Sejtek rosszindulatú elfajulásának génektől független szabályozása a trikarbonsav ciklus deuteriumcsökkentő vízcsere reakcióin keresztül

Átírás

1 Medical Hypotheses 87 (2016) Medical Hypotheses journal homepage: Sejtek rosszindulatú elfajulásának génektől független szabályozása a trikarbonsav ciklus deuteriumcsökkentő vízcsere reakcióin keresztül László G. Boros a,b,c, *, Dominic P. D Agostino d, Howard E. Katz e, Justine P. Roth f, Emmanuelle J. Meuillet g,h, Gábor Somlyai i a Kalifornia Egyetem, Los Angeles Orvostudományi Kar, Gyermekgyógyászati Endokrinológia, Los Angeles Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok b Kalifornia Egyetem, Los Angeles Orvosbiológiai Kutatóintézet, Kikötői Orvosi Központ (LA BioMed), Torrance, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok c SiDMAP, LLC, Los Angeles, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok d Molekuláris Farmakológiai és Élettani Intézet, Hiperbárikus Orvosi Kutatóközpont, Morsani Orvosi Kar, Dél- Floridai Egyetem, Tampa, Florida, Amerikai Egyesült Államok e Anyagtudományi és Mérnöki Intézet f Szervetlen Kémiai Intézet, Johns Hopkins Egyetem, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok g Arizona Egyetem Rákkutató Központja és h Táplálkozástudományi Intézete, Arizona Egyetem, Tucson, Arizona, Amerikai Egyesült Államok i HYD Rákkutató és Gyógyszerfejlesztő Kft., Budapest, Magyarország, EU CIKK INFORMÁCIÓ Cikktörténet: Bírálatra érkezett: Augusztus 21, 2015 Közlésre elfogadva: November 23, 2015 Elsevier Inc. nyitott formában elérhető (Open Access) közleménye: CC BY-NC-ND license ( /Published by Elsevier Ltd. *Kapcsolat: Kalifornia Egyetem Los Angeles Orvostudományi Kar, 1124 West Carson Street, RB-1, Torrance, CA 90502, USA boros@labiomed.org, boros.laszlo@yahoo.com (LG. Boros) Original title: Submolecular Regulation of Cell Transformation by Deuterium Depleting Water Exchange Reactions in the Tricarboxylic Acid Substrate Cycle Authors: László G. Boros, Dominic P. D Agostino, Howard E. Katz, Justine P. Roth, Emmanuelle J. Meuillet, Gábor Somlyai ÖSSZEFOGLALÁS (ABSZTRAKT) A hidrogén ( 1 H) természetben előforduló izotópja, a deutérium ( 2 H), fontos biológiai jelentőséggel bírhat. A deutériumcsökkentett víz késlelteti a daganatok növekedését egerekben, kutyákban, macskákban és emberekben. A trikarbonsav (TCA) ciklus hidratáz enzimei szabályozzák a sejtnövekedést a deutériumcsökkentésen keresztül a redukáló (redox) kofaktorokban, zsírsavakban és a DNS-ben, melyek hidrid ionok és hidrogénatomok átmeneti megkötésében, illetve szállításában vesznek részt. A javasolt modell hangsúlyozza, hogy a mitokondriális elektrontranszport-reakció utolsó komplexe, amely a molekuláris oxigént vízzé redukálja, deutériumcsökkentett vizet (DDW) termel, amely befolyásolja a glükoneogenezis és zsírsav oxidáció folyamatait. Az első reakciósor csökkenti a cukor-foszfátok deuteráltságát, ezzel segít megőrizni a DNS cukorvázának funkcionális stabilitását, amely a hidrogén-hidak deutériumban szegény hálózatában rejlik, illetve az aneuploidia és a DNS cukor vázának törése ellen is véd, amely sugárterápia vagy egyes daganatellenes kemoterápiás szerek alkalmazása esetén megtörténik. Felvetjük, hogy a DDW lehet az a kapocs a rák megelőzésében és kezelésében, a természetes zsíralapú diéta, az alacsony deutériumtartalmú ivóvíz és egyes célzott rákterápiák között, mint például az Avastin és Glivec, megértetve velünk ezek hatásmechanizmusait a mitokondriális terminális oxidáció metabolikus DDW termelése révén. A deutérium biológiai szerepének megértése lehet a rákbetegség véget érni nem akaró kirakós játékának hiányzó darabja, amely nyilvánvalóan összefügg a rák járványszerű elterjedésével a fejlett világban, melynek étrendjére a magas deutériumtartalmú élelmiszeripari cukrok fogyasztásának túlsúlya jellemző a természetes zsírok rovására. Copyright 2015 Elsevier Ltd. Szakembereknek szánt anyag.

2 Témaismertetés Úgy tűnik a deutériumcsökkentés jól funkcionáló, erős, stabil hidrogén- kötési hálózatok fenntartásával védi sejtjeinket. A deutériumcsökkentett víz gátolja a rákos sejtek növekedését, valamint a rákbetegség előrehaladását. A trikarbonsav- és pentóz ciklusok hidratáz és izomeráz enzimei mitokondriális eredetű alacsony deutériumtartalmú mátrix vizet adnak 1 köztes termékeikhez, ez DNS stabilitásához vezet. A deutériumcsökkentés védi a sejteket a deutérium kivételes kinetikus izotóp hatásától a biológiai hidrogénkötési hálózatokban. A ketogén diéta, a DDW és egyes gyógyszerek deutérium csökkentésen keresztül fejtik ki hatásukat a mitokondriális mátrix anyagcsere vízének termelése vagy helyettesítése által, ami egy új módszert kínál a daganatos sejtek növekedésének gátlására. A közlemény újdonságtartalma A mitokondriumok sérült működése, az oxigénhiány, a fokozott glikolízis a sejtek rosszindulatú elfajulását eredményezi, ami a deutérium-hidrogén ( 2 H/ 1 H) arány emlős sejteken belüli eltolódását okozza. Ketogén diétáról magas cukortartalmú diétára váltva a mitokondriumok deutériumot csökkentő funkciói sérülnek, ami onkogenikus folyamatokat indíthat el. Közleményünk új adatokat tartalmaz a rákbetegség megelőzésére és kezelésére vonatkozóan. Kérdések a szakértőhöz Felmérhető-e a daganatos kockázat deutérium terheltség anyagcsere profiljának meghatározásával? A 13 C-vel jelzett szubsztrátok segíthetnek-e korai rákdiagnózisban és a kezelési hatékonyság megítélésében, ha meghatározzuk a vérben keringő vagy daganatból eltávolított tumorsejtek DNS-ének deuteráltságát, deutériumot halmozó anyagcsere folyamatok azonosítása közben? Van-e szerepe a hidrogén izotópok eltérő kémiai tulajdonságainak az onkometabolitok és táplálkozás összefüggéseiben? Bevezetés A rák már vezető halálok Ausztráliában, Kanadában, Dániában, Új-Zélandon és az Egyesült Királyságban, járványszerű terjedést mutatva. Az Amerikai 1 A hidratáz enzimek hidratáció során a hidratálódó (vizet felvevő) anyagcsere-terméket egy protonnal (-H+) és egy hidroxil- (-OH-) csoporttal látják el a reakciót körülvevő hidrát burokból. Amennyiben a hidratáláshoz használt víz anyagcsere hidrogénből keletkezik oxigén redukálása közben, azaz a reakció anyagcserevizet használ, a folyamatot anyagcsere hidratálásnak nevezzük mind a mitokondrium mátrixában, mind a citoplazmában, amennyiben ott anyagcserevíz van jelen. Egyesült Államok előrejelzései szerint a rákbetegség ra meg fogja előzni a jelenleg vezető halálokként nyilvántartott keringési és szívbetegségeket [1]. A lesújtó rákstatisztikák, hatástalan gyógyszeres kezelések és az eszkalálódó költségek felerősítik a gyógyszerszedési szakadékot 2, amely szükségessé teszi új elvek, megfizethető és klinikailag hatásos rákkezelési eljárások kidolgozását a jövőben a rákbetegség-járvány megfékezése érdekében. A rák genetikai és szignál transzdukciós elmélete, amely gén és fehérje célpontokat jelöl meg elsődleges gyógyszercélpontokként, továbbra is megfoghatatlanok és pénzigényesebbek, mint valaha, eredményei jelentéktelenek, ha egyáltalán lehet haladásról beszélni ezen a területen. Rövid történelmi visszatekintés szerint, Warburg vetette fel először, hogy a sejtlégzés (respiráció) visszafordíthatatlan károsodása a rák elsődleges oka [2-4], amely emelkedett glükóz-tejsav átalakulással jár, még megfelelő mennyiségű oxigén jelenléte esetén is. Warburg augusztus 1-jén 1970-ben bekövetkezett halála és az onkogének 1971-ben történt felfedezése a rákkutatás szemléletét a genetikai betegségek körébe sodorta. A rák anyagcsere- betegségként való újrafelfedezése modern 13 C-glükóz sorsának követése után 1998-ban a sejtanyagcsere és pentóz ciklust szabályozó génklaszterek felé vitte az alapkutatást [5], a gyógyszerfejlesztés számára [6]. Mindezek ellenére az előrehaladás még mindig lassú a molekuláris biológiai (genomikai) megközelítés árnyékában, amely alkalmatlan az anyagcsere-hálózatok sajátosan összetett szabályozási rendszereinek feltárására [7] (Táblázat 1). Célzott kináz gátló gyógyszerfejlesztések tömeges orvosi és gazdasági bukásai először 2005-ben kerültek áttekintésre [8], amelyek azóta sajnálatos realitássá váltak. Az egyre romló rákstatisztikák tovább igazolják azt az igényt, hogy a rákot sejtszintű anyagcsere-betegségként közelítsük meg [9,10]. A rák génektől független szubmolekuláris elmélete kb. fél évszázaddal korábbra datálódik, és Szent-Györgyi Alberttől ered, aki 1937-ben kapott orvosi Nobel-díjat. Szent-Györgyi a rákbetegség okait az elektromos töltések normálistól eltérő átvitelében látta, emellett a metilglioxál, fehérje és aszkorbinsav elégtelen elektronszállító működését feltételezte [11]. Ezek a szubmolekuláris reakciók egy nagyon precíz és viszonylag egyszerű rendszert feltételeznek a sejtnövekedés gátlására, ahol a hidrogén és deutérium arányok is jelentős szerepet vállalnak a növekedést szabályozó folyamatokban, mint azt Somlyai Gábor igazolta [12]. Somlyai vizsgálatai magyarázatot adtak arra, hogyan jelentkezhet tumoros átalakulás élesztőből származó ATP-áz génnel transzformált emberi kötőszöveti sejtekben. Az ATP-áz 2 gyógyszerszedési szakadék (Drug Compliance Cliff - egyes célzott rákgyógyszer mérgező volta, ~100 szoros haszon mentén kialakított ára és hatástalansága miatt betegek elutasítják annak szedését, esetenként orvosok sem javallanak célzott rákgyógyszert -

3 enzim a proton ( 1 H + ) pumpa működtetése során erősen diszkriminál a deutériummal szemben 3 [13], ami miatt a deutérium sejten belüli koncentrációja emelkedik, ez rosszindulatú elfajulást eredményez [14]. Ez a hidrogén pumpa így, hogy a sejtekből csak hidrogént szállít a deutérium rovására, jelentősen károsítja a sejt deutériumcsökkentő víztermelő képességét az ATP szintézis során, és ezek a vizsgálatok egyben fényt derítettek a mátrix ezen funkcióján keresztül szabályozott normális DNS és sejtműködési folyamatokra, a hidrogéndeutérium arány mitokondriumokon belüli szabályozását igazolva; ami munkánk központi hipotézise. A hidrogén és deutérium aránya sejten belül a sejtnövekedés elsődleges szabályozójaként azonosítható a szignál utak rendszereiben, ahol a deutérium kivételes kinetikus izotóp hatással bír, a szabad proton mozgás súlyos gátlásán keresztül [15, 16], amely érinti a hidrogén hidak és kötési rendszerek működését biológiai hálózatokban. A deutérium kivételes kinetikus izotóp hatása megmagyarázza a hidrogén deutériummal ( 2 H) való helyettesítésének fontosságát rákbetegségben, és a DDW jelentős daganatellenes hatását annak ellenére, hogy a deutérium csak kis mennyiségben fordul elő a természetben. Pontosabban szólva, kb H 2 O (nehézvíz) molekula található 1 millió 1 H 2 O könnyű hidrogént tartalmazó vízmolekula között (egy nehézvízmolekula 2 H 2 O van 6420 könnyű 1 H 2 O vízmolekula között), azaz kb H deutérium atom található 1 millió 1 H hidrogénatom között az óceánok vizében. Másrészről egy darab félnehéz 2 H 1 HO (monodeuterált) vízmolekula található megközelítőleg 3210 darab 1 H 2 O könnyű hidrogént tartalmazó (protonált) víz molekula között, azaz egy deutérium atom található megközelítőleg 3210 könnyű 1 H között. Biomolekulákban, mint amilyen pl. az NADPH 4 és a DNS, a két stabil hidrogén izotóp, prócium 5 ( 1 H) és deutérium ( 2 H) jelentősen eltérő fiziko-kémiai viselkedést mutat [17, 18]. Ugyanis, míg a 12-es szénizotópot ( 12 C) tartalmazó biológiai kötések csak 1,1 százalékkal szakadnak fel gyorsabban, mint a 13-as szénizotópot ( 13 C) tartalmazó kötések ambiens hőmérsékleten [19], addig a kovalens hidrogénkötések bontása több mint 7-szer gyorsabban zajlik le, mint a deutériumkötéseké, amelynek oka az atomtömeg és a quantummechanikai tulajdonságok jelentős eltérése, a deutérium elsődleges kinetikus izotóp hatásai miatt [20]. A deutérium jelentős mennyiségben mmol/l - található a vérplazmában, összevetve például a kalcium 2,24 2,74 mmol/l, magnézium 0,75 1,2 mmol/l, kálium 5,0 5,1 mmol/l vagy a glükóz 3,3 6,1 mmol/l vérben keringő mennyiségével. A deutérium magasabb mágneses 3 deutérium diszkrimináció: deutériumot nem szállít, hidrogént viszont szállít a sejtekből a sejten kívüli térbe ez a pumpa rendszer 4 nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP a hidrogén leggyakoribb izotópja és elektromos dipól momentum 6 tulajdonságai szintén fontos szerepet játszhatnak a DNS hidrogénkötéseinek és hídjainak stabilitásában, illetve az abnormális sejtosztódásban. Hidrogén/deutérium tömegaránya a legnagyobb ( 2 H/ 1 H=2) egy azonos elem stabil izotópjai között 7, amely jelentősen befolyásolja kémiai kötési energiákat és a kollektív protonmozgások szinkronizáltságát, amit jégben [15], sejtszintű jelátvivő fehérje rendszerekben [21, 22], reduktív szintézis anabolikus termékeiben, mint például a DNS-ben [23], RNS-ben [24] és az újonnan keletkező sejtek sejtmagmembránjának lipidjeiben is leírtak. A sejtnövekedés deutérium által való szabályozásának kísérletes és klinikai bizonyítékai A fentebb leírtakkal egyezően, a víz alacsony deutériumtartalmának jelentős szabályozó funkciója van a sejtnövekedésre, melyet számos in vitro és in vivo biológiai rendszerben igazoltak [12, 25-27]. In vitro sejtkultúrás kísérletek, melyek esetében a tápfolyadékok mindössze a deutérium-koncentrációjukban különböztek, igazolták, hogy a deutériumcsökkentés dózisfüggő módon gátolja a sejtnövekedést. Ezzel ellentétesen, a deutériumkoncentráció természetes előfordulási érték fölé emelése a vízben a sejtnövekedést serkenti. A megfigyelt hatások jól modellezhetők, amikor a DDW-vel készült tápfolyadék gátolja a daganatsejtek osztódását, fontos megjegyezni, hogy fizikailag visszaállítva a 2 H-szintet nehézvíz hozzáadásával, a sejtosztódási ráta is helyreáll [28, 29]. A deutériumcsökkentett víz (DDW) klinikai hatásai talán a legjelentősebbek. Teljes vagy részleges tumor gátlást lehetett előidézni MDA-MB-231 és MCF-7 emlő, illetve PC-3 emberi prosztata adenocarcinoma sejtekkel oltott egerekben [12, 22]. Amikor klinikai állatokat kémiai 7,12-Dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) rákkeltő kezelésnek tettek ki, a citoplazma myelocytomatosis (c- Myc), Ha-ras és p53 onkogének kifejeződése megemelkedett. Ezzel szemben a DDW fogyasztás gátolta ezen gének kifejeződését. Továbbá, a DDW szignifikánsan gátolta az A549 jelű emberi tüdődaganatos sejtek szaporodását sejtkultúrában, míg a H460 jelű tüdő tumoros sejtvonallal oltott laboratóriumi egerekben a DDW hatására a kifejlődött daganat mérete 30%-kal csökkent [31]. A deutériumcsökkentett víz daganatellenes hatását kettős vak elrendezésű, randomizált, négy hónapig tartó kettes fázisú klinikai kipróbálásban is megerősítették prosztatatumoron [30], és a kiterjesztett utókövetés szintén azt mutatta, hogy a deutériumcsökkentés késlelteti a betegség előrehaladását. 6 a deutérium által keltett mágneses erő és elektromos kölcsönhatás a környező tér bármely pontján 7 a deutériumatom tömege kétszerese a hidrogénatoménak

4 Táblázat 1. Betegség okozó hipotézisek történeti áttekintése rákban. A. Korai anyagcsere-hipotézis ~1950-től (Otto Heinrich Warburg) [2] A ráksejtek energiaigényüket nagy mennyiségű glükóz felhasználásából fedezik glükolízisen keresztül tejsav képződése közben még bőséges oxigén jelenlétében is. B. Korai szubmolekuláris (génektől független) hipotézis ~1975-től (Szent-Györgyi Albert) [11] A rákot génektől független elektron szállítással kapcsolatos zavarok és fehérje funkciós problémák okozzák. Ezen elképzelést háttérbe szorították a molekuláris genetikai és gén diszfunkciós megközelítések/elméletek. C. Genetikai hipotézis ~1990-től (Harold Eliot Varmus) Onkogének, illetve tumor szupresszor gének mutációi felelősek a sejtek rosszindulatú elfajulásáért, olyan anyagcserekövetkezményekkel, mint például a Warburg hatás, amelyek inkább az onkogénekhez köthető jelátvitelnek és a mutációknak eredményei, azaz, az anyagcsere eltérések az onkogénikus jelátvivő rendszerek okozatai. D. Anyagcsere hipotézis ~1998-tól [5, 8] A rákbetegséget abnormális anyagcsere-reakciók és gén klaszterek okozzák, amelyek hatással vannak a mitokondriális működésre enzim mutációk és/vagy hypoxia miatt. A mutációk és onkogenikus jelátvivő folyamatok nem feltétlenül indukálnak rosszindulatú sejttranszformációt, de az onkometabolitok jelenléte kritikus. E. Deutérium hipotézis ~1992 jelen [12] A rákbetegséget abnormális anyagcsere reakciósorok okozzák, amelyek megzavarják a mitokondriumok deutériumcsökkentő funkcióit. Az eredmény a DNS deuterációja, emelkedett deutériumterheltsége, illetve aneuploidia a deutérium által kifejtett erős kinetikus izotóphatások miatt. Deutériumcsökkentés egy hatékony kiegészítő eljárás a rák megelőzésére és kezelésére. Ezen előzetes klinikai vizsgálatok megfigyelései alapján a DDW egy ígéretes új kezelési lehetőség a rákbetegség megelőzésére és kezelésére, azáltal, hogy a mitokondriumon kívül megvalósuló deutérium terhelést csökkenti a sejt DNS-ében. A deutérium ( 2 H)-csökkentés konvencionális rákterápiák mellett javítja a medián túlélést tüdőrákos betegekben még akkor is, ha a betegség már előrehaladott stádiumban van, és esetleg már agyi metasztázisok fordulnak elő [32]. Mellrákos betegekben a DDW-kezelés mind kombinálva, mind hagyományos rákterápiák kiterjesztéseként, jelentősen javította a túlélést a betegség előrehaladott stádiumában, és hatásosnak bizonyult korai stádiumú emlőrák kiújulásának megelőzésében is [33]. Deutériumot szállító onkometabolitok mitokondriális mátrix víz anyagcserébe való visszajuttatásának és a rákbetegség összefüggésének sajátos kapcsolata 8 A váltás a rákbetegség genetikai szemléletéről a sejtszintű anyagcsere-betegségként való felfogására annak köszönhető, hogy metabolomikai módszerekkel lehetőség 8 Deutérium mint onkoizotóp nyílt onkometabolitok azonosítására. Az onkometabolitok olyan sejten belüli anyagcseretermékek, amelyek felgyülemlenek és ezzel beindítják, illetve fenntartják a kontrollálatlan, szabályozatlan sejtosztódást, sejtnövekedést, amely áttétképződéshez is vezethet. Az első onkometabolitok között azonosították a 2- hidroxiglutarátot, amely egy viszonylag ritka anyagcseretermék és magas koncentrációban található meg rákos glióma sejtekben, illetve akut myeloid leukémiában [34, 35]. Számos mechanizmust javasoltak az onkometabolitok megértéséhez a rákbetegség kiváltása szempontjából. A hisztonok közvetett metilációja által módosult génfunkciók és jelátvivő rendszerek például hozzájárulhatnak a sejtek rosszindulatú elfajulásához. A 2- hidroxiglutarát azonosítása óta, amely a citoplazmába jut citromsavból és izocitromsavból való képződés után, más mitokondriális termékeket, például a borostyánkősavat és fumársavat is leírták vese sejt karcinómákban [36] és paragangliómákban, mindkét ráktípusban. Ezen termékek a metabolikus hidráció hiánya miatt halmozódnak fel, amely a TCA ciklus továbblépéséhez vezető terméket állítja elő, a ketoglutarátot és az almasavat, minélfogva a TCA ciklus köztes termékei 9 feltorlódnak, illetve az anyagcsere víz 9 Szent-Györgyi-Krebs ciklus intermedierek, pl. a citromsav, akonitát és fumársav

5 hidrogénjeinek anyagcserébe való visszaforgatásra NADPH-n keresztül az izocitrát-dehidrogenáz reakcióval is megszűnik, ami agresszív rákok keletkezéséhez és azok gyors terjedéséhez vezet. Ebből adódóan az onkometabolitok keletkezése olyan enzimek működési zavaraira vezethető vissza, amelyek deutérium szegény anyagcsere víz hidrogénjeit forgatnák vissza a sejt szénciklusaiba, a glükoneogenezisbe és a nukleinsavak (RNS, DNS) cukorvázának szintézisébe. Anyagcsere víz szempontjából száraz köztes anyagcsere termékek, onkometabolitok felszaporodása elméletünk központi megállapítása, amely a rákbetegség kifejlődését mitokondriális zavarokra vezeti vissza, amikor is a TCA ciklus nem képes köztes anyagcsere termékeit hidratálni alacsony deutériumtartalmú mátrix vízzel a mitokondriumok működési elégtelenségéből eredően. Elméletünk helytállóságát támogatja az a tény, hogy pl. a fumársav hidratáz aktivitás visszaállításával a mitokondriumon belül a vesetumor-sejtek normál mátrixvíz tartalom, mitokondriális morfológia és funkció mellett visszanyerik genetikailag stabil, nem osztódó, egészséges fenotípusukat [37]. Minden nem TCA-ciklus eredetű onkometabolit megjelenéséért aerob glükolízis, glutamin lebomlás, vagy az egy szénatomos ciklusok felelősek, [38] mivel ezek a reakciók deutériumban gazdag, azzal terhelt szubsztrátokat juttatnak a környezetből sejtjeinkbe, részben táplálkozásunk által. Ezek magukban foglalják a glicint mellrákban, az aszparaginsavat leukémiában, kolint prosztata, agy és mellrákokban, a glutamint myc-függő rákokban, valamint a glükózt, szerint, tejsav és poliaminokat a rák legtöbb típusában. Leggyakoribb táplálék összetevőink, mint például a glükóz, tejsav, amino-, glutamin- és glicerinsav, akkor válnak onkometabolitokká, amikor a mitokondriális zsírégetésből eredő, deutériumcsökkentő és/vagy metabolit hidratáló folyamatok elégtelenek a deutérium lecserélésére, helyettesítésére egyes szénatomokon 10, mielőtt ezek funkcionálisan és szerkezetileg beépülnek a DNS, RNS és sejtmembránt építő zsírsavakba. A rák deutériummal kapcsolatos elméletének biológiai összefüggései Egy új sejt DNS-ének és zsírsavjainak szintéziséhez szükséges karboxilációs 11 folyamatok központi redukáló ekvivalense a NADPH, és annak deutériumszállító sajátságai attól függenek, hogy az oxidálandó szubsztrátok hidrogéndonor szénatomjai milyen mennyiségben hordoznak deutériumot, illetve hogy a citoplazmában és mitokondriumban meglévő víz milyen arányban tartalmazza ezt az izotópot [39, 40]. A fent leírt mechanizmusok mind fontosak, mert már intermedier 10 a DNS cukorláncának ötös (C 5 ) szénatomja rendkívül érzékeny deuterációra [23,24] 11 karboxiláció: a CO 2 -nek -COOH csoportként való beépítése egy szerves molekulába molekulákon belüli deutériumeloszlások is jelentős egyenetlenségeket mutatnak, ezek közeli szubsztrát <-> termék arányeltolódásokban is megfigyelhetőek, például amilyen a fruktóz-6-foszfát és glükóz-6-foszfát esetében is fennáll [41]. Pontosabban, a természetes glükóz, amit közönséges bab (Phaseolus vulgaris) vagy spenót (Spinacia oleracea) növények leveleiből vontak ki, jelentősen kevesebb deutériumot tartalmaz a C 2 (kettes szénatom) pozíciójában. Növényi eredetű [42] vagy más forrásból [43, 44] származó zsírsavak esetében szintén nyilvánvaló, hogy bizonyos szénatom pozíciókban jelentős deutériumcsökkenés mérhető, amelyek DDW termelését eredményezik a mitokondrium mátrix IV-es komplexében 12 zsírsav oxidáció során. A pentóz- és TCAciklusokban oxidálódó biomolekulák szénatomonkénti deutériumeloszlásának eltérései rámutatnak az intramolekuláris deutériumeloszlás biológiai jelentőségére, mely nélkülözhetetlen lehet a sejteken és sejt szervecskéken belüli terekben, kompartmentekben lévő deutériumbőség mint onkogenikus folyamatokat elindító tényező megértéséhez. A pentóz-foszfát ciklus (oxidatív reakciók) citoplazma eredetű vizet használ, ez magasabb, felszíni vizekre jellemző deutériumtartalommal bír, amely kb. 155 ppm (lásd fentebb). A teljes biokémiai reakciósor ismerete fontos a pentóz ciklus visszafordíthatatlan oxidatív reakcióin belül, mivel a gyűrűnyitással kapcsolatos hidrolízis a ciklus 6-foszfo-D-glukonát termelődését eredményezi, amely egy újabb mólnyi mennyiségű NADPH-t bocsát a pentóz-ciklus eredetű, citoszolban lévő NADPH mennyiségéhez foszfoglukonát-dehidrogenáz [EC ] reakció által, amikor is a glükóz-6-p egyes szénatomja közvetlen (direkt) oxidáción megy keresztül. Ezt a reakciót az ötszénatomos pentóz átalakulásai követik a citoplazma víz hidrogénje által a Lobry de Bruyn- Alberda-van Ekenstein néven ismert aldóz-ketóz transzformációval, a citoplazma vizet használó glükóz-6- foszfát izomeráz (GPI) és trióz-foszfát izomeráz (TPI) [41] által, amelyek segítségével hat-, öt- és háromszénatomos termékcsoportok keletkeznek. Ezek aztán keverednek a citromsav-ciklus egyes szénatomjain deutériumcsökkentett anyagcsere hidrációs termékekivel, melyek a mitokondriális mátrix eredetű almasavat és fumársavat foglalják magukban. A mitokondriumok szerteágazó szubsztrát hidratációs lépései, amelyek táplálékeredetű két anyagcsere vízmolekula 4 hidrogénjét fogyasztják el ciklusonként, ezzel eszmben a pentóz-ciklusban történő gyűrűnyitás hidratáló lépései - amelyek citoplazmavizet használnak - pontosan szabályozzák az NAD(P)H függő deutériumdúsulást. Ezek a citoplazmában meglévő hidrogéntranszfertől függő további anyagcsererendszereket is befolyásolják, melynek része például az almasav-dehidrogenáz is. 12 complex-iv, citokróm (c) oxidáz fehérje complex

6 A metabolikus víz termelése során bekövetkező deutériumcsökkenés, mely a hidrogén szállítását segíti reduktív szintézis számára, egy fontos mitokondriális mátrix funkció, melynek kiemelkedő szerepe van az emlőssejtek ATP-termelésében is. A rák deuterobolomika 13 elmélete hangsúlyozza, hogy a citoplazma és a mitokondrium mátrix vízkompartmentek deutériumtartalma eltérő, ezek más módon járulnak hozzá a NADPH szintéziséhez, és hogy a fentebb leírt sejtszintű deutériumcsökkentő folyamatoknak már kisebb zavarai is aneuploidiát, differenciálatlan sejteket, és a sejtmag DNS állomány növekédését, illetve funkciójának károsodását idézi elő attól függően, hogy a pentóz-ciklus citoplazma vagy mitokondriális eredetű vizet, vagy termékeket használ [45-47]. Például, hexózok 14, pentózok 15 fokozott izomerizációja, miközben sejtjeink egy ketogénikus palmitát eredetű szubsztrátról glükózra vagy glutaminra váltanak a pentóz- és citromsav-ciklusok működtetéséhez [48], vagy természetes deutériumkoncentráció helyett a deutériumcsökkentett víz használata szövetkultúrában [12, 28-29], alapvetően megváltoztatja sejteink fenotípusát és osztódási képességét. Összefoglalásként, a víz deutériumtartalmának ( 2 H) csökkentése új lehetőségeket biztosít a rákbetegség kezelésére és megelőzésére. A DDW hatékonysága a Warburg-elmélethez is kapcsolható, mivel DDW a normális mitokondrium terméke, mely utánozza, közvetíti és megőrzi az egészséges mitokondriumok működését. A mátrix deutériumcsökkentett víztermelése megelőzi az oxidatív foszforilációs rendszer (OXPHOS) visszafordíthatatlan károsodását, amely a rák kiindulópontja. A deutérium biológiai szerepének tisztázása az egyre nehezebben érthető rák puzzle hiányzó darabja lehet, amely megmagyarázhatja a betegség járványszerű előfordulását a fejlett társadalmakban, amely összefügg a magas szénhidrát-bevitelből eredő jelentős deutériumterheléssel a deutériumban szegény, de hidrogénben gazdag természetes zsírok fogyasztása helyett. A keletkező onkometabolitok deutériumtelítő szubsztrátként működhetnek (glükóz, glutamin, szerin), amelyek gátolják a mitokondrium deutériumcsökkentő glükoneogenikus prekurzor-szintézisét, amely egy deutériumcsökkentő szén-átalakító metabolikus közlekedési csomópont. A deutériumdús tápanyagok olyan DNS láncokat eredményeznek, amelyek védtelenek az aneuploidiával és instabilitással szemben (1. ábra), instabil hidrogénkötésekkel, megbomlott proton alagúteffektussal és merev hidrogén-híd struktúrákkal, melyek akadályozzák a DNS-javító rendszerek hatékony működését is. 13 A deuterobolomika a deutérium biológiai rendszerekben való viselkedésének alkalmazott tudománya, amely a deutérium onkoizotóp szerepének vizsgálatát is magában foglalja. 14 A glükolízisben szerepet játszó hatszénatomos cukrok 15 Ötszénatomos cukrok

7 1. ábra: A metabolikus profil változásainak összehasonlítása (1) élettanilag alacsony deutériumtartalmú zsírsavak oxidációján keresztül történő deutériumcsökkentéssel. Az Avastin és Glivec célzott rákgyógyszerek hasonló hatást fejtenek ki mivel ép mitokondriumok és zsíroxidáció szükségesek hatékonyságukhoz [49-51] (piros keret, 1), azaz (2) alacsony deutériumtartalmú metabolikus víz ismételt ciklusba vitele a mitokondrium mátrixában citromsav, izocitromsav és almasav keletkezése során; a fumár sav-hidratáz aktiválását célozva [36, 37], valamint ketogén étrenddel kombinált túlnyomásos oxigénterápia esetén [52] (piros keret, 2). A mitokondriális transzportrendszerek, mint például az almasav inga, alacsony deutériumtartalmú zsírsavból származó szénatomokat küld a glükoneogenezis folyamatába, ahol a glicerinaldehid- 3-foszfát kiterjedt szén cserereakciók forrása [53] a nem oxidatív pentóz ciklus számára, hogy fenntartsa az RNS és DNS pentóz cukor molekulák C3 -C5 szénatom pozícióinak alacsony deutérium-telítettségét (piros keret, 3). Ezek azok a szénatomok, amelyek a DNS stabilitását, radio- és kemoterápia eredetű hidroxilgyök-érzékenységét befolyásolják a hidrogén-deutérium izotóppár által [23, 24] az elsődleges és másodlagos izotóphatásnak, valamint részlegesen proton alagúteffektus (protoncsatorna) működésnek tulajdoníthatóan [15,16]. A C3 -C5 nukleinsav cukor-foszfát-lánc egységei mellett, a de novo nukleinsav bázisszintézis, a hidrogénkötések, a deuterium csatornák működése a hidrogénkötésekben, valamint a szerin-oxidációs glicin-hasításos anyagcsereutak [38; SOGC] (piros keret, 4) deutérium csökkentése mind fontosak. Amikor daganatos sejtek Warburg fenotípust mutatnak, illetve reduktív karboxiláció lesz meghatározó a mitokondriumban, akkor a nukleinsavak cukorvázának és bázisainak specifikus szénatom pozícióiban a csökkentett deutériumtartalmú ivóvíz marad mint egyedüli deutériumcsökkentő mechanizmus (piros keret, 5). (A kék színű arab számok enzimeket azonosítanak [54]) (piros keret, 1) Kevés deutérium a zsírsavak szénatomjain; (piros keret, 2) Kevés deutérium a metabolikus vízben; (piros keret, 5) Kevés deutérium az ivóvízben; Gluconeogenesis - SOGC = Glükoneogenezis SOGC; Pentose cycle = Pentóz ciklus; Malate shuttle = Malát inga; Fatty acid oxidation (β-carbon) = Zsírsav β-oxidáció; Oxaloacetate =Oxálecetsav; Acetyl-CoA= Acetil-CoA; Citrate=Citromsav; Isocitrate=Izocitromsav; α- ketoglutarate= α-ketoglutársav; Succinyl-CoA= Szukcinil-CoA (Borostyánkősav-CoA); Succinate=Szukcinát (Borostyánkősav); Fumarate=Fumársav; Malate=Almasav; Krebs-Szent-Györgyi cycle=szent-györgyi-krebs-ciklus; Ribulose-5P=Ribulóz-5P; Xylulose-5P=Xilulóz-5P; Carbons with high deuterium (sugars/amino acids)=szénatomok magas deutériumtartalommal (cukrok/aminosavak); Carbons with low deuterium (fatty acids from natural fat)=szénatomok alacsony deutériumtartalommal (természetes zsírokból származó zsírsavak)

8 Támogatások Ezt a munkát a Hirschberg Hasnyálmirigy Betegségek Alapítványa, a Kalifornia Egyetem Klinikai Transzlációs Intézete (UL1TR000124) és a UCLA Hasnyálmirigy Betegségek Kitüntetett Anyagcsere Centruma támogatta (1- P01 AT A1) Boros László számára. A célzott 13C szénatomos vizsgálatokat, adat mátrix diagnosztikát, ezek alkalmazásait rákbetegségre részben az Európai Regionális Fejlesztési Alap (ERFA), az Új Széchenyi Terv (KMOP /A ) finanszírozta Somlyai Gábor számára. A kutatást támogatók nem vállaltak semmilyen szerepet a vizsgálatok elvégzésében, elrendezésében, adatgyűjtésben és adatok elemzésében, a közlemény publikálásával kapcsolatos döntésekben illetve a közlemény kéziratának megírásában sem Köszönetnyilvánítás Megköszönjük Boros Eszternek és Szentjóbi Szabó Szandrának a technikai segítséget, amivel a táblázat 1 és az 1. ábra kéziratban szereplő szemléletes beillesztését végezték. Irodalmi hivatkozások [1] Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program ( Research Data, National Cancer Institute, DCCPS, Surveillance Research Program, Surveillance Systems Branch, released April [2] Warburg O. The Metabolism of Tumours. New York Richard R Smith 1931;24:2. [3] Warburg O. On the origin of cancer cells. Science 1956;123: [4] Warburg O. The prime cause of cancer and prevention - Part 2. Annual meeting of Nobelists at Lindau, Germany Doi: [5] Boros LG, Lee PW, Brandes JL, et al. Nonoxidative pentose phosphate pathways and their direct role in ribose synthesis in tumors: is cancer a disease of cellular glucose metabolism? Med Hypotheses 1998;50:55-9. [6] Vander Heiden MG. Targeting cancer metabolism: a therapeutic window opens. Nat Rev Drug Discov 2011;10: [7] Cascante M, Boros LG, Comin-Anduix B, de Atauri P, Centelles JJ, Lee PW. Metabolic control analysis in drug discovery and disease. Nat Biotechnol 2002;20: [8] Boros LG. Metabolic targeted therapy of cancer: Current tracer technologies and future drug design strategies in the old metabolic network. Metabolomics. 2005;1:11-5. [9] Wishart DS. Is Cancer a Genetic Disease or a Metabolic Disease? EBioMedicine 2015;2:478-9 [10] Seyfried T. Cancer as metabolic disease: on the origin, management, and prevention of cancer. Wiley, Hoboken NJ 2012; 438 pp. [11] Szent-Györgyi A. The Living State and Cancer. In: Submolecular Biology and Cancer, Ciba Foundation Symposium 67. Eds: Wolstenholme GEW, Fitzsimons DW, Whelan J. 1979;pp DOI: / [12] Somlyai G, et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells. FEBS Lett 1993;317:1-4. [13] Kotyk A, Dvoráková M, Koryta J. Deuterons cannot replace protons in active transport processes in yeast. FEBS Lett 1990;264: [14] Perona R, Serrano R. Increased ph and tumorigenicity of fibroblasts expressing a yeast proton pump. Nature 1988;334: [15] Drechsel-Grau C, Marx D. Exceptional isotopicsubstitution effect: breakdown of collective proton tunneling in hexagonal ice due to partial deuteration. Angew Chem Int Ed Engl 2014;53: [16] Sobczyk L, Obrzud M, Filarowski A. H/D isotope effects in hydrogen bonded systems. Molecules 2013;18: [17] Katz JJ, Crespi HL. Isotope Effects in Biological Systems. In: Collins CJ, Bowman N, editors. Isotope Effects in Chemical Reactions. New York: Van Nostrand Reinhold pp , (1971). [18] Rundel PW, Ehleringer JR, Nagy KA. Stable Isotopes in Ecological Research, New York: Springer, (1988). [19] Jancsó G. Isotope Effects. In: Vértes, A., Nagy, S., Klencsár, Z., editors. Handbook of Nuclear Chemistry, Volume 2. Dordrecht, Netherland: Kluwer Academic Publishers pp , (2013). [20] Zuev PS. Carbon tunneling from a single quantum state. Science 2003;299: doi: /science [21] Swain C, et al. Use of hydrogen isotope effects to identify the attacking nucleophile in the enolization of

9 ketones catalyzed by acetic acid. J Am Chem Soc 1958;80: doi: /ja01554a077 [22] Somlyai G, Laskay G, Berkényi T, Jákli G, Jancsó G. Naturally occurring deuterium may have a central role in cell signalling. In: Heys JR, Melillo DG, editors. Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds. New York: John Wiley and Sons Ltd, pp , (1998). [23] Balasubramanian B, Pogozelski WK, Tullius TD. DNA strand breaking by the hydroxyl radical is governed by the accessible surface areas of the hydrogen atoms of the DNA backbone. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95: [24] Ingle S, Azad RN, Jain SS, Tullius TD. Chemical probing of RNA with the hydroxyl radical at singleatom resolution. Nucleic Acids Res 2014;42: doi: /nar/gku934 [25] Somlyai G, et al. The biological effects of deuteriumdepleted water, a possible new tool in cancer therapy. Zeitschrift für Onkologie (ger) Journal of Oncology 1998;30: [26] Gyöngyi Z, Somlyai G. Deuterium depletion can decrease the expression of c-myc, Ha-ras and p53 gene in carcinogen-treated mice. In Vivo 2000;14: [27] Cong FS, et al. Deuterium-Depleted Water Inhibits Human Lung Carcinoma Cell Growth by Apoptosis. Exp Ther Med 2010;1: [28] Boros LG, et al. Fumarate hydratase and deuterium depletion control oncogenesis via NADPH-dependent reductive synthesis: mitochondrial matrix water, DNA deuteration and epigenetic events. Cancer Res 2014;74(19 Suppl):Abstract nr doi: / am [29] Somlyai G, et al. Deuterium has a key role in tumor development: A new submolecular regulatory system. In: 75 th Anniversary Publication for Albert-Szent- Gyorgyi's Nobel Award, Szeged, Hungary, EU; 2013;Jubilee Publication on the 75 th Anniversary of Albert Szent-Györgyi s Nobel Prize Award. doi: [30] Kovács A, et al. Deuterium depletion may delay the progression of prostate cancer. J Cancer Ther 2011;2: doi: /jct [31] Gyöngyi Z, et al. Deuterium-depleted Water Effects on Survival of Lung Cancer Patients and Expression of Kras and Bcl2 Genes in Mouse Lung. Nutr Cancer 2013;65: (2013). doi: / [32] Krempels K, Somlyai I, Somlyai G. A retrospective evaluation of the effects of deuterium-depleted water consumption on four patients with brain metastases from lung cancer. Integr Cancer Ther 2008;7: doi: / [33] Krempels K, et al. A retrospective study of survival in breast cancer patients undergoing deuterium depletion in addition to conventional therapies. J Cancer Res Ther 2013;1: doi: / [34] Ward PS, et al. The common feature of leukemiaassociated IDH1 and IDH2 mutations is a neomorphic enzyme activity converting alphaketoglutarate to 2- hydroxyglutarate. Cancer Cell 2010;17: [35] Reitman ZJ, et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2- hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem 2014;289: doi: /jbc.M [36] Yang Y, et al. Metabolic reprogramming for producing energy and reducing power in fumarate hydratase null cells from hereditary leiomyomatosis renal cell carcinoma. PLoS One 2013;8:e doi: /journal.pone [37] Tong WH, et al. The glycolytic shift in fumaratehydratase-deficient kidney cancer lowers AMPK levels, increases anabolic propensities and lowers cellular iron levels. Cancer Cell 2011;20: doi: /j.ccr [38] Tedeschi PM, et al. Contribution of serine, folate and glycine metabolism to the ATP, NADPH and purine requirements of cancer cells. Cell Death Dis 2013;4:e877. doi: /cddis [39] Lewis CA, et al. Tracing compartmentalized NADPH metabolism in the cytosol and mitochondria of mammalian cells. Mol Cell 2014;55: doi: /j.molcel [40] Boros LG, Somlyai G. Compartmentalized NADPH Synthesis, Intramolecular Deuterium Disequilibrium and Water Pools of Mammalian Cells. Molecular Cell 2014;55: (Comment) doi: [41] Schleucher J, Vanderveer P, Markley. Intramolecular deuterium distributions reveal disequilibrium of chloroplast phosphoglucose isomerase. Plant, Cell & Environment 1999;22: [42] Billault I, Guiet S, Robins RJ. Quantitative Deuterium Isotopic Profiling at Natural Abundance Indicates Mechanistic Differences for Δ12-Epoxidase and Δ12- Desaturase in Vernonia galamensis. The Journal of Biological Chemistry 2005;280: [43] Duan JR, Billault I, Mabon F, Robins RJ. Natural deuterium distribution in fatty acids isolated from peanut seed oil: a site-specific study by quantitative 2 H NMR spectroscopy. Chembiochem 2002;3: [44] Billault I, Guiet S, Mabon F, Robins RJ. Natural deuterium distribution in long-chain fatty acids is nonstatistical: a site-specific study by quantitative (2)H NMR spectroscopy. Chembiochem 2001;2: [45] Fleming JC. Characterization of a murine high-affinity thiamine transporter, Slc19a2.Mol Genet Metab 2001;74:

10 [46] Green R. Mystery of thiamine-responsive megaloblastic anemia unlocked. Blood 2003;102: doi: [47] Boros LG, Steinkamp MP, Fleming JC, Lee WN, Cascante M, Neufeld EJ. Defective RNA ribose synthesis in fibroblasts from patients with thiamineresponsive megaloblastic anemia (TRMA). Blood 2003;102: [48] Lamonte G, et al. Acidosis induces reprogramming of cellular metabolism to mitigate oxidative stress. Cancer Metab 2013;1:23. doi: / [49] Xu J, et al. Colorectal cancer cells refractory to anti- VEGF treatment are vulnerable to glycolytic blockade due to persistent impairment of mitochondria. Mol Cancer Ther 2013;12: doi: / MCT T [50] Kominsky DJ, et al. Abnormalities in glucose uptake and metabolism in imatinib-resistant human BCR- ABL-positive cells. Clin Cancer Res 2009;5: doi: / CCR [51] Boren J, et al. Gleevec (STI571) influences metabolic enzyme activities and glucose carbon flow toward nucleic acid and fatty acid synthesis in myeloid tumor cells. J Biol Chem 2001;276: doi: /jbc.M [52] Poff A, et al. The ketogenic diet and hyperbaric oxygen therapy prolong survival in mice with systemic metastatic cancer. PLoS One 2013;8:e doi: /journal.pone [53] Centelles JJ, et al. Metabolic profile and quantification of deoxyribose synthesis pathways in HepG2 cells. Metabolomics 2007;3: doi: /s [54] Boros LG, et al. Targeted 13 C-labeled tracer fate associations for drug efficacy testing in cancer. In: Tumor Cell Metabolism Pathways, Regulation & Biology, Eds. Shoshan, M. (Karolinska Institute, Stockholm, Sweden) & Mazurek, S. L. (Justus-Liebig- University, Giessen, Germany), Chapter 15 - pages (2014). doi /