A citoszkeletális rendszer

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A citoszkeletális rendszer"

Eszter Rácz
9 évvel ezelőtt
Látták:

1 A citoszkeletális rendszer Az eukarióta sejtek dinamikus fehérje-vázrendszere, amely specifikus fehérjepolimer filamentumokból épül fel. Mikrofilamentumok Mikrotubulusok Intermedier filamentumok

fehérjepolimer filamentumokból épül fel.

2 Aktin a citoszkeletális rendszer fő fehérjéje Aktin monomer (G aktin): az eukarióta sejtek legnagyobb mennyiségben termelt fehérjéje 375 aa, 43 kda erősen konzerválódott ATP kötés és hidrolízis polimerizációra képes (F aktin)

mennyiségben termelt fehérjéje 375 aa, 43 kda erősen

3 Aktin filamentumok A polimerizáció szakaszai: a polimerizációs centrumok kialakulása (lag fázis) a filamentumok növekedése (log fázis) egyensúlyi állapot kialakulása átmérő: 7 nm, hossz: ~ μm alegységenként 2 kötőhely aszimmetrikus szerkezet: + és - vég alegységek 166º-ban elforgatva kettőshélix megjelenés (λ = 72 nm)

állapot kialakulása átmérő: 7 nm, hossz: ~ μm alegységenként 2 kötőhely

4 Aktin polimerizáció reverzibilis a két végen eltérő sebességgel folyik dinamikus egyensúlyi állapot alakul ki (monomer c c ) az ionerősséggel szabályozható az ATP-aktin gyorsabb polimerizációra képes a beépült alegységek az ATP-t lassan hidrolizálják Treadmilling (taposómalom): a két végre jellemző kritikus koncentrációk közötti koncentráció tartományban a + végen folyamatosan ATP-aktin épül be, a - végen ADPaktin válik le. A filamentum átlagos hossza nem változik.

ATP-t lassan hidrolizálják Treadmilling (taposómalom): a két végre jellemző kritikus koncentrációk közötti

5 A polimerizáció szabályozása Aktinkötő fehérjék: szabályozzák a filamentumok leépülését (pl. cofilin) gátolják a filamentumvégen a beépülést (sapkafehérjék: gelsolin Ca ++ aktiválás) elősegítik a GDP GTP cserét (profilin) az aktin filamentumok kölcsönhatását

cofilin) gátolják a filamentumvégen a beépülést (sapkafehérjék:

6 Aktin-kötegek és hálózatok A sejtekben az aktin filamentumok magasabb rendű szerkezeteket formálnak. Ezt kötegképző és hálózatformáló fehérjék segítik. A kötegek pl. a sejtnyúlványok képződésében fontosak, a hálózatok a plazmamembrán alatti sejtfelszínt erősítik.

Ezt kötegképző és hálózatformáló fehérjék segítik. A kötegek pl.

7 14 nm Aktin-kötegek Az aktin kötegekben párhuzamos szálak vannak keresztkötve aktinkötő fehérjék által. Aktin-kötegképző fehérjék: viszonylag kis méretűek és merev szerkezetűek legalább 2 kötődomént tartalmaznak meghatározzák a kötegek pakoltságát és mechanikai tulajdonságait általában külső jellel (Ca ++ ) vezérelhetők 40 nm Fimbrin (66 kda monomer): azonos polaritású szálakból szorosan pakolt köteget hoz létre α aktinin (2 x 102 kda dimer): lazább, flexibilis kötegeket képez

meghatározzák a kötegek pakoltságát és mechanikai tulajdonságait általában külső jellel (Ca ++ ) vezérelhetők 40 nm

8 Aktin hálózatok Hálózatképző fehérjék: nagyok és flexibilisek akár merőleges filamentumokat is rögzíthetnek dimer szerkezetűek Diamin: 280 kda dimer A dimerizációs és aktinkötő domének a molekula két végén találhatók, két hosszú flexibilis kar választja el őket.

Diamin: 280 kda dimer A dimerizációs és aktinkötő domének a

9 A miozin molekuláris motor A miozin molekuláris motor az aktinszálak mentén képes mozogni. Az ATP kémiai energiáját alakítja át mechanikai energiává, s közben erőt és mozgást generál. A miozin fejrészének szerkezete

10 Az izomsejt alapegysége a szarkomer Izomsejt miofibrillum szarkomer

11 A szarkomer szerkezete Z lemez M vonal Z lemez vastag filamentum vékony filamentum Az aktinszálakat a nebulin filamentumok stabilizálják. A titin óriásfehérje (3000 kda) a Z lemezt az M vonallal köti össze és az izom nyugalmi tenziójáért felelős.

12 A vastag filamentum felépítése A miozin szerkezete

13 Az akto-miozin komplexum A miozin fejek keresztkötéseket alakítanak ki a vastag és vékony filamentumok között.

14 A csúszó filamentum modell (Huxley, 1954) Az izomműködés során a vastag és vékony filamentumok elmozdulnak egymáshoz képest a szarkomer hossza megváltozik. Az elmozdulást a miozin motorfehérje generálja.

elmozdulnak egymáshoz képest a szarkomer hossza

15 In vitro motilitás vizsgálat

16 A miozin motorfehérje 500 kda oligomer fehérje 2 nehézlánc, 4 könnyűlánc nehézlánc: globuláris fejrész, hosszú helikális farokrész fejrész: aktin kötőhely, ATP kötőhely farokrész: helikális kötegképződés dimerizáció a fejrészekhez 1-1 könnyűlánc pár kötődik

farokrész fejrész: aktin kötőhely, ATP kötőhely farokrész:

17 A miozin működése ATP hiányában a miozin kötődik az aktinhoz ATP kötés fejrész leválik ATP hidrolízis konformációváltozás fejrész előre lendül A miozin fej új pozícióban kötődik P i disszociál P i leválása erőlökést indukál filamentum elmozdul, ADP leválik, eredeti konformáció helyreáll A miozin motorok az aktin filamentumok + vége felé haladnak. Az ATP hidrolízis biztosítja az elmozduláshoz szükséges energiát.

erőlökést indukál filamentum elmozdul, ADP leválik, eredeti konformáció helyreáll A miozin motorok az

18 A miozin működésének szabályozása A tropomiozin és a troponin fehérjék szabályozzák az izomműködést. A tropomiozin az aktinfilamentum árkába kötődik. A troponin 3 alegysége C (Ca ++ kötő), I (gátló), T (tropomiozin kötő) -kötődik az aktin tropomiozin komplexhez és megakadályozza az aktin-miozin kölcsönhatást. Magas Ca++ koncentráció hatására a troponin C konformációváltozása megszünteti a gátlást

A troponin 3 alegysége C (Ca ++ kötő), I (gátló), T (tropomiozin kötő) -kötődik az aktin

19 Sejtnyúlványok képződése

20 Mikrotubulusok Alapvető szerepet játszanak a sejtek alakjának meghatározásában és többféle sejtmozgásban. Részt vesznek a sejtorganellumok intracelluláris transzportjában és a mitózis során a kromoszómák szétválasztásában.

Részt vesznek a sejtorganellumok intracelluláris

21 A mikrotubulusok felépítése 25 nm átmérőjű merev, üreges csövek 13 tengelyirányú protofilamentum aszimmetrikus felépítés Tubulin fehérje: molekulatömeg 2 x 55 kda dimer: α és β alegység GTP kötés és hidrolízis GTP-β tubulin stabilizál Filamentumképződés mechanizmusa: treadmilling dinamikus instabilitás

22 A mikrotubulusok szerkezete

23 A mikrotubulusok polimerizációja Dinamikus polimerizációs egyensúly + végen a polimerizáció gyors, - végen lassú Ciklikusan váltakozó növekedési és fogyási fázisok (dinamikus instabilitás) Egy polimerizálódó filamentum egy sejtorganellumra erőt képes kifejteni A polimerizációt befolyásoló szerek (pl. kolhicin, taxol) fontosak a rákterápiában A mikrotubulusok növekedése a mikrotubulus-szervező centrumokból indul (γ tubulin) A polimerizációt a MAP fehérjék szabályozzák

25 Dinamikus instabilitás A lassú felépülést gyors depolimerizáció követi.

27 A sejtek alakjának meghatározása Sejtnyúlványok kialakítása

28 Mikrotubuláris motorok

29 A kinezin motorfehérje szerkezete 2-2 nehéz- (110 kda) és könnyűlánc (70 kda) Nehézlánc: N-terminális fejrész: mikrotubulus kötőhely, ATPáz aktivitás (motordomén) egymásba fonódó helikális farokrészek Könnyűláncok: célobjektum felismerése és megkötése a nehézláncok C-terminális részéhez kötődnek Rokonság a miozin motorfehérjével

30 A kinezin mozgása lépések hossza 8 nm ~ lépés/s + vég felé halad erőt képes kifejteni minden lépés során elbont egy ATP molekulát szorosan csatolt mechanikai és enzimatikus ciklus processzivitás

31 Hogyan mozog a kinezin? ATP binding to the leading head initiates neck linker docking catalytic core tightly docked neck linker detached neck linker tubulin heterodimer α-tubulin β-tubulin Neck linker docking is completed by the leading head, which throws the partner head forward by 160 Å toward the next tubulin binding site The trailing head hydrolyzes ATP to ADP-Pi The new leading head docks tightly onto the binding site The trailing head, which has released its Pi and detached its neck linker (red) from the core, is in the process of being thrown forward. Adapted from: Figure 1 in Vale & Milligan (2000) Science, Vol 288, Issue 5463, 88-95

32 A dienin motorfehérje szerkezete Óriásfehérje (2000 kda) 2-3 nehéz és számos könnyűlánc Nehézláncok végén globuláris ATP-kötő motordomén A molekula bazális része kötődik a szállítandó szubcelluláris struktúrához

33 Mit szállítanak a kinezinek és dieninek? Fig

34 Egyéb mikrotubuláris mozgások

35 Motorfehérjék általános jellemzése N-terminális globuláris fej: motordomén nukleotid kötés és hasítás, specifikus kötődés a (citoszkeletális) polimerhez C-terminális részen célobjektum kötőhelye ciklusos működés mechanikai ciklusonként egy nukleotid (ATP) hidrolízise Vizsgálati módszerek: in vitro motilitás próba lézercsipesz teljes visszaverődéses fluoreszcencia (TIRF)

36 Lézercsipesz Erőmérés lézercsipesszel

37 TIRF (Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia) A mikrotubulusok mentén haladó kinezin motorfehérjék

38 Rotációs motorok: ATP szintetáz Mitchell-féle kemiozmotikus hipotézis (1961): a mitokondriumokban lejátszódó respirációs folyamatok a belső membránon megjelenő protongradiens révén csatoltak az ATP szintézishez. Kísérleti igazolás: Mesterséges lipid vezikulába épített bakteriorodopszin ATP szintetáz rendszer megvilágítás hatására ATP szintézisre képes.

39 Az ATP szintetáz (F 1 F 0 ATPáz) felépítése F1 alegység: α 3, β 3, γ, δ, ε láncok α 3 β 3 hexamer gyűrűt képez γ az α 3 β 3 gyűrű tengelyében forog F0 alegység: a 1, b 2, c láncok membránba ágyazott c gyűrű (forgórész) protoncsatorna az a alegység belsejében Az F1 szerkezete:

40 Az ATP szintetáz kötődési állapot változásai A β alegység zárt és nyitott állapota:

41 Az F 0 C-gyűrű forgási mechanizmusa Az a alegység belsejében 2 elkülönült fél protoncsatorna található: A protonmozgás útvonala

42 Az ATP szintetáz forgásának kísérleti igazolása

43 Biológiai motorok (összefoglalás) Lineáris motorok: Aktin alapú motorfehérjék (miozinok) Mikrotubulus alapú motorfehérjék (dineinek, kinezinek, dynaminok) DNS alapú motorok (polimerázok) Rotációs motorok: F 1 F 0 ATP-áz Flagelláris motor

Hasonló dokumentumok

11/15/10! A CITOSZKELETÁLIS RENDSZER! Polimerizáció! Polimerizációs egyensúly! Erő iránya szerint:! 1. valódi egyensúly (aktin)" Polimer mechanika!

11/15/10! A CITOSZKELETÁLIS RENDSZER! 1. Mi a citoszkeleton?! 2. Polimerizáció, polimerizációs egyensúly! 3. Filamentumok osztályozása! Citoszkeleton : Eukariota sejtek dinamikus vázrendszere! Három fő