KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA. Géntoxikológia - mutagenitás vizsgálata. Molnár Mónika, Feigl Viktória, Gruiz Katalin

Átírás

1 KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA Géntoxikológia - mutagenitás vizsgálata Molnár Mónika, Feigl Viktória, Gruiz Katalin Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

2 TEMATIKA Géntoxikológia definíció Modellrendszerek Mutagenitás Mutációs tesztek Definíció Alapelv Példák Page 2

3 GENETIKA Kiemelkedő szerep Alapvető célja: az öröklődés törvényszerűségeinek feltárása gének és géntermékek biológiai funkciójának meghatározása Sydney Brenner -Orvosi Nobel díj, 2002 A szervfejlődés és a programozott sejthalál genetikai szabályozására vonatkozó felfedezésért kapták Sydney Brenner angol, Robert H. Horvitz amerikai és John E. Sulston angol kutatók I almost forgot to say that genetics will disappear as a separate science because, in the 21st century, everything in biology will become gene-based, and every biologist will be a geneticist. Sydney Brenner Page 3

4 GÉNTOXIKOLÓGIA Géntoxikológia Környezettoxikológia Géntoxikológia (1960) Fizikai, kémiai biológiai ágensek Genetikai hatása a toxikus anyagoknak testi és ivari sejtek örökítő anyagára hat, megváltoztatja a DNS által tárolt genetikai információt Mutagenitás genotoxicitás Minden mutagén anyag genotoxikus, de nem minden genotoxikus anyag mutagén! (Maradandó károsodás?) Page 4

5 MUTAGÉN VAGY KARCINOGÉN? A géntoxikológia egyik központi dogmája kimondja, hogy a mutációt okozó vegyületek egyben rákkeltőek is. DE a mutagenitás nem feltétlenül jár együtt a karcinogenitással. OKOK: A vegyületek szervezetbe kerülése, metabolizálódása a sejten belülre jutása számtalan menekvési utat foglal magában. További tény, hogy 3 7 egymást követő mutáció vezet el ahhoz az iniciált sejthez, ami a jóindulatú daganat kiindulási pontja. Page 5

6 MUTAGÉNEK Ionizációs sugárzások (pl. -, -, -sugárzás, röntgensugárzás) Nem ionizációs sugárzások (pl. UV sugárzás) Kémiai mutagének gének mutabilitását növelő vegyi anyagok Biológiai mutagének Page 6

7 MUTAGÉNEK (GAP2000) GAP2000 (Genetic Activity Profile) volt a legjelentősebb adatbázis, amely az EPA és az IARC (Nemzetközi Rákkutatási Ügynökség awho része) adataiból Waters és mtsai (2000) hoztak létre. Mutagének listája: CMR listák ( 62/cmr_report_en.pdf, Enviromental Mutagen Information Center Data Base-ben lehet tájékozódni. Page 7 A GAP2000 adatbázisban található mutagén vegyületek megoszlása felhasználási területük szerint

8 CMR EU ECHA Page 8

9 GENETOX Page 9

10 MODELLRENDSZEREK, MODELLORGANIZMUSOK Az EMBER? NEM hosszú generációs idő kicsi egyedszám (egy keresztezésből) nem mutagenizálható nem keresztezhető szabadon Valójában igen: természetes mutagenezis (betegségek) mutánsbankok (kórházakban) családfák genographic.nationalgeographic.com Page 10

11 MODELLRENDSZEREK, MODELLORGANIZMUSOK MEGOLDÁS GENETIKAI MODELLSZERVEZETEK Génfunkciók és az egyedfejlődés alapvető kérdéseinek tanulmányozása genetikai modellszervezeteken Dolan DNA Learning Center - MODELLORGANIZMUSOK A GENETIKAI KUTATÁSOKBAN Page 11

12 MODELLORGANIZMUSOK Modellorganizmus: Kutatások célpontja; biológiai jelenségek vizsgálata betekintés más szervezetek életfolyamataiba Sok adatot nyerjünk Evolúciós törzsfában sarkalatos hely Jó kísérleti alany Könnyű tenyészthetőség, Rövid életciklus, Genom speciális tulajdonságai (pl. kismértékben tartalmaz nem kódoló DNS-t) Élőlény mérete Page 12

13 MODELLORGANIZMUSOK Egyéb modellszervezetek: Bakteriofágok (λ fág,t2,t4) Dictyostelium discoideum a sejtkommunikáció, sejtdifferenciálódás és programozott sejthalál tanulmányozása Aplysia ( tengeri nyúl ) memória kutatás (Eric Candel Nobel díj, 2000) Patkány - viselkedés és droghatások kutatása Macska látás kutatás Kutya szívizom kutatás (elektrofiziológia) Majmok látás- és viselkedés kutatás GFP (Green Fluoresent Protein) (Kémiai Nobel-díj, 2008) Page 13

14 Page 14 Mutáció, mint végpont Mutagenitási tesztek

15 Mutáció Mutáció az információs rendszer ugrásszerű, öröklődő megváltozása. Fizikai, vagy kémiai hatásra bekövetkező maradandó módosulások a genomban. Hugo De Vries vezette be a mutáció fogalmát A ligetszépe különböző változatainak tanulmányozása A hirtelen (egyik generációról a másikra) megjelenő új jellegek mutáció következtében alakulnak ki. "Kísérletek és megfigyelések a fajok keletkezéséről a növényvilágban" Page 15

16 Mutáció típusai Pontmutáció (1 bázis v. bázispár) kromoszómamutáció Szerkezeti (változás a gén nukleotid tartalmában)- átrendeződő (gének genomon belüli áthelyeződése) Spontán (háttér) indukált (rendellenes környezeti feltételek) Genetikai kontroll: néhány gén mutabilitását más gének okozzák Szomatikus gametikus (A szomatikus (=a test sejtjei) mutációk nem jutnak el a következő generációba, nem vezethetnek öröklődő a betegséghez!) Előre irányuló (a vad típusból rendellenes fenotípus) reverz (back) mutáció Page 16

17 Back mutáció Reverzió vagy back mutáció. A megváltozott DNS szekvencia visszaalakul újabb mutáció következtében úgy, hogy ismét funkcióképes lesz a kódolt fehérje, azaz az egyed vad fenotípussal fog ismét rendelkezni. A revertánsok a vad fenotípus megjelenése miatt vehetők észre, szelektálhatók ki egy mutáns populációból. exakt reverzió - eredményeként a vad típusú szekvencia visszaáll (DNS szinten is) equivalens reverzió - a kodon úgy változik meg, hogy vad típusú fehérje keletkezik ismét, de DNS szinten nem áll vissza az eredeti szekvencia (tehát egy silent mutáció a reverzió eredménye - az eredeti DNS szekvenciával összevetve) Page 17

18 Mutagenitási tesztek Géntoxikológiai tesztek: a szennyezőanyagok mutagén hatását vizsgálják A bioteszt végpontja a mutáció. A géntoxikológiai tesztekben egy konkrét vegyületnek az örökítő anyagra gyakorolt hatását vizsgálják. Először in vitro tesztek - kevésbé idő- és költségigényesek, mint az in vivo tesztek (Ha az első vizsgálatok során mutagénnek mutatkozik a vizsgált minta, sok esetben nem kerül sor a további tesztekre, így elkerülhető az élő állatok felesleges felhasználása) In vivo tesztek - az in vitro tesztek pozitív eredményei után. (A szervezet komplex enzimkészlete, teljes metabolizációs rendszere - befolyásolhat ) Page 18

19 Mutagenitás - tesztrendszerek Genotoxicitás mérése: többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer (genotoxicitási tesztek): bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli) eukarióta egysejtűek (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster) gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak) növények (lóbab, árpa, vöröshagyma) in vivo (egér, hörcsög, patkány) Mutagenitás mérőszáma: mutációs ráta, mutációs együttható (a mutáns sejtek vagy egyedek számát adja meg az összes mutagén hatásnak kitett sejt vagy egyed számához viszonyítva). Page 19

20 Mutagenitási tesztek Leggyakoribb géntoxikológiai tesztek Ames teszt SOS kromoteszt Mutatox teszt Mikronukleusz teszt A mutagenitási tesztek alkalmazási gyakorisága White és Claxton (2004) nyomán Page 20

21 SOS kromoteszt Az SOS Chromotest egy Escherichia coli törzset alkalmaz (PQ37), melyben az SOS operon egy β- galaktozidáz operonnal van összeépítve. Az SOS operon az SOS javítórendszer szabályozója, mely a károsodott DNS helyreállításáért felel. Mutáció hatására az SOS javító mechanizmus aktiválódik. Az SOS javítás folyamataiért felelős enzimek szintézise együtt jár a -galaktozidáz transzlációjával. A -galaktozidázhoz megfelelő szubsztrátot adva színes terméket kapunk, amely kolorimetriásan meghatározható. Page 21

22 Mutatox teszt A Mutatox teszt Photobacterium phosphoreum (Aliivibrio fischeri) sötét mutánsát használja. A tesztorganizmus mutagén hatásra visszanyeri lumineszkáló képességét. A lumineszcencia luminométerrel detektálható. A vizsgált minta mutagenitásának mértéke arányos a revertált (újra a vad típus tulajdonságait mutató) baktérium fénykibocsátásával. A teszt nagy előnye, hogy mindössze 2 3 óra szükséges az elvégzéséhez. Page 22

23 Reverz mutációs tesztek Mutációt tartalmazó organizmussal (baktériummal) A mutagén hatású anyagok a tesztelésekben használt, eleve mutációt tartalmazó baktériumokban pontmutációt indukálva (revertálva a fennálló mutációt) helyreállítják azok kieső aminosav-szintetizáló képességét. A reverzió populációt érintő gyakorisági értéke arányos a mutagén hatással. A baktérium reverz mutációs tesztben használt baktériumtörzsek auxotróf mutánsok. Egy-egy aminosavat kifejezetten igényelnek a szaporodásukhoz, mivel azt nem képesek szintetizálni. A Salmonella typhimurium törzsek esetében hisztidin, az Escherichia coli WP2 esetében triptofán. Page 23

24 Reverz mutációs tesztek ELV Az auxotróf mutáns (fejlődésre csak bizonyos készen kapott anyagok felvételével képes) baktériumok - nem képesek minimál táptalajon növekedni. Mutagén anyag hatására prototróf (vad típusú) baktériumokká revertálnak Növekedés minimál táptalajon A tesztben felhasznált baktériumok több olyan mutációt is tartalmaznak - a mutációs eseményekkel szembeni érzékenységük. Page 24

25 Ames teszt Leggyakrabban alkalmazott módszer. Bruce N. Ames: az Ames teszt, a Salmonella mutagenitási teszt kifejlesztője Hisztidin auxotróf Salmonella typhimurium törzs - mutagén hatásra elveszti auxotróf jellegét, vagyis hisztidint nem tartalmazó táptalajon is képes növekedni. Előnye: hatalmas adatbázis az eddig vizsgált anyagokkal kapcsolatos eredményekről megkönnyíti a további kísérletek tervezését. Az összehasonlító vizsgálatok az Ames tesztet találták a legérzékenyebbnek. Új módszer -Ames MPF teszt, mely 96 lyukú mikrolemezt alkalmaz. Ez gyorsabb, költség- és anyagkímélőbb a hagyományos tesztmódszernél, viszont a teszthez használt baktériumok azonosak, így a kapott eredmények összevethetőek a korábbi irodalmi adatokkal. Page 25

26 Ames teszt A módszer TA98, TA100, TA1535, TA97 és/vagy TA1537 Petri-csészébe hisztidin mentes táptalajt öntenek. A táptalaj felszínére szélesztik a baktériumokat. A táptalaj közepébe lyukat fúrnak- vizsgálandó anyag A gátló anyag a táptalajba diffundál - különböző koncentrációban érintkezik a baktériumokkal. Ha a mutagén, akkor mutációkat indukál. A hisztidin-auxotrófia reverziója nyomán baktériumtelepek képződnek. Minél több telep annál erősebb a vizsgált szer mutagén hatása. S9-mix: létrehozza a vizsgálandó vegyület metabolit sorát (metabolikus aktiválás; PCB) Page 26

27 Salmonella teszttörzsek Page 27

28 AMES teszt továbbfejlesztett módszer A lemez zsebeiben hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget, amit a tápközegbe helyezett ph-indikátor festék (brómkrezol lila sárgulása) jelez. Page 28

29 Mikronukleusz teszt A mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén. A mag mellett elkülönülten fordulnak elő. Osztódásnál egyik utódsejtmagba sem képesek integrálódni. A mikronukleusz tesztek kromoszóma mutációk kimutatására alkalmasak. Page 29

30 Mikronukleusz teszt Vicia faba A Vicia faba (lóbab) másodlagos gyökércsúcsában lévő sejtekben található mikronukleuszok detektálásán alapszik. A mikronukleusz a sejt citoplazmájában láthatóvá válik a kromoszómatörés (klasztogén anyagok hatása), vagy a mitótikus orsó működési zavarának eredményeként (aneugén hatás). A módszer: sejtek felszaporítása kísérleti anyag koncentrációs sorával való kezelés, kontrollok sejt preparátum készítés, festés mikronukleuszok száma az összes sejthez viszonyítva (követelmények ) A mikronukleusz gyakoriságot a kontroll gyökérsejtek alapján határozzuk meg. Page 30

31 További mutagenitási tesztek Allium cepa kromoszóma aberrációk vizsgálata gyökérszőrökből Arabidopsis (lúdfű) növény klorofill-hiányos mutáns embrióit vizsgálják Drosophila melanogaster A kromoszómák kromatidáinak felépülési zavaraiból eredő (festődési) rendellenességek kimutatására szolgál a testvérkromatid kicserélődések (sister-chromatid exchange, SCE) gyakorisága Page 31

32 EGÉRFOLT TESZT 1. In vivo vizsgálat egéren Fejlődő embriókat kezelése a vizsgált vegyülettel A célsejtek a melanoblasztok, acélgének pedig azok, amelyek a hátszőrzet pigmentációjáért felelősek. Fejlődő embriók -több, a szőrszínt kódoló génre heterozigóták. Ha valamely pigmentsejt egy ilyen génjében mutáció következik be, vagy elvész a domináns allél (különböző genetikai események hatására), az utódsejtben a recesszív fenotípus jelenik meg, aminek az a következménye, hogy a születő egér szőrzete egy foltban eltérő színű lesz. Page 32

33 EGÉRFOLT TESZT 2. Foltokkal született mutáns egerek száma Gyakoriságukat összehasonlítása a csak oldószerrel kezelt embriókból keletkező utód nemzedékben előforduló foltosodási gyakorisággal. A magzati sejtek feltételezett szomatikus mutációinak kimutatására alkalmas Page 33

34 EGÉRFOLT TESZT 2. ELEMZÉS Az utódokat kóddal látják el, és a születés utáni harmadik és negyedik hét között megszámolják foltjaikat: a) fehér foltok a hasfal középvonalától számított 5 mm-en belül, amelyek feltehetőleg a sejtpusztulás következményei (WMVS); b) sárga, agouti-szerűfoltokat az emlők, a nemi szervek, a torok, a váll és a lágyék területein, valamint a homlokon, amelyek valószínűleg a hibás differenciáció (MDS) következményei; és c) pigmentált és fehér foltokat véletlenszerűen elszórtan a szőrzeten, amelyek valószínűleg szomatikus mutáció (RS) következményei. Genetikai szempontból csak az utolsó, az RS játszik szerepet. Új irányvonalak -3R Page 34

35 Irodalom, források Körinfo adatbázis: DNA learning center OECD tesztek adatbázisa: Test Guidelines for the Testing of Chemicals William D. Stanfield: Genetika. Elmélet és gyakorlat. Panem-McGraw-Hill, 1997 Gruiz, K., Horváth, B. és Molnár, M. (2001) Környezettoxikológia, Vegyi anyagok hatása az ökoszisztémára, Műegyetemi Kiadó, Budapest Bokán Katalin, Fejes Ágnes, Soós István, Fekete Gábor és Darvas Béla (2009) Mutagenitási tesztek és egyes növényvédő szerek mutagén mellékhatása. Növényvédelem 45(9), Ember István (szerkesztő): Környezet-egészségtan (Dialóg Campus Tankönyvek) Dialóg Campus Kiadó, Budapest-Pécs Dr. Nagy Tibor: A légszennyező anyagok élettani és az ökoszisztémára gyakorolt hatásai. Szolnok levegőminősége. Közép-Tisza vidéki Környezetvédelmi, Természetvédelmi és Vízügyi Felügyelőség, Levegőtisztaság-védelmi és Zajellenőrzési Osztály; Szolnok, április Page 35

36 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!