés inhibitort, de a Km nő, mert a szubsztrát enzimhez való kötődése csökken 23

24 Nem-kompetitív inhibíció Nem-kompetitív inhibíció akkor lép fel, ha az inhibitor ugyanolyan jól kapcsolódik az enzimhez, mint az enzimszubsztrát komplexhez és megakadályozza a termékképződést. Ezáltal csökkenti az enzimaktivitást, de a szubsztráthoz való affinitást nem, mert a szubsztrát zavartalanul be tud kötődni 24

25 Unkompetitív inhibíció Unkompetitív inhibició, másnéven anti-kompetitív inhibíció az, amikor az inhibitor csak a már kialakult enzim-szubsztrát komplexhez tud kötődni, az egyedül álló enzimhez nem. A maximális enzimaktivitás (Vmax) csökken, mert a termékképzés gátolt, de a szubsztráthoz való affinitás nő (Km csökken), mert a reakció eltolódik ESI irányába, így a szabad ES komplex csökken. 25

26 Kompetitív inhibició Non-kompetitív inhibició ANALÓGIÁK a M-M kinetikára S K I 1 K S V V i s max + + = = max I 1 S I 1 K S V V + + = i s max K I 1 S K S V V Unkompetitiv inhibició i i s K I 1 S K I 1 K

27 Itt járunk: 27

28 Heterogén fázisú enzimes reakciók Homogenitási szempont Gazdasági szempont Homogén fázisú Enzim reakció a rendszer homogén, az enzim az izolálásán kívül előkészítést nem igényel Az enzimek drágák, 1-10 $/mg Csak egyszer használhatók fel, a reakció után elvesznek, illetve kinyerésük a reakcióelegyből bonyolult és drága. Heterogén fázisú Enzim reakció Inhomogén rendszer, előkészítést (kémiai kapcsolást) igényel Az enzimek ugyan drágák, de többször felhasználhatóak így az egy reakcióra eső költség olcsóbb Technológiai szempont szennyezik a terméket, tisztítását nehezítik Az enzim a reakcióelegyből könnyen eltávolítható

29 Enzim Immobilizáció története Nelson és Griffin 1916 ban véletlenül fedezte fel, hogy élesztő invertáza aktívszénen adszorbeálódott de megőrizte az aktivitását a szaharóz hidrolízisében. Ipari gyakorlattá illetve kereskedelmivé akkor vált, amikor Grubhofer és Schleith egy sor enzimet rögzítettek: karboxipeptidázt, diasztázt, pepszint és ribonukleázt. Ezeket diazotálással végezték poli-aminosztirol gyantára kovalens kötéssel. Az első ipari alkalmazás Chibata nevéhez fűződik 1969-ben, aki aminoacilázt rögzített DEAE Sephadex-re ionosan és ezt N-acyl-D, L-aminosav rezolválására használták. 29

30 Enzim Immobilizáció 30

31 Az enzimrögzítés fizikai módszerei F K!!! Enzim rögzités üreges szálban (Hollow fibre) Enzim rögzités fonott szálas anyagban F M E E S F Enzimbezárás oldhatatlan gél mátrixban Mikrokapszulázás 31

32 Az enzimrögzítés kémiai módszerei Enzimkötés hordozóhoz kovalens kötéssel M M E M=mátrix E KÉMIAI MÓ ÓDSZEREK Keresztkötés Enzim keresztkötés multifunkciós reagenssel 32

33 Az enzimrögzítés kémiai módszerei Kovalens kötés nem esszenciális aminosav-oldallánc(!) és vizben nem oldódó, funkciós csoporttal ellátott hordozó mátrix között X + E E + X Hordozó: természetes polimer: agar, agaróz, kitin, cellulóz, kollagén szintetikus polimer: poliuretán, polisztirol, nylon szervetlen hordozók: üveg, alumínium, szilikagél Kovalens kötés kialakítása: szabad α-, β- vagyγ-cooh, α -,β NH 2 csoportok fenil-, OH-, SH- vagy imidazol-csoportok Lépések: 1. a hordozó aktiválása ( KAR és -X, reaktiv csoport felvitele), 2. a kovalens kötés létrehozása az enzim és az aktivált hordozó között. Közben aktiv centrum védelme: S v. S-analóg jelenlétével 33

34 Az enzimrögzítés kémiai módszerei 34

35 Az enzimrögzítés kémiai módszerei Az enzim fenil-, amin-, szulfhidril- csoportjainak ( ) ALKILEZÉSE MÁTRIX: METAKRILÁT és CELLULÓZ szármezékok homoés kopolimerjei -OH BrCH 2COBr BrCH 2 COOH dioxán O -O-C-CH 2 -Br O -O-C-CH 2 E E 35

36 Az enzimrögzítés kémiai módszerei POLIFUNKCIÓS KÖTÉS MÁTRIX: -NH 2 csoport : AE-CELLULÓZ, DEAE-CELLULÓZ, KOLLAGÉN, KITIN, NYLON, stb -NH 2 + OHC-(CH 2 ) 3 -CHO H -N C-(CH 2 ) 3 -CHO GLUTÁRALDEHID H -N C-(CH 2 ) 3 -CH N-E E -NH 2 Schiff-bázis 36

37 Üvegfelületre rögzítés Az enzimrögzítés kémiai módszerei 3-aminopropyl- triethoxy-silane tiocianát Tioszénsavdiamid=tiokarbamidszármazék 37

38 Az enzimrögzítés kémiai módszerei Keresztkötések létrehozása fehérjemolekulák között 38

39 Itt járunk: 39

40 Az enzimek osztályozása aktivitásuk alapján tejsav dehidrogenáz szerin hidroximetil transzferáz ureáz piruvát dekarboxiláz metil-malonil CoA liáz piruvát karboxiláz 40

41 Az enzimek osztályozása aktivitásuk alapján 41

42 Az enzimek osztályozása aktivitásuk alapján 42

43 Itt járunk: 43

44 Enzimek mint termékek Felhasználási terület Mosószerek Takarmányok Enzim proteázok, lipázok, cellulázok β-glükanáz, celluláz, fitáz, xylanáz, lipáz Orvosi proteázok, lipázok, amilázok, β- alkalmazások/gyógyszerek laktamázok, L-aszparagináz, hyaluronidáz, lizozim, kollagenáz, sztreptokináz Analitika és diagnosztika urát oxidáz, L-aminosav oxidáz, penicillináz 44

45 Enzimek mint segédanyagok Felhasználási terület Textilipar Bőripar Papíripar Cukoripar, keményítőipar Enzim amilázok, hemicelluláz, pektinázok proteázok hemicelluláz, amilázok, lakkáz α-galaktozidáz, (izo)amilázok, amiloglukozidáz, glukóz izomeráz, ciklodextringlukano-transzferáz, xilanáz. 45

46 Az élelmiszeripar enzimei Felhasználási terület Tejipar Söripar Borászat, gyümöcsléipar Húsipar, halfeldolgozás Enzim proteázok, β-galaktozidáz, lizozim, lipázok, észterázok, papain, rennin, glukózoxidáz, kataláz. amilázok, tannáz, β-glukanáz, proteáz, xilanáz pektinázok, naringináz, celluláz, amiláz proteázok, papain, glükózoxidáz Zsír- és olajipar Kávé, tea, kakaó foszfolipáz, észtrázok pektináz, proteáz, glükanáz, tannáz 46

47 A környezetvédelem enzimei Enzim Katalitikus lépés Az enzimet termelő mikroorganizmus Baktériumokból dehalogenáz diklórmetán lebontása Pseudomonas sp benzol-dioxigenáz benzol és egyéb aromások lebontása Pseudomonas putida kollagenáz kollagén hidrolízise. Streptomyces sp. Gombákból cianid-hidratáz cianid detoxifikálás Stemphylium loti celluláz, xilanáz hemicelluláz, pectináz cellulóz hidrolízise/degradációja szalma, egyéb növényi maradvány, papír Hypocrea sp., Aspergillus sp. Chaetomium sp., Humicola sp. 47

48 Néhány vegyiparban alkalmazott enzim Enzim Katalitikus lépés Termék Nitril-hidratáz hidrolízis akrilamid Penicillin-aciláz hidrolízis 6-amino-penicillánsav Hidantoináz reszolválás 4-hidroxi-D-fenil-glicin D-szorbit- oxidáció L-szorbóz dehidrogenáz niacin hidroxiláz hidroxilezés 6-hidroxi-nikotinsav β-ketoreduktáz redukció (R)-karnitin piruvát dekarboxiláz C C-kötés létrehozása (R)-fenil-acetil-karbinol 48

49 Néhány terápiás célra alkalmazott enzim és enzimkészítmény Enzim Enzimforrás Gyógyszernév Mi ellen? Mire? urát oxidáz Aspergillus flavus Uricozyme köszvény, hiperurikémia lipáz Rhizopus arrhizus emésztést elősegítő készítmények Pankreatin: pankreász enzimek keveréke: tripszin, kimotripszin, lipáz, α-amiláz) Sertés pankreász Cotazym, Kreon, Nutrizym, Pankreon, Panzytrat emésztést elősegítő készítmények β-galaktozidáz (Lactase) Kluyveromyces fragilis, A. oryzae, A.niger Lactaid, Lactrase, SureLac laktóz intolerancia hialuronidáz Borjú here, rdns termék Hylase, Vitrase szívinfarktus 49

50 Folytatás: néhány, terápiás célra alkalmazott enzim és enzimkészítmény Enzim Enzimforrás Gyógyszernév Mi ellen? Mire? urokináz humán vizelet vagy humán vesesejttenyészet Abbokinase, Actosolv, Alphakinase, Rheothromb VIII véralvadás rekombináns Recombinate, faktor CHO sejtek Bioclate szöveti plazminogén aktivátor dezoxiribonukleáz rekombináns CHO sejttenyészet rekombináns CHO sejttenyészet Activase, Actilyse Pulmozyme akut szívizominfarktus hemofilia A akut szívizominfarktus; akut tüdőembólia; iszkémiás sztrók krónikus obstruktív tüdőbaj 50

51 Enzimreakciók az analitikában Az elfogyó szubsztrát vagy a keletkező termék valamilyen mérhető változást okoz (például színváltozást, spektrumváltozást, ph-változást stb.) V = V max K m S + S 51

52 Húgysavmeghatározás enzimreakcióval A képződő allantoin nem nyel el 293 nm-en, így a mérés során jelentkező abszorbanciacsökkenésből az S, azaz a húgysav koncentrációja kiszámítható. 52

53 Szubsztrátmeghatározás indikátorreakció segítségével A glükózzal való reakció nem jár mérhető változással, ezért a képződött G6P-ot egy további reakcióban egy további enzimmel, a foszfoglükonátdehidrogenázzal 6-P-glükonáttá oxidáljuk. Eközben a NADP koszubsztrát redukálódik NADPH-vá, aminek elnyelési maximuma van 340 nm-en. (Ez a jellemző mérési módszer minden NADH képződéses reakció esetén). 53

54 Enzimes indikátorreakció fehérjemeghatározásban 54

55 Enzim elektródok, bioszenzorok Az enzimelektródokban, bioszenzorokban rögzített enzimeket vagy teljes sejteket alkalmaznak. Az enzimelektródok amperometriás vagy potenciometriás elven működnek. A bioszenzorok általános felépítése: 55

56 Egy oldott oxigént mérő elektód membránjának felületére van felhordva egy gélben rögzített glükózoxidáz enzim (és kataláz!). Ezt a rögzített enzimet is egy membrán határolja, amely a meghatározandó szubsztrátra, a glükózra és a termék glükonsavra is áteresztő. A reakció során csökken a gélben az oldott oxigén koncentrációja, és ezt a csökkenést detektálja az oxigénelektród Amperometriás glükózelektród 56

57 A potenciometriás elektródok felépítése 57