DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI ELEK PÉTER PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR KESZTHELY 2008
PANNON EGYETEM ÁLLAT- ÉS AGRÁRKÖRNYEZET-TUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA Iskolavezető: Dr. Anda Angéla Jogelőd: ÁLLATTENYÉSZTÉSI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Iskolavezető: Dr. Szabó Ferenc A KÓROS ZSÍRANYAGCSERÉBŐL ADÓDÓ VESZTESÉGEK CSÖKKENTÉSÉNEK LEHETŐSÉGE VÉDETT KOLIN ALKALMAZÁSÁVAL NAGY TEJHOZAMÚ TEHÉNÁLLOMÁNYOKBAN DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Készítette ELEK PÉTER Témavezető DR. HUSVÉTH FERENC Társ-témavezető DR. GAÁL TIBOR Keszthely 2008
1. A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI ÉS CÉLKITŰZÉSEI A genetikai előrehaladás és a takarmányozás fejlődése következtében a tehenek laktációs tejtermelése sokat növekedett az utóbbi néhány évtizedben. A nagy tejtermelésű állományokban a tehenek megfelelő energia- és táplálóanyag-ellátása különösen a laktáció kezdeti szakaszában jelentős problémát okoz. Ennek következménye, hogy a tejtermelés emelkedésével a kiesések, selejtezések aránya is megnövekedett. A kiesések fő oka az, hogy az ellést követően rohamosan növekvő energia- és táplálóanyag-igényét a tehén nem képes a felvett takarmányokból teljes egészében kielégíteni, ezért saját szöveteit elsősorban zsírszöveteit bontva fedezi a hiányt (Van Saun, 1991). A negatív energiamérleg időszaka gyakran már az ellést megelőzően megkezdődik (Van den Top és mtsai, 1995). Az ellést megelőző néhány napban megkezdődő intenzív lipidmobilizáció eredményeként a máj trigliceridtartalma jelentősen növekszik (Reid és Roberts, 1982) és az ellést követő két hét alatt tetőzik (Gruffat és mtsai, 1996). A lipidtartalom emelkedése csökkenti a glükoneogenezis és a karbamidszintézis intenzitását (Piepenbrink és Overton, 2003), ezáltal kedvezőtlenül hat az anyagcserére, anyagcsere-betegségek (ketózis, acidózis, zsírmáj szindróma) kialakulásához vezet. A trigliceridtartalmát a máj csak lipid fehérje komplexek, VLDL, formájában tudja kiválasztani, amelyek szintézisének egyik lehetséges limitáló tényezője a VLDL foszfolipid részét alkotó foszfatidil-kolin (lecitin; Zeisel, 1992). A foszfatidilkolinszintézis lehetséges szubsztrátjai a kolin, valamint a foszfatidil-etanolamin 1
és metionin. Ennek alapján feltételezhető, hogy a kolinellátás javítása fokozza a VLDL-szintézist, ezáltal csökkenthető a máj lipidtartalma. Az előzőekből kiindulva a doktori munkám alkalmával a bőtejelő tehenek kolin-ellátottságának javítása érdekében folytattunk tanulmányokat. E munka során két kísérletet végeztünk, amelyek célkitűzései a következők voltak: 1. kísérlet A takarmány kolintartalma a bendő mikrobiális aktivitásának következtében gyorsan lebomlik a bendőben, ezért a takarmányadag kolinkiegészítését védett kolinnal (RPC Rumen Protected Choline) kell végezni. A kolinellátás növelése szempontjából tehát fontos követelmény, hogy a takarmányban lévő kolin minél nagyobb hányada elkerülje a bendőbeli lebomlást, majd ezt követően az epésbélben megemésztődjön és felszívódjon. Az ismereteink hiányosak a különböző gyártók által előállított védett kolint tartalmazó termékek bendőbeli stabilitásáról, ezért első kísérletünkben az volt célunk, hogy egy in situ eljárást dolgozzunk ki e termékek bendőbeli stabilitásának mérésére és megvizsgáljuk öt kereskedelmi forgalomban kapható, kolint tartalmazó termék bendőbeli lebomlásának mértékét. 2. kísérlet A védett kolinetetéssel kapcsolatos kutatási eredmények korántsem teljesek és egybehangzóak. Ennek alapján fontosnak tartottuk, egy olyan vizsgálat elvégzését, amelynek során egyidejűleg tanulmányozhattuk a 2
védett kolinetetés hatását bőtejelő tehenek kolinellátására, a máj lipidanyagcseréjére, az anyagcserét legjobban jelző néhány paraméterre és a termelési eredményekre az elléskörüli időszakban. A nagyszámú adat lehetőséget teremtett számunkra az elléskörüli időszak lipidanyagcserében mutatkozó esetleges kapcsolatok feltárására. Ennek során az összes adat figyelembevételével megvizsgáltunk néhány máj- és vérparaméter közötti kapcsolatot. 2. ANYAG ÉS MÓDSZER Az első kísérletben négy bendőbeli lebomlás ellen védett (Procol-25, Norcol-25, Sintocol-25, Reashure ) és egy nem védett kolintermék (kolin-klorid szilikát vivőanyagon) bendőbeli stabilitását tanulmányoztuk az eredetileg fehérjék bendőbeli stabilitásának vizsgálatára Ørskov és McDonald (1979) által kialakított in situ módszerrel, amelynek mosási fázisát módosítottuk. Kísérletünkben az egyes termékekből 5g-ot tartalmazó, 40 µm pórusátmárőjű zsákokat három bendőfisztulás anyajuh bendőjében inkubáltuk 0, 2, 4, 8, 16, 24, 48 órán keresztül. A kísérlet idejére a juhokat egyedi ketrecben helyeztük el és napi 0.5 kg anyajuh táppal, valamint ad libitum fűszénával takarmányoztuk. A mosási fázist úgy módosítottuk, hogy az erőteljes mosás helyett a mintákat tartalmazó zsákokat 8 10 alkalommal 14-16 0 C-os hideg vízbe mártottuk, hogy azokat kíméletesen megtisztítsuk a bendőtartalomtól. A mosási fázis módosítására azért volt szükség, hogy minimálisra csökkentsük a zsákok tisztítása során fellépő kolinkimosódást. A tisztítást és szárítást követően 3
a rezidumok kolintartalmát közvetett úton, azok Kjeldahl módszerrel történő nitrogén meghatározása alapján mértük meg. A nitrogén alapon történő közvetett kolinmeghatározást az tette lehetővé, hogy a vizsgált termékek a kolinon és egy kevés mikrobiális eredetű nitrogénen kívül más nitrogéntartalmú anyagot nem tartalmaztak. Az azonos időponthoz tartozó értékeket Student féle t-próbával hasonlítottuk össze. A második kísérletben 32 többször ellett, ivarilag szinkronizált holsteinfríz tehenet használtunk. A teheneket a várható ellésük előtt 28 nappal két csoportba (védett kolin-kiegészítésben részesülő RPC-csoport és kolinkiegészítésben nem részesülő kontrollcsoport) osztottunk. A kontroll és az RPC-csoportot az ellésszám (3,31 ± 1,22 és 3,31 ± 1,28), az előző laktációs tejtermelés (9478 ± 1736 és 9474 ± 1687 kg) és a testkondíció (4,01 ± 0,38 és 4,05 ± 0,39) alapján azonosan állítottuk be. A kísérleti takarmányadagokat a várható ellés előtti 21. naptól a laktáció 60. napjáig etettük. Az RPC-csoport adagja az ellés előtti időszakban 25g, az ellést követően 50g kolint tartalmazott bendőbeli lebomlás ellen védett formában (Norcol-25, Nordos Italy, Olaszország). A kontrollcsoport fejadagja a kolin-kiegészítés kivételével minden más összetevőjében és beltartalmában megegyezett az RPC- csoportéval. A takarmányadagokat az NRC 2001-es ajánlásainak figyelembevételével állítottuk össze. A kísérlet során naponta mértük a tehenek szárazanyag-felvételt és a tejtermelését. A laktáció 7., 35. és 60. napján tejmintákat gyűjtöttünk a tejzsír, tejfehérje és a tejkolin meghatározása céljából. Az ellés előtt 21 nappal és a laktáció 7., 35. és 60. napján meghatároztuk a testkondíciót és biopsziás módszerrel májmintákat gyűjtöttünk, melyeknek 4
megállapítottuk az összlipid-, triglicerid- és glikogéntartalmát, valamint zsírsavösszetételét. A fent nevezett napokon, továbbá a laktáció 21. napján vérmintákat gyűjtöttünk. A teljes vérből meghatároztuk az ammónia tartalmat, a plazmából a glükóz, szabadzsírsav (NEFA), ß- hidroxi-vajsav (BHB), triglicerid (TG), koleszterin (TCh), karbamid és inzulin tartalmat, valamint az AST aktivitását. Az eredményeket az SPSS 9.0 statisztikai programcsomag segítségével értékeltük, amely alkalmával az időbeli tendenciákat is figyelembevevő generalizált lineáris modell (GLM) eljárást alkalmaztuk. Az egyes mutatók közötti összefüggések feltárását regresszióanalízissel végeztük, melynek során mindkét csoport adatait figyelembe vettük. 3. EREDMÉNYEK 1. kísérlet Kolintermékek bendőbeli stabilitásának vizsgálata A vizsgálatban használt egyes kolintermékek között már az inkubáció első néhány órájában jelentős különbségeket figyeltünk meg. A nem védett kolin jelentős része már az óvatos vízbemártások során kioldódott a zsákokból és az eredeti mennyiség 92,7±4,3%-a kioldódott az inkubáció első két órájában. Mind a négy bendővédett forma stabilitása szignifikánsan (P<0,05) felülmúlta a nem védett termékét, de a védett termékek lebomlása között is szembetűnő különbségek mutatkoztak, különösen az inkubáció kezdeti óráiban. A Sintokol-25 szignifikánsan gyorsabban bomlott le, mint a másik három védett termék. A Procol-25 5
és a Norcol-25 bendőbeli lebomlása az inkubáció teljes idején azonos volt. A Reashure bendőbeli stabilitása volt a legnagyobb, mert a vizsgálat minden egyes mérési időpontjában szignifikánsan (P<0,05) kevesebb kolin bomlott le belőle, mint bármely másik termékből. 2. kísérlet A védettkolin (RPC) hatása tejelő tehenek termelési mutatóira és anyagcsereparamétereire Az ellést megelőzően a testkondíció mindkét csoportban az optimális értéknél magasabb volt. A védett kolinetetés nem befolyásolta a tehenek szárazanyagfelvételét és testkondícióját. A kolinkiegészítés hatására szignifikánsan (P<0,001) és jelentős mértékben (+4,41 kg/nap) növekedett a tejtermelés és az FCM termelés (+2,5kg/nap; P<0,001). A tejzsír- és tejfehérje-termelés a kolint fogyasztó tehéncsoportban magasabb volt a kontrollhoz képest (P<0,05 és P<0,001). A tej összes kolinkoncentrációja és a tejjel ürített összes kolin mennyisége a laktáció előrehaladásával mindkét csoportban növekedett, de mindkét mutató értéke szignifikánsan (P<0,001) magasabb volt az RPC-csoportban a kontrollhoz viszonyítva. A vizsgált vérparaméterek közül a glükóz-, a szabad zsírsav- (NEFA), a koleszterin- és a karbamidkoncentráció, valamint az AST-aktivitás értékei nem változtak a védett kolinetetés eredményeként. A ketonanyagcserét tükröző ß-hidroxi-vajsav (BHB) koncentráció értéke szignifikánsan (P<0,05) alacsonyabb, a triglicerid koncentráció szignifikánsan (P<0,05) magasabb volt az RPC-csoportban. A plazma ammóniakoncentrációja 6
alacsonyabb (P<0,10), az inzulinkoncentráció magasabb (P<0,10) értékek felé tendált a védett kolinkiegészítés hatására. A védett kolinetetés szignifikánsan (P<0,01) csökkentette a máj összlipidés triglicerid-koncentrációját, valamint az összlipid:glikogén és a triglicerid:glikogén arányát (P<0,05), ugyanakkor a glikogénkoncentrációját nem befolyásolta. A májban található zsírsavak közül a C14:0, a C16:0 és a C18:1n-9 aránya az ellést követően gyorsan emelkedett az ellés előtti értékhez viszonyítva és a kontroll csoportban magasabb (P<0,01) szinten volt az RPC-t fogyasztókhoz képest. A máj zsírsavai közül a C18:0, a C18:2n-6 és a C20:4n-6 aránya a védett kolint fogyasztó csoportban szignifikánsan (P<0,001; P<0,01 és P<0,05) magasabbnak bizonyult, mint a kontrollban. Az egyes vizsgált mutatók közül a máj összlipid- és trigliceridtartalma között szoros, pozitív (R 2 =0,938) kapcsolat mutatkozott. A máj összlipid:glikogén aránya és a plazma BHB tartalma, a plazma NEFA:összkoleszterin aránya és a máj összlipidtartalma közepes erősségű (R 2 =0,47 és R 2 =0,535) pozitív, lineáris, a plazma inzulin és a máj glikogéntartalma között közepes erősségű (R 2 =0,423), pozitív, négyzetes kapcsolat mutatkozott. 7
4. KÖVETKEZTETÉSEK Kísérleteink eredményei alapján a fehérjék bendőbeli stabilitásának vizsgálatára kialakított Ørskov és McDonald (1979) módszer a mosási fázis módosítása után alkalmas a védett kolint tartalmazó termékek bendőbeli stabilitásának összehasonlítására. Az összehasonlítás során az egyes termékek bendőbeli stabilitásában lényeges különbségek mutatkoznak, ezért az in situ stabilitásvizsgálat elvégzése új védett kolintermék bevezetése esetében javasolt. Az elléskörüli időszakban etetett védett kolin növeli a tejtermelést, a napi tejzsír- és tejfehérje-termelést, a tejfehérje koncentrációját, ugyanakkor a testkondíciót és a takarmányfelvételt nem befolyásolja. A tejfehérjenövekmény valószínűleg annak az eredménye, hogy a kolinkiegészítés hatására javul a tehenek kolinellátottsága, ezáltal kevesebb metionint használ fel a szervezet a kolin és foszfolipid igény fedezésére. Kísérletünkben az elsődleges limitáló aminosav a metionin volt, ezért a metionin többlet feltételezhetően a tejfehérje szintézisére fordítódott. A védett kolin kiegészítés hatására növekszik a tej kolinkoncentrációja és a tejjel kiválasztott kolin mennyisége, javul a tehenek kolinellátottsága. Az elléskörüli időszakban a védett kolinetetés bőtejelő tehenek anyagcseréjére gyakorolt hatását a vér- és májparaméterek változásával nyomon követve, magyarázatot kaphatunk a tejtermelésben tapasztalt növekedésre. A kolinkiegészítés hatására a máj összlipid- és trigliceridtartalma szignifikánsan kisebbnek mutatkozik, amely az 8
intenzívebb VLDL-szintézis és ezáltal nagyobb máj triglicerid kiválasztás eredménye. Az alacsonyabb májlipid koncentráció kedvezőbb anyagcsere-folyamatokat eredményezhet a májban, csökken a plazmában a ketonanyagok mennyisége. A máj lipidtartalmában bekövetkezett elléskörüli változások megváltoztatják a májlipidek zsírsavösszetételét, ami annak az eredménye, hogy a máj a beáramló zsírsavakat eltérő arányban hasznosítja az energiatermelő folyamatokban és a VLDL szintézishez. Ennek a mechanizmusnak a meghatározása további kísérletek elvégzését teszi szükségessé. A vizsgált mutatók közötti kapcsolatok rávilágítanak a metabolikus összefüggésekre, továbbá lehetőséget nyújtanak arra, hogy a plazma mutatóinak változásából következtethessünk a májban zajló folyamatokra. Az elléskörüli időszakban a védett kolinetetés a nagy genetikai potenciállal rendelkező tehenek tejtermelését növeli a laktáció első hatvan napjában azáltal, hogy az anyagcsere folyamatokat kedvezően befolyásolja. A védett kolin etetését a nagyobb termelési eredmények elérése és az elléskörüli időszakban a lipidanyagcserében bekövetkező kóros változások, anyagcsere betegségek megelőzése, valamint azok gazdasági kártételének csökkentése érdekében minden bőtejelő állományban javasoljuk, különösen akkor, ha az ellés előtt lévő tehenek jelentős túlkondícióban vannak. 9
5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. A kereskedelmi forgalomban kapható, különböző gyártók által előállított védett kolintermékek bendőbeli stabilitása jelentős eltéréseket mutat. Ezért ajánlatos egy-egy nagyobb tétel beszerzése előtt, vagy termékváltás során a lebonthatósági értékeket meghatározni. Erre a célra az eredetileg a fehérjék bendőbeli lebomlásának tanulmányozására kifejlesztett in situ technika a mosási fázis módosítását követően alkalmas, könnyen alkalmazható, viszonylag olcsó eljárás 2. Az elléskörüli időszakban etetett védett kolin a tejtermelést jelentős mértékben növeli, ha az ellés előtti testkondíció nagyobb, mint 4,0. A védett kolinetetése csökkenti a metionin felhasználását a kolin szintéziséhez, ezáltal növeli a tejfehérje termelést, ha az adagban az elsődlegesen limitáló aminosav a metionin. A tejkolin és a tejjel kiválasztott kolin a kolinellátás jó mutatója, ezért a laktáció előrehaladásával növekvő tejkolin-koncentráció és tejjel kiválasztott kolinmennyiség az elléskörüli néhány nap korlátozott kolin- és foszfolipid-ellátására utal. 3. A kolin-kiegészítés eredményeként mérséklődik a májban a lipidakkumuláció az intenzíven tejelő tehenekben az energiahiányból fakadó kritikus időszakban. A védett kolin etetése az ellést követő intenzív zsírmobilizáció idején csökkenti a májban a mirisztinsav, a palmitinsav és az olajsav, ugyanakkor növeli a sztearinsav, a linolsav és az arachidonsav arányát. 10
4. Az elléskörüli időszakban etetett védett kolin csökkenti a plazma ketonanyag koncentrációját azáltal, hogy csökkenti a májban az összlipid:glikogén és a triglicerid:glikogén arányt. A plazma inzulin szintje és a máj glikogén tartalma között kapcsolatot figyeltünk meg. A májglikogén szint emelkedése a plazma inzulinkoncentrációjának emelkedését okozza. 5. Az elléskörüli időszakban, kóros májelzsírosodás esetén a védettkolin etetés hatására a vér ammóniakoncentrációja csökkenő tendenciát mutat, mert a máj lipidtartalmának csökkentése által intenzívebbé válik a karbamidszintézis folyamata. 6. IRODALOMJEGYZÉK Gruffat, D., Durand, D., Graulet, B., Bauchart, D. (1996): Regulation of VLDL synthesis and secretion in the liver. Reprod. Nutr. Dev. 36:375-389. Ørskov, E. R., McDonald, I. (1979): The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to the rate of passage. J. Agric. Sci. 92: 499-503 Piepenbrink, M. S., Overton, T. R. (2003): Interrelationship of hepatic palmitate and propionate metabolism, liver composition, blood metabolites, and cow performance. J. Dairy Sci. 86 (Suppl. 1): 148. (Abstr.) 11
Reid, I. M., Roberts, C. J. (1982): Subclinical fatty liver in dairy cows. Irish Vet. J. 37:104-110. Van den Top, A. M., Wensing, T., Geelen, M. J. H., Wentink, G. H., Van t Klooster, Beynen, A. C. (1995): Time trends of plasma lipids and hepatic triacylglycerol synthesizing enzymes during postpartum fatty liver development in dairy cows with unlimited access to feed during the dry period, J. Dairy Sci. 78: 2208-2220. Van Saun, R. J. (1991): Dry cow nutrition: the key to improving fresh cow performance. In Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. Vol. 7. W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA pp. 599-620 Zeisel, S. H. (1992): Choline: an important nutrient in brain development, liver function and carcinogenesis. J. Am. College Nutr. 11: 473-481. 12
7. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ TUDOMÁ- NYOS PUBLIKÁCIÓK Lektorált folyóiratban megjelent angol nyelvű publikációk Elek P. Husvéth F. (2007): In situ evaluation of the ruminal stability of different choline products. Állatenyésztés és Takarmányozás, 56: 589-595 Elek P. Newbold J. R. Gaál T. Wágner L. Husveth F. (2008): Effects of rumen-protected choline supplementation on milk production and choline supply of periparturient dairy cows. Animal, Közlésre elfogadva Lektorált folyóiratban megjelent magyar nyelvű publikációk Elek P. Karcagi R. Newbold. J. Gaál T. Wágner L. Husvéth F. (2008): Vérplazmamutatók és a máj lipidtartalma közötti összefüggések vizsgálata nagy tejhozamú tehenekben. Magyar Állatorvosok Lapja, 130: 323-327. Konferenciakiadványban megjelent angol nyelvű publikációk Elek P. Husvéth F. Gaál T. (2004): Effect of rumen protected choline (RPC) on liver metabolism in the periparturient dairy cow. J. Dairy Sci., 87 Suppl. 1. p. 343. Gaál T. Stadler K Husvéth F. Elek P. Ribiczeyné Sz. P Reiczigel J. (2004): Liver free radical, lipid and glycogen content in dairy cows around calving. Vet. Clin. Path. 33. p. 259. Elek P. Gaál T. Wágner L. Newbold J. R. Husvéth F. (2007): Effect of rumen protected choline supplementation on liver metabolism in periparturient dairy cows. 13. ICPD Conference Proceedings, p. 132. Konferenciakiadványban megjelent magyar nyelvű publikációk Elek P. Husvéth F. (2003): Különböző kolin források bendőbeli stabilitásának összehasonlítása in-sacco módszerrel. IX. ITF CD-ROM, (205) 81-85. 13
Elek P. Husvéth F. Gaál T. (2003): A testkondíció, a máj lipid- és glikogén tartalmának változása védett kolin etetés hatására. 14. Magyar Buiatrikus Konferencia Kiadványa, pp. 68-76. Elek P. Husvéth F. Gaál T. (2004): Védett kolin hatása tejelő tehenekben 1. a lipidanyagcsere változásai. MTA Állatorvos-tudomanyi Bizottsag Akadémiai Beszámoló, 31. p. 13. Gaál T. Ribiczeyné Sz. P. Stadler K. Balogh K. Mézes M. Husvéth F. Elek P. Reiczigel J. Papp G. (2004): Védett kolin hatása tejelő tehenekben 2. a lipidperoxidációs és az antioxidáns mutatók változása. MTA Állatorvos-tudomanyi Bizottsag Akadémiai Beszámoló, 31. p. 12. Elek P. Husvéth F. Gaál T. (2004): A védett kolin etetés hatása tejelő tehenek zsír-anyagcseréjére. X. ITF CD-ROM, (205) 91-95. Elek P. Husvéth F. Gaál T. (2004): Tejelő tehenek kolin ellátottsága és hatása a termelési mutatókra. 15. Magyar Buiatrikus Konferencia Kiadványa, pp. 264-269. Egyéb publikációk Elek P. Husvéth F. Gaál T. (2003): Hepatoprotectors: The case for choline. Proceedings of Provimi Ruminant Training, 43-49. Elek P.(2004): Detection of subclinical metabolic disorders in dairy herds. Proceedings of Provimi Ruminant Training, 62-67. 14