Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar Nanotechnológia Tanszék FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA Doktori (PhD) értekezés tézisei Sebestyén Anett Környezettudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc Veszprém 2008.
ÖSSZEFOGLALÓ A hagyományos bioszenzorok illetve fehérje chipek antitesteket, vagy azok alkalmas részegységeit alkalmazzák érzékelő elemként. Ezek előállítása költséges, preparálásuk bonyolult, stabilitásuk sokszor elégtelen, a hordozó felülethez kötve könnyen elveszítik natív térszerkezetüket, működőképességüket. Az antitestek kiváltása más fehérje alapú receptorokkal mindenképpen kívánatos. A bakteriális flagellumok helikális filamentumai polimerizálódásra képes flagellin fehérje több tízezer kópiájából épülnek fel. A flagelláris filamentumok önszerveződő rendszerek, azaz a flagellin monomerek spontán módon képesek összeállni a natívval megegyező szerkezetű filamentumokká megfelelő körülmények között. A flagellin polimerizációja könnyen kontrollálható, a kialakuló filamentumok a fizikai-kémiai behatásokkal szemben stabilisak, szerkezetük atomi precizitással ismert. A különböző fajokból származó flagellin fehérjék szekvenciáinak összehasonlításából adódóan ismeretes az is, hogy a molekula centrális szegmensei nagymértékben variábilisak, nem vesznek részt a szerkezetépítésben, éppen ezért különféle kötőhelyek alakíthatók ki ebben a régióban a polimerizáció megzavarása nélkül. Ennek tudatában egyfelől számítógépes molekulatervezés és génsebészeti eszközök segítségével, Ni- és As-kötő flagellinvariánsokat állítottam elő, amelyek az adott nehézfémion felismerésére és erős megkötésére képesek. A flagellin alapú receptorok számos előnyt hordoznak, miszerint baktériumokkal nagy mennyiségben olcsón termeltethetők, a sejtek feltárása nélkül könnyen tisztíthatók, emellett még a flagellin polimerizációs képességénél fogva rendkívül nagy felületi kötőhely sűrűségű filamentáris objektumok építésére is alkalmazhatók. Másfelől megmutattam, hogy a flagellin variábilis D3 doménjét kifejezve, a domén stabil önálló fehérjeként működik, amely lehetővé teszi, hogy mesterséges kötő fehérjék vázelemeként alkalmazható legyen. Későbbiekben, ezek a módosított filamentáris receptorok, vagy a módosított D3 domén önmagában, ivóvizek nehézfémekkel való szennyezettségének mérésére szolgáló optikai szenzorok alapeleméül szolgálhatnak. 2
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK / TÉZISEK 1. A flagellinmolekula ismert szerkezetéből kiindulva, számítógépes grafika és molekulamodellezés alkalmazásával megállapítottam, hogy a flagellin variábilis D3 régiójában mely aminosavak oldalláncai vannak megfelelő orientációban és távolságban ahhoz, hogy hisztidinre cserélve őket, fémkötő centrumot alakíthassak ki. A kiválasztott aminosavakat irányított mutagenezis módszerrel hisztidinre cseréltem. A mutáns flagellin Ni-kötő képességét, kvantitatív izotermális titrációs mikrokalorimetria (ITC) módszerrel vizsgáltam. Megállapítottam, hogy a kötődés disszociációs állandója K d ~5 μm, és egy flagellin alegységhez egy Ni-ion kötődik. 2. A bakteriális arzénkötő fehérjék (ArsR fehérjék) esetén ismeretes, hogy az arzenit ion specifikus megkötéséért felelős polipeptidszegmens aminosavszekvenciája a következő: SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln. A rendelkezésre álló adatok szerint ez a szegmens erősen nyújtott konformációjú, végeinek távolsága közel 20Å. Méretéből adódóan megállapítottam, hogy a D3 domén Ala262-Thr273 öblös felületi hurokrégiója megfelelő vázként szolgálhat az arzénkötő motívum befogadására. Ennek megfelelően az Ala262-Thr273 szegmenst a D3 doménből kivágtam, majd ennek helyére ültettem be az arzénkötő motívumot többlépcsős PCR segítségével. Az előállított As-kötő flagellinmutáns esetében a kötődés disszociációs állandója ugyancsak mm-os tartományba esik. 3. A filamentumok képződésének mechanizmusát kutatva azt a feltételezést, hogy a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység C- terminálisa, fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer módszerrel igazoltam. A csonkított flagellinek polimerizációs vizsgálatából megállapítottam, hogy a megfigyeléseink megfelelnek a hipotézisnek, miszerint az axiális irányban szomszédos flagellin alegységek N- illetve C-terminális régiói egymásba fonódó helikális kötegeket alkotva építik fel a filamentumok belső gyűrűjének szerkezetét. 3
4. A Ni-kötő variánsból épített filamentum struktúrát, egy hordozómátrix nélküli szenzorchip felületre rögzítettem, és felületi plazmon rezonancia spektroszkópia módszerrel vizsgáltam. A mérések alapján megállapítottam, hogy a mutáns filamentum felületi kötőhely sűrűsége elég nagy ahhoz, hogy megfeleljen a nehézfémion kötés optikai úton történő detektálására. 5. A flagellinmolekula D3 domént kódoló génszakaszát klónoztam és differenciális pásztázó kaloriméteres (DSC), valamint tripszines emésztési vizsgálattal megmutattam, hogy D3 domén stabil harmadlagos szerkezettel rendelkező önálló fehérje, amely nagyfokú ellenállást mutat a proteolitikus emésztéssel szemben. Ennek ismeretében a D3 domén kis mérete és stabil szerkezete lehetővé teszi, hogy alkalmazható legyen a későbbi receptor fejlesztések vázelemeként. 4
KÖZLEMÉNYEK, ELŐADÁSOK SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., VÉGH B.M., & VONDERVISZT, F. The Hypervariable D3 Domain of Salmonella Flagellin Is an Autonomous Folding Unit. Protein and Peptide Letters, 15, 54-57. (2008). SEBESTYÉN, A, VÉGH, B.M., SZEKRÉNYES, Á., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F. Nehézfémkötő flagellin alapú receptorok. Biokémia XXX/4. (2006). GUGOLYA, Z., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., DIÓSZEGHY, Z. & VONDERVISZT, F. Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Letters, 535, 66-70. (2003). MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z.,VÉGH B.M. VONDERVISZT, F. Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters, Vol. 580, 3916-3920. (2006). FECZKÓ, T., MUSKOTÁL, A., GÁL, L., SZÉPVÖLGYI, J., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F. Synthesis of Ni-Zn ferrite nanoparticles in radiofrequency thermal plasma reactor and their use for purification of histidine-tagged proteins, J. Nanoparticle Research, közlésre elfogadva. SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., GYIMESI, G., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Ni- and As-binding flagellin-based receptors E-MRS Spring Meeting, Strasbourg (France, 2007). KURUNCZI, S., NAGY, N., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing E-MRS Spring Meeting, Strasbourg (France, 2007). PAP, A. E., KURUNCZI, S., SEBESTYÉN, A., TÓTH, A. L., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein segments into porous silicon for biosensor application E-MRS Spring Meeting, Strasbourg (France, 2007). SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F.: Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok Műszaki Kémiai Napok 07 Veszprém, (2007). 5
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S. ÉS VONDERVISZT, F.: Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok Nanobiológia Miniszimpózium Pécs (2006). legjobb poszter díja SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P. & VONDERVISZT, F.: The FliH component of the flagellar export apparatus is a multizinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference. Budapest, Hungary (2005). SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., MUSKOTÁL, A., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P., VONDERVISZT, F.: A flagellumspecifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkező multi-cink fehérje. A Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa. Debrecen, (2005). KURUNCZI, S., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing. Hungarian Nanotechnolgy Symposium. Budapest, Hungary (2005). MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN A., VÉGH B., VONDERVISZT F.: A flagellinspecifikus FliS dajkafehérje jellemzése. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 8. Munkaértekezlete. Tihany (2003). MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, ELTE, OTDK Konferencia (2003). Kémiai és Vegyipari Szekcióban, a biokémia-biotechnológia tagozatában III. helyezés. MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY, Z., VONDERVISZT, F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 7. Munkaértekezlete. Keszthely (2002). VONDERVISZT, F., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIV. International Biophysics Congress, Buenos Aires, Argentina (2002). MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A., VONDERVISZT F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. A Magyar Biofizikai Társaság Molekuláris Biofizika Szekciójának szegedi szekcióülése (2002). 6
MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VIII. Országos Felsőoktatási Környezettudományi Diákkonferencia, Veszprém (2002). Környezeti Kémia Szekcióban Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium különdíja. MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VE, TDK Konferencia (2001). Kémiai és Vegyipari Szekcióban II. helyezés. 7