PANNON MAGBANK PROJEKT MAGTÁROLÁSI ÚTMUTATÓ

Átírás

1 PANNON MAGBANK PROJEKT MAGTÁROLÁSI ÚTMUTATÓ Összeállította: Málnási Csizmadia Gábor, dr. Holly László, dr. Tóth Zoltán, Oláh Imre, Peti Erzsébet, Schellenberger Judit Növényi Diverzitás Központ

2 BEVEZETÉS A Pannon Magbank Projekt ( Establishment of the Pannon Seed Bank for the long-term ex situ conservation of Hungarian vascular wild plants Life08 NAT/H/000288) Magtárolási Protokollja a Pannon Biogeográfiai Régióból begyűjtésre kerülő legalább 800 vadon élő növényfaj hosszú távú magmegőrzését szolgálja. A mag, mint kitartó és szaporító-képlet alkalmas a növényi genetikai erőforrások ex situ (természetes élőhelyen kívüli) konzervációjára. A növényi magvak tárolhatóságával kapcsolatos első megfigyelések, tudományos eredmények a kultúrnövényekhez köthetők. A magtárolást Harrington a génforrások tartalékként való megőrzésének leggazdaságosabb és legkedvezőbb módjaként említi (Holly, 1982). A növényi genetikai erőforrások megőrzése napjainkban elsősorban magbankokban (génbankokban) valósul meg (Smith et al., 2003, Lima et al., 2014, Groot et al., 2015). Az egyes fajok magvainak tárolhatósága különböző. Bizonyos fajoknál (pl. Asclepias syriaca L., Csontos, 2005) már a legegyszerűbb száraz, védett helyen való tárolás is eredményt hozhat (Csontos et al., 2006). Más fajoknál a hosszú-távú tárolás csak speciális génbanki tárolási módszerek alkalmazásával lehet eredményes. E. H. Roberts angol kutató a hetvenes évek elején a magvak nedvességtartalmának, illetve tárolási hőmérsékletének csökkentése és életképességük, tárolhatóságuk közötti összefüggéseket tanulmányozta. A magokat tárolhatóságuk alapján ortodox, illetve rekalcitráns típusokba sorolta (Holly, 1982). Későbbiekben ez a felosztás kiegészült az ún. átmeneti típussal is. A három tárolhatósági típus a következőképpen jellemezhető (Holly, 1982, Hong és Ellis, 1996, Engels és Visser, 2003): - ortodox típusú magvak: a nedvességtartalom- és a tárolási hőmérséklet csökkentése élettartamukat jelentősen megnöveli, így alkalmasak a hosszú távú tárolásra. - rekalcitráns típusú magvak: a nedvességtartalom-csökkentés hatására a magvak elveszítik életképességüket. - átmeneti (intermedier) típusú magvak: a nedvességtartalom csökkentését bizonyos mértékig elviselik (száríthatók), azonban az alacsony hőmérsékleten történő tárolásuk nem megoldható (életképesség vesztés). Tápiószelén 1973 óta folyik hűtött, ún. kondicionált körülmények közötti magtárolás. A kultúrnövények mellett vadon élő fajok (vadrokon fajok) megőrzésére vonatkozóan is vannak tapasztalataink. Jelen projekt keretében az ortodox vagy feltételezhetően ortodox típusú vadon élő növényfajok magvainak gyűjtésére és tárolására kerül sor hosszú távú génmegőrzés céljából. Sok faj esetében azonban tárolhatóságra vonatkozó adatokkal nem rendelkezünk, így ezeknél a fajoknál szükség van a tárolhatósági típus meghatározására. Ez a szárítás, tárolás és életképesség-vizsgálatokat foglalja magába. Ezeket részletesebben a későbbiekben tárgyaljuk. GYŰJTÉS A gyűjtésre vonatkozó előírásokat, útmutatásokat és követelményeket a European Native Seed Conservation Network maggyűjtési kézikönyvének (ENSCONET, 2009a,b) figyelembe vételével készült Pannon Magbank Maggyűjtési Stratégia és Maggyűjtési útmutató tartalmazza. Az ENSCONET maggyűjtési kézikönyve a gyűjtés során ajánlott magszámnak az 5000 db mag/tétel et javasolja, ezért mi is ezt a mennyiséget határoztuk meg gyűjtendő ként. 2

3 A begyűjtött magminták a gyűjtőktől maximum 10 napon belül megérkeznek a regionális gyűjtési központba vagy a vácrátóti koordinátorhoz (vö. Maggyűjtési Stratégia és Maggyűjtési útmutató). 3

4 SZÁLLÍTÁS 1.: A GYŰJTÉST KOORDINÁLÓ PARTNERTŐL (MTA ÖK ÖBI, VÁCRÁTÓT) A TISZTÍTÁS ÉS FELDOLGOZÁS HELYSZÍNÉRE (NÖDIK, TÁPIÓSZELE) A begyűjtött magvak és terjesztőképletek (a továbbiakban magok ) tételeit a vácrátóti az MTA Ökológiai Kutatóközpont Ökológiai és Botanikai Intézete (MTA ÖK ÖBI) előszárított és előtisztított állapotban maximum 2 héten belül továbbítja a tápiószelei Növényi Diverzitás Központ (NÖDIK) részére. A szállítás az ENSCONET (2009a,b) kézikönyv ajánlásainak figyelembe vételével történik. A magtételek szállítását azonosító adatokkal ellátott légáteresztő csomagolásban, például papírtasakban kell megvalósítani. Előnyben részesítendő a magvak szállítása a termések helyett (különösen ha húsos termésekről van szó). A szállítás során fontos feladat, hogy a magok károsodás nélkül jussanak a tápiószelei génbank telephelyére. A szállításnak zárt csomagtérben vagy raktérben kell történnie. A magtételek papírtasakjait az összekeveredés elkerülésére illetve felborulás esetén a magok illetve a tasakok szétszóródását megakadályozó csomagolásban (pl. műanyag hordóban) kell szállítani. Amennyiben a szállítás hosszú időt (több nap) vesz igénybe, a magvakat tartalmazó tasakokat szilikagélen, szárított rizsen, vagy faszénen kell szállítani. Ez különösen akkor fontos, ha a külső levegő (vagy a magvakat kör) relatív páratartalma nagyobb, mint 50 %. Kerülni kell továbbá a magas hőmérsékletet. A begyűjtött tételekkel egyidejűleg meg kell érkezniük a tápiószelei telephelyre a gyűjtési adatlapoknak is. Az adatlapokat a szállítást megelőzően az MTA ÖK ÖBI intézetben fel kell tölteni az elektronikus adatbázisba. TISZTÍTÁS A magvak tisztítása a térfogatcsökkentést (helytakarékosság), a fertőzések elkerülését és a későbbi felhasználás megkönnyítését szolgálja (ENSCONET, 2009c). A magok tisztítása során a tételből el kell távolítani a szennyeződéseket, az idegen anyagokat, valamint a törött, sérült, fertőzött, éretlen és léha magokat (Rao et al., 2006). Így életképes, jó minőségű, megfelelő mennyiségű és minőségű tétel kerülhet tárolásra (Rao et al., 2006). A tisztítást rövid időn belül kell elvégezni közvetlenül a betakarítás után vagy nem sokkal azután, ahogy a génbankba megérkezik (Rao et al., 2006). A tisztítás megkezdése előtt el kell végezni a minták taxonómiai, mennyiségi és minőségi (1. ábra) ellenőrzését, annak érdekében, hogy a tényleges tisztításhoz meg tudjuk határozni a pontos utasításokat és módszereket. Az előzetes ellenőrzés során kiszűrhetőek azok a minták is, amelyekkel esetleg a későbbiekben nem érdemes foglalkozni, mert génbanki tárolása nem alkalmasak mennyiségük, vagy nagymértékű léhaságuk miatt. Ahol feltételezhető, de nem állapítható meg egyértelműen a léhaság mértéke (kb. 5% alatti a becsült ), ott még tisztítás előtt célszerű próbacsíráztatást végezni. A tisztítási módszerek alapvetően a fajtól és a gyűjtési módszertől függnek (Suszka et al., 2008). Bizonyos fajok esetében a tisztítás egyszerűbb (pl. száraz felnyíló toktermés), más fajoknál (pl. húsos termések) nehezebben oldható meg. A tisztítás során fontos a magkárosodás és a magveszteség minimalizálása (Rao et al., 2006, ENSCONET, 2009c). Ennek érdekében a magvak kinyerésére elsősorban kézi tisztítás és egyszerűbb segédeszközök ajánlottak (Rao et al., 2006, ENSCONET, 2009c). Ilyen egyszerűbb segédeszközök lehetnek például a kézi szitasorok és csipeszek (ENSCONET, 2009c). Sok esetben célravezető a többlépcsős tisztítás, melynek során az előtisztítás folyamatát a végleges tisztítás követi (Rao et al., 2006). Az előtisztítás már a terepen, a gyűjtés során megtörténhet (ENSCONET, 2009a,b). A tisztítás során különösen fontos a léha magvak és szemtermések tételből történő 4

5 eltávolítása. A léha szemek eltávolítására alkalmasak a pneumatikus (levegő-befúvásos) tisztítóberendezések (ENSCONET 2009c). Repítőkészülékes magvak esetén szükséges a repítőkészülék eltávolítása (Scmitdt és Thomsen, 2003). Húsos termések tisztítására az áztatásos-mosásos módszer ajánlott (ENSCONET, 2009c, Scmitdt és Thomsen, 2003). Az áztatást követően a magok a szabad levegőn vagy szilikagélen száríthatók (ENSCONET, 2009c, Scmitdt és Thomsen, 2003). Más módszerek a mag szétnyomását és azután a maradék gyümölcshús erős vízsugárral történő eltávolítását, majd durva homok alkalmazását javasolják (Suszka et al., 2008). Az erdészeti gyakorlat alkalmaz hústalanító gépeket (pl. madárcseresznye tisztítására), melyek úgy választják el a magot a gyümölcsmasszától, hogy közben a mag nem károsodik. Ezek alkalmazása azonban csak nagy tételmennyiség esetén javasolt (Suszka et al., 2008). Az előtisztítást a gyűjtők és az MTA ÖK ÖBI munkatársai végzik. A NÖDIK Pannon Magbank laboratóriumába előtisztított minták érkeznek, itt megtörténik a végleges tisztítás. A tisztításhoz a Pannon Magbank laboratóriumban a kézi munkaerőn kívül rendelkezésre állnak különböző egyszerűbb tisztító eszközök (dörzsölők, sziták, csipeszek, nagyítók) és pneumatikus tisztítógép. Ez utóbbi tapasztalataink szerint jól alkalmazható a magvak többségénél, azonban nem eredményez megfelelő minőséget a repítőkészülékes kaszatterméseknél és toklászba zárt szemterméseknél. Ezeknél további kézi munkavégzésre van szükség. 5

6 CSÍRÁZTATÁS MAGMENNYISÉG MEGHATÁROZÁS A MINŐSÉGI ELLENŐRZÉS, TISZTÍTÁS 1. ábra: A tételek minőségének és mennyiségének ellenőrzése Beérkező tétel Minőségi ellenőrzés Minta minőségének megállapítása: érettség/éretlenség/léhaság/szennyezettség Közepes vagy jó minőségű Gyenge minőségű: kb. 5% alatti a becsült Tisztítási mód meghatározása Könnyen tisztítható Nehéz, problémás (pl. fűfélék, fészkesek) Ritka faj Gyakori faj Teljes tisztítás Tisztítás egy lehetséges határig Eldobás/átmeneti tárolás Magmennyiség meghatározása Homogén minta Csíráztatás, fotózás Nem homogén minta 4x100 mag random kiszámolása Irányított mintavétel Csírázási eredmény 50% felett Csírázási eredmény 50% alatt Csíráztatás befejezése Újracsíráztatás 6

7 A MAGTÉTEL MENNYISÉGI BECSLÉSE A rendelkezésre álló alapján a tételek a következőképpen csoportosíthatók: a. A tételenkénti 5000 magnál jóval nagyobb. Az egyszeri csíráztatási vizsgálaton túlmenően rendszeres csírázási vizsgálatok, további kutatások, felszaporítási kísérletek is elvégezhetők illetve tervezhetők. b. A tételenkénti 5000 mag körül van. Ez tekinthető az elegendő nek (vö. ENSCONETa,b gyűjtési kézikönyv). A tételek egyszeri csíráztatási vizsgálata elvégezhető, amely után a tételek az aktív (NÖDIK, MTA ÖK ÖBI), illetve a bázis (NÖDIK, ANPI) tárolókba kerülnek. c. A tételenkénti lényegesen kevesebb 5000 magnál. A tételek csíráztatási vizsgálat nélkül szétosztásra és tárolásra kerülnek. FAO/IPGRI (1994a,b) Génbank-szabványok ajánlása alapján a bázistárolóban az elfogadható mennyiség 1000 életképes mag, míg az előnyben részesítendő mintanagyság életképes mag (FAO/IPGRI 1994a,b). Ezernél kevesebb mag esetén felújító vetés vagy új minta gyűjtése szükséges. Általánosan érvényes továbbá, hogy a genetikailag heterogén tételek esetében nagyobb mennyiségű mag tárolása szükséges. MAGMORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK A magmorfológiai vizsgálatok egyrészt a mag legfontosabb morfometriai adatainak felvételezését (hosszúság, szélesség, és ezek statisztikailag értékelhető átlagai), másrészt az százmag-tömeg vizsgálatot foglalják magukba. A morfometriai adatok mérése digitális, sztereomikroszkóp segítségével készített fénykép-dokumentációval és az ezt feldolgozó szoftverrel megoldható. A százmag-tömeg vizsgálat a csíráztatással párhuzamosan történik. Ha elegendő áll rendelkezésre minden esetben mag tömege kerül lemérésre, kis mintáknál 4 25 mag kerül csak kiszámolásra. ÉLETKÉPESSÉG VIZSGÁLAT 1. A génbanki tárolásra szánt magtételek életképességének vizsgálata előírás (FAO/IPGRI, 1994, Rao et al., 2006, ENSCONET, 2009c, FAO, 2013). Elvégzésének ajánlott időpontja: a tárolás előtt és a tárolás alatt rendszeres időközönként (FAO/IPGRI, 1994, Rao et al., 2006, FAO, 2013). Az ENSCONET (2009c) a csíráztatás elvégzését a magvak nedvességtartalmának csökkentése előtt és után egyaránt javasolja. Az életképesség meghatározására az alábbi módszerek alkalmazhatóak: Csíráztatás Az életképesség meghatározására legáltalánosabban alkalmazott módszer. Menetét a 2. ábra mutatja be. Az életképes mag a csírázás külső feltételeinek biztosításával (víz, megfelelő hőmérséklet, bizonyos fajoknál fény) kicsírázik. Bizonyos fajoknál előfordulhat, hogy keményhéjúság, illetve a magnyugalmi állapot akadályozza a csírázás megindulását. A Royal Botanic Gardens Kew adatbázisa [1], az International Seed Testing Association (ISTA) és az Association of Official Seed Analysis szabványa (AOSA) számos növényfajra vonatkozóan 7

8 részletesen megadják az ideális csíráztatási módszereket (csíráztató közeg, csíráztatási hőmérséklet, csíráztatás időtartama, vízadagolás, egyéb kezelések, stb.). Az ISTA magyar viszonyokra alkalmazott csírázóképesség meghatározási módszereit az 1992-ben kiadott Magyar Szabvány tartalmazza (MSZ, 1992). Génbanki vonatkozásban igen hasznos és kiválóan alkalmazható az International Board for Plant Genetic Resources által kiadott kézikönyv (IBPGR), amely igen sok növényfaj csíráztatási módszereit gyűjti össze a teljesség igényére törekedve (Ellis et al., 1985). TTC-vizsgálat A módszer nagyméretű magvaknál alkalmazható. A módszer lényege, hogy a 2,3,5-trifeniltetrazolium-klorid vagy -bromid színtelen vizes oldatát redoxindikátorként használják, mellyel az élő sejtben végbemenő redukciós folyamatok kimutathatók. A magszöveten belül a TTC-oldat a dehidrogenázoktól hidrogéniont vesz fel, és eközben vízben oldhatatlan, nem diffuzibilis vörös színű trifenil-formazanná alakul át. A nem élő, elhalt sejtek a TTC-oldatot nem redukálják, így a mag élő (vörösre színeződött), és elhalt (nem színeződött) területeinek nagysága alapján a mag életképessége meghatározható. Az egyes növényfajok magjának TTC-s életképesség-meghatározási módszere elsősorban az alkalmazott oldatkoncentrációban és a kezelés időtartamában tér el egymástól. Az ISTA 1966-ban megjelent szabályzatában felvetette alternatív módszerként a TTC-vel való életképesség meghatározást fafajok magvainak vizsgálata céljából. Indigókarminos festés A módszer lényegét tekintve hasonló az előzőhöz. A technikai kivitelezése a következő: 18 órás áztatást követően az embriót kioperálják a magból, és fajtól függően egy vagy két órára, sötétben, indigókarmin oldatba merítik. Az elhalt szövetek kékre színeződnek, míg az élő szövetek festetlenek maradnak. A módszer előnye, hogy olcsóbb a TTC-vizsgálatnál (Ellis et al., 1985, Suszka et al., 2008). Metszés Ez a módszer inkább a magvak egészségi állapotának, mint életképességének meghatározására szolgál. A magot hosszirányban elmetszik, és a metszési felület színének, állapotának alapján egy adott mintából meghatározható az egészséges magvak aránya. A léha, fertőzött egészségtelen magvak jól elkülöníthetők. A módszer előnye, hogy gyors, viszont a mag roncsolásával jár és gyenge minőségű magtétel esetén az életképességre vonatkozó, megállapítások túlzók lehetnek (Suszka et al., 2008). Röntgen-sugár Ezzel a módszerrel elsősorban a telt, léha és károsított magvak aránya határozható meg egy adott mintában. A magmintát egy film fölé fektetett kalibrált lemezre fektetik. A film előhívása után jól elkülöníthetők egymástól a fertőzött, egészséges, fejlett és léha magok. A módszer előnye, hogy gyors és nem jár a mag roncsolásával, viszont igen költséges (Ellis et al., 1985, Suszka et al., 2008). Glutaminsav dekarboxiláz aktivitás (GADA teszt) A módszer lényege, hogy a magmintához glutaminsavat adnak. Az élő sejtekben termelődő glutamin sav dekarboxiláz enzim hatására CO 2 képződik, melynek mennyisége (pl. CaOH oldatba vezetve) mérhető. A termelődő CO 2 mennyisége alapján meghatározható a mag életképessége. A módszer hátránya, hogy növényfajokra (kultúrnövények esetében faj alatti taxonokra is) külön kalibrálást kell végezni (Ellis et al., 1985). 8

9 Jelen projekt a fenn említett módszerek közül a csíráztatásos és a TTC festéses módszert alkalmazza az életképesség meghatározására. A csíráztatásos életképesség vizsgálatnál az ismétlésszám és a mintanagyság meghatározásához a vadon élő növényfajokra vonatkozó ENSCONET (2009c) ajánlásait vesszük figyelembe a mezőgazdasági növényfajokra vonatkozó szabványok (FAO/IPGRI, 1994, Rao et al., 2006, FAO, 2013) előírásaival szemben. Az ismétlésszám és a mintanagyság tervezésénél a természetvédelmi célok, a magméret és a rendelkezésre álló a mérvadó. Amennyiben elegendő áll rendelkezésre (>= 5000 db mag) a csíráztatást 2 ismétlésben kell elvégezni db mag felhasználásával. Kevés a magszám (< 5000 db mag), vagy veszélyeztetett faj esetén kisebb mintanagyság (2 25 db mag) is elfogadható a csíráztatáshoz. A csírázások kiértékelése rendszeresen időközönként történik (hetente kétszer), fotódokumentációval kiegészítve, annak érdekében, hogy a csírázás dinamikája is nyomon követhető legyen. A csírázási százalék kiszámítása a csírázott magok számának és a csírázásra rakott magok számának arányából történik (a génbankban alkalmazott csírázási-százalék számítási képlet a vadfajok esetében nem alkalmazható, mert vadfajok esetében jóval gyakoribb a léha, a nyugvó és kemény magok aránya, és ez nagyban torzítja a képletet). A vadfajok csíráztatáshoz külön adatlapot dolgoztuk ki. Az adatlap kitöltésével részletesen a Dokumentálás fejezetben foglalkozunk. A csíráztatási eredmények kiértékelése során arra a döntésre jutottunk, hogy újracsíráztatásra abban az esetben kerül sor, ha az adott tétel csírázási százaléka 50% alatti. A csíráztatással egy-időben kerül sor az százmag-tömeg vizsgálatokra is, amelynek során általános esetben mag tömegének átlagából számítjuk ki a százmag-tömegeket. Ezt a et használjuk a későbbiekben fotózásra (100 magot), a többit pedig a csíráztatásokhoz. A tisztítás és a csíráztatás között a magokat vagy az 5 C-os előhűtőbe, vagy a 0 C-os aktív tárolóban tároljuk lezárt nejlon tasakokban, a magok túlzott nedvesedésének elkerülése miatt. Ezt a nedvességtartalom vizsgálat követi (vö. Tárolási körülmények biztosítása 1.: Nedvességtartalom c. fejezetben). Fontos annak rögzítése, hogy a mért százmag-tömeg érték egy adott nedvességtartalomhoz köthető. 9

10 2. ábra. Csíráztatási vizsgálat (Rao et al., 2006 munkája nyomán) Tárolhatósági típus meghatározása, ellenőrzése Adott fajra vagy rokon fajra vonatkozóan létezik-e csíráztatási protokoll? Igen Nem Csíráztatás Random mintavétel a gyűjtött tételből 2x50 mag kiszámolása Keményhéjúság vagy magnyugalom várható Keményhéjúság Magnyugalmi állapot Igen Nem Nem Igen Mechanikai szkarifikálás Magnyugalom feloldása Szükséges-e előkezelés? Csírázási közeg meghatározása Magok kisméretűek Igen Csíráztatás Petri-csészében Nem Csíranövények megszámolása, csírázási érték meghatározása 10

11 Nem Csíranövények megszámolása, csírázási érték meghatározása Magok közepes vagy nagy méretűek Igen Csíráztatás homokban Csírázási körülmények meghatározása Áll-e rendelkezésre csíráztatási protokoll az adott faj vonatkozásában? Igen Nem Csíráztatás meglévő módszertan alapján Csíráztatás saját módszer alapján Az adott tétel átlagos csírázási százalékának meghatározása 51% feletti 51% alatti Csíráztatás sikeres Csíráztatás sikertelen Módosított csíráztatási módszer ÉLETKÉPESSÉG VIZSGÁLAT 2.: A TOVÁBBLÉPÉS IRÁNYÁNAK ÉS SORRENDISÉGÉNEK ELDÖNTÉSE Amennyiben az adott taxon magjainak viselkedése ismert (ortodox), akkor a következő folyamatábra (3. ábra) alapján megtervezhetőek a csíráztatási vizsgálatok. 11

12 3. ábra. Ortodox magok csíráztatási vizsgálata. * Kézenfekvő az indigókarminos, illetve TTC-s életképesség vizsgálat. Előbbi esetben apró magvaknál technikai nehézséget okozhat az embrió kioperálása, a TTC-s vizsgálatok pedig sok esetben faj, illetve fajcsoport specifikusak. Adott fajra vonatkozóan létezik-e csíráztatási protokoll? Igen Nem Csíráztatás Rokon fajra létezik-e csíráztatási protokoll? A mag csírázik? Igen Nem Igen Nem Csíráztatás A mag életképes, az adott tételre vonatkozó csírázási százalék meghatározható. Igen A mag csírázik? Nem Más életképességvizsgálat elvégzése indokolt. A mag életképtelen A javasolt kezeléssel nem sikerült feloldani a csíranyugalmat vagy a keményhéjúságot. A mag életképes, az adott tételre vonatkozó csírázási százalék meghatározható. A mag életképtelen Kellő számú mag esetén más életképességvizsgálat elvégzése is indokolt. * A javasolt kezeléssel nem sikerült feloldani a csíranyugalmat vagy a keményhéjúságot. A csíráztatási protokoll az adott fajra nem végezhető el. Azon tételek esetében, ahol a taxon magjainak tárolási tulajdonságáról (ortodox, intermedier vagy rekalcitráns) nincs adat, ott a 4. ábra alapján szükséges a tárolási tulajdonság meghatározása. Az életképesség vizsgálatoknak igen fontos szerepe van az egyes fajok tárolási tulajdonságainak megállapításában is. 12

13 4. ábra. A tárolhatósági tulajdonság meghatározásának folyamata (Hong és Ellis, 1996 munkája nyomán) A mag beérkezése A mag nedvességtartalmának és meghatározása Szárítás %-os nedvességtartalomra A magvak többsége elpusztul Életképességvizsgálat A magvak többsége megmarad Szárítás 5 %-os nedvességtartalomra A magvak többsége elpusztul Életképesség-vizsgálat A magvak többsége megmarad Tárolás légmentesen, C-on, 3 hónapig A magvak többsége elpusztul Életképesség-vizsgálat Mindegyik vagy majdnem mindegyik mag megmarad Valószínűleg rekalcitráns Valószínűleg intermedier Valószínűleg ortodox 13

14 TÁROLÁSI KÖRÜLMÉNYEK BIZTOSÍTÁSA 1.: NEDVESSÉGTARTALOM A magvak hosszú távú tárolása szempontjából meghatározó az ideális tárolási hőmérséklet és magnedvesség-tartalom (Agacka et al. 2014, Lima et al. 2014). A tárolási körülmények hatásával kapcsolatos vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a tárolási hőmérséklet és a magnedvesség-tartalom változása elsősorban az életképesség-csökkenés ütemét befolyásolja, annak jellegét viszont nem változtatja meg. Harrington és Roberts vizsgálatai szerint hozzávetőlegesen 5 C tárolási hőmérséklet, illetve 2 % magnedvesség-tartalom csökkenés megkétszerezi a magvak tárolási élettartamát (Holly, 1982). A szárítás előtti magnedvesség-tartalom meghatározása elengedhetetlen a tárolhatósági élettartam meghatározásához (Rao et al., 2006). A magnedvesség-tartalom meghatározása történhet a mag roncsolásával, illetve megfelelő nedvességtartalom meghatározó műszer segítségével (Rao et al., 2006). Előbbi esetben a roncsolást (mérettől függően őrlés vagy aprítás), illetve a tömegmérést követően a magminta víztartalmát szárítószekrényben elpárologtatják, és a magminta kiindulási és szárított tömege alapján meghatározható a magminta víztartalma. Az alkalmazott szárítási hőmérséklet és szárítási időtartam alapvetően az adott növényfaj olajtartalmától, méretétől függ. Az ISTA magyar viszonyokra alkalmazott nedvességtartalom meghatározási módszere részletesen szabályozza az egész folyamatot (MSZ, 2001). Jelen projekt keretében a nedvességtartalom meghatározása megfelelő nedvességtartalom-mérő műszer segítségével a mag roncsolása nélkül történik. A nedvességtartalom meghatározást a magvak szárítása követi. A magszárítás célja a nedvességtartalom olyan mértékű csökkentése, mely meghosszabbítja a tárolási élettartamot és megnöveli a regenerációs intervallumot (FAO/IPGRI, 1994a,b). A tároláshoz a génbankszabványok a mag olajtartalmától függően általában 3-7 % körüli magnedvesség-tartalmat írnak elő (FAO/IPGRI, 1994a,b, Rao et al., 2006, ENSCONET, 2009c, FAO, 2013). Megemlítendő ugyanakkor, hogy Rao et al. (2006) az aktív gyűjtemények (vö. a Tárolási körülmények biztosítása 2. c. fejezetben) számára elfogadhatónak találja a magasabb magnedvesség-tartalmat is: tárolási hőmérséklettől függően olajos magvak esetében 3-8 %, egyéb magvak esetében 7-11 % magnedvesség-tartalmat. Olajos magvaknál az alacsonyabb magnedvesség-tartalomra történő szárítás az avasodás elkerülése miatt javasolt (Engels és Visser, 2003). A magszárításra sokféle módszer használható. Ezek közül a leggyakoribb a különböző szárítóanyagok vagy a párátlanított szárítókamrák alkalmazása (FAO/IPGRI, 1994a,b). A módszerek kiválasztása a rendelkezésre álló berendezéstől, a szárítandó minták számától és nagyságától, a helyi éghajlati viszonyoktól és a költségtényezőktől függ (FAO/IPGRI, 1994a,b). A FAO/IPGRI (1994a,b) Génbank-szabvány ajánlásai a magszárítási eljárásokkal kapcsolatban a következők: C-on és % relatív páratartalom mellett történő szárításnál szárítókamra vagy szárítóanyag részesítendő előnyben. A szilikagél használható magszárításra, és alkalmas extra száraz mag nagyon alacsony nedvességtartalmának biztosítására is. A magmintákat minél hamarabb le kell szárítani a károsodások elkerülése érdekében. A szárítási periódus időtartama a mag méretétől, a szárítandó mennyiségtől, a kezdeti nedvességtartalomtól és a szárítóhelyiség relatív páratartalmától függ. A szárítás során a mag nedvességtartalmát (növényfajtól, növénycsoporttól függően) 3-7 %-os mag-nedvességtartalomra kell csökkenteni (FAO/IPGRI, 1994a,b). 14

15 Figyelemmel kell lenni arra, hogy a száraz és különösen a nagyon száraz magvak gyakran törékenyek, és így érzékenyek a mechanikai károsodásokra. A magmintákat mindig óvatosan kell kezelni (FAO/IPGRI, 1994a,b). A Rao et al. (2006), az ENSCONET (2009c) és a FAO (2013) szabványokban további ajánlások olvashatók: A szárításhoz a FAO (2013) 5-20 C hőmérsékletet és % relatív páratartalmat ajánl. Szárítóanyagnak Rao et al. (2006) szilikagélt, sóoldatot vagy CaCl 2 granulátumot ajánl. A szárításhoz az ENSCONET (2009c) alacsony hőmérsékleten működő, kontrollált páratartalmú szárító inkubátorokat és szárítókamrákat, illetve telített sóoldatot (pl. LiCl oldatot) vagy egyéb szárítóanyagot (pl. szilikagélt) tartalmazó zárt tartályokat ajánl. Megjegyzi továbbá, hogy a magas hőmérsékleten történő szárítás nem ajánlott, ezzel szemben az alacsony hőmérsékleten történő szárítást javasolja (ENSCONET, 2009c). A jelen projekt keretében a vad fajok szárítása 16±1 C hőmérsékletű és % relatív páratartalmú térben (szárítóhelyiségben), egy-menetben történik. A mintákat (től függően) több kisebb tasakban helyezzük a szárítóra, a minél hatékonyabb szárítás érdekében. A szárítás ütemének regisztrálása azonban tételenként egy tasakból történik. Az adott tételek egyensúlyi nedvesség-tartalmának változását hetente kétszer ellenőrizzük, a kamrában mért hőmérsékleti értékek regisztrálása mellett. Az eredmények grafikus ábrázolása és elemzése után azt tapasztaltuk, hogy kb. 2,5 hét után áll be a tételek egyensúlyi állapota. Ezt követően kezdjük meg a magminták szétmérését a tároláshoz a tároló-tasakokba. Annak érdekében, hogy elkerüljük a minták esetleges visszanedvesedését, a szétmérés a szárítókamrában történik. A szárítókamra esetében folyamatos a hőmérséklet és a páratartalom regisztrálása, az adatok gyűjtése, számítógépes rögzítése. TÁROLÁSI KÖRÜLMÉNYEK BIZTOSÍTÁSA 2.: TÁROLÁSI HŐMÉRSÉKLET Az ortodox magvak hosszú távú megőrzése alacsony hőmérsékleten (< 0 C alatt) valósítható meg (Smith et al., 2003, Agacka et al., 2014, Halmagyi és Pinker, 2014, Lima et al., 2014). A génbanki előírások (FAO/IPGRI, 1994a,b, Rao et al., 2006, ENSCONET, 2009c, FAO, 2013) értelmében a magminták megőrzését aktív és bázis tárolókban kell megvalósítani. Az aktív tárolókban a rövid és középtávú megőrzés valósul meg, célja a felújítás, felszaporítás, magkiadás és ellenőrző vizsgálatok (FAO, 2013). A bázis tárolókban az aktív gyűjtemény duplikátumainak hosszú távú megőrzése valósul meg (FAO, 2013). A FAO (2013) javasolja továbbá a bázistárolók biztonsági duplikátum tárolóinak kialakítását is egy a bázis tárolótól különböző helyen, amely a bázis tárolóval megegyező hőmérsékleten működik. Az ajánlott hőmérséklet a középtávú megőrzésre a 0-10 C, míg a hosszú távú megőrzésre a < 0 C. A bázis tárolók számára előnyben részesített a -18±3 C és 15±3 % RH (FAO, 2013). A Pannon Magbank projekt keretében a begyűjtött, leszárított magvak tárolása aktív és bázis tárolókban, illetve ezek duplikátum tárolóiban valósul meg. A 0 C hőmérsékleten üzemeltetett aktív tárolók Tápiószelén a NÖDIK-ben kerültek kialakításra, duplikátum tárolója Vácrátóton az MTA ÖK ÖBI-ben. A -20 C-on működő bázis tároló Tápiószelén kapott helyet, míg duplikátum tárolója Bódvarákón, az Aggteleki Nemzeti Parkhoz tartozó Esztramos-hegy felhagyott bányajáratában. Minden intézménynél tartozik a tárolókhoz egy aggregátor, amely szünetmentes áramellátást biztosít, áramszünet esetén azonnal indul. Fontos feladat a tárolók hőmérsékletének folyamatos biztosítása (monitorozás). Ez úgy valósul meg, hogy a tápiószelei tárolókban 3-3 pontonként történik a hőmérséklet 15

16 regisztrálása, és a három érték átlaga adja a tényleges hőmérsékletet. Az aktív és bázistárolóhoz tartozik egy jelzőberendezés is, amely abban az esetben, ha a tárolók hőmérsékletében 5 fokos hőmérséklet emelkedés következik be hangjelzést ad a Pannon Magbank laborépület és a porta felé. A 24 órás portaszolgálat éjszaka bekövetkező rendellenesség esetén is tudja riasztani a szervízt. MAGMINTÁK SZÉTOSZTÁSA A TÁROLÓBA Jelen projekt keretében a magminták szétosztásának menetét az egyes tároló-kamrákba az 1. táblázat mutatja be. Az egyes tárolókon belül az egyes generációk magtételeinek több tároló-tasakban történő, osztott tárolása a nagyobb biztonság érdekét szolgálja (FAO/IPGRI, 1994a,b). Feltételezhető ugyanis, hogy a hosszú távú tároláskor olyan mérgező gázok szabadulhatnak fel, amelyek befolyásolhatják a tárolási élettartamot (FAO/IPGRI, 1994a,b). Az osztott tárolás célja továbbá a későbbi felhasználás és esetleges magkiadás praktikussá tétele azáltal, hogy így elkerülhetjük a teljes tárolt tételt megbontását. 1. táblázat. A rendelkezésre álló és a tárolásra szánt mintanagyság Tárolás Aktív 1. Aktív 2. Bázis 1. Bázis 2. Magmennyiség 20 %-a 20 %-a 30 %-a 30 %-a A tételenkénti 5000 magnál jóval nagyobb 10x100 magot (4x100 mag átlagából) tartalmazó tasak + maradék (től függően nagyobb tasakba osztva) 10x100 magot (4x100 mag átlagából) tartalmazó tasak + maradék (től függően nagyobb tasakba osztva) 30 %-a 2 részre osztva 30 %-a 2 részre osztva A tételenkénti mag körül van 10x100 magot (4x100 mag átlagából) tartalmazó tasak + maradék (től függően nagyobb tasakba osztva) 10x100 magot (4x100 mag átlagából) tartalmazó tasak + maradék (től függően nagyobb tasakba osztva) 30 %-a osztatlanul 30 %-a osztatlanul A tételenkénti 5x100 magot (4x100 mag átlagából) 5x100 magot (4x100 mag 16

17 mag körül van tartalmazó tasak + maradék (től függően nagyobb tasakba osztva) átlagából) tartalmazó tasak + maradék (től függően nagyobb tasakba osztva) 30 %-a osztatlanul 30 %-a osztatlanul A tételenkénti 3000 magnál kevesebb A tételenkénti 1000 mag alatt van Nincs tárolás Nincs tárolás 50 %-a 2 részre osztva Nincs tárolás Nincs tárolás a teljes mennyiség osztatlanul 50 %-a 2 részre osztva nincs tárolás Amennyiben nagyon kicsi (ezredes nagyságrendű, pl. 0,008525) az adott tétel magtömegének átlaga és nehezen kimérhető, de elegendő áll rendelkezésre az osztott tároláshoz a legkisebb méretű tasakba a mag átlagának kétszerese kerül. CSOMAGOLÁS A TÁROLÁS ELŐTT A szárított magokat légmentesen záró csomagolásban kell tárolni (FAO/IPGRI, 1994a,b, Rao et al., 2006, ENSCONET, 2009c, FAO, 2013), mert ha nem megfelelő ezek lezárása a minta fokozatosan visszanedvesedik. 10 %-os egyensúlyi nedvességtartalom (RH) (vagy 1 % nedvességtartalom) növekedés megfelezi a tárolási élettartamot. Az ENSCONET (2009c) légmentesen záró üveg edényeket, vagy többrétegű, jó minőségű fólia tasakokat ajánl a tároláshoz. Jelen projektben a tárolás háromrétegű fóliázott tasakokban, légmentes állapotban történik. A háromrétegű fóliatasakok hatékony tárolást biztosítanak, ha megfelelő a lezárásuk. Hátrányuk, hogy nem átlátszóak, és a hegyes, éles magok megsérthetik a tasakokat (ENSCONET, 2009c). Célszerű olyan anyagot választani, ami jól bírja a hosszú távú tárolást. A hegyes magokat tegyük előzetesen papír borítékba. Fontos, hogy a lezárás állandó hőmérsékleten történjen (ENSCONET, 2009c). A lezárás szélessége legalább 10 mm és recés mintájú. Egyes génbankok vákuumos lezárást is alkalmaznak a légmentesség érdekében, ez azonban növeli a tasak kiszúródásának és gyűrődésének (lezárási barázdák elmozdulásának) esélyét. A legtöbb tároló eszköz, így a háromrétegű tasak is újrahasznosítható, amely fontos szempont a költségcsökkentéskor. Az egyes tasakokba jutó kimérése a szárítást követően, még a szárítókamrában megtörténik a visszanedvesedés minimálisra csökkentése érdekében. Ekkor történik meg a referenciagyűjteményhez szükséges elkülönítése is (amennyiben elegendő minta magszámú minta áll rendelkezésre), majd a megmaradó 17

18 tömegek ismételt visszamérése. A tasak lezárása speciális csomagológéppel, hegesztéses technológiával történik. A tasak lezárásakor egy azonosító és a lezárás dátuma kerül a tasakra. A tasak lezárásakor alapvető követelmény a magvak visszanedvesedésének megakadályozása. A csomagok méretét alapvetően a magméret és határozza meg. Egy tétel több kisebb fóliázott tasakban kerül tárolásra, a kisebb tasakok pedig egy nagyobb, nyitható tasakba kerülnek. A tasakok számát a rendelkezésre álló határozza meg (vö. 1. táblázat). Kevés mag esetén megfontolandó a teljes anyag génbanki tárolása, de szóba kerülhet az ex situ felszaporítás lehetősége is. SZÁLLÍTÁS 2.: A SZÁRÍTÁS HELYSZÍNÉRŐL (NÖDIK, TÁPIÓSZELE) A TÁROLÓKBA (MTA ÖK ÖBI, VÁCRÁTÓT; ANP, BÓDVARÁKÓ) A NÖDIK-ben feldolgozott és leszárított magvakat el kell juttatni a tárolók helyszínére. A projekt keretében a leszárított magvak betárolás előtt kerülnek elszállításra az MTA ÖK ÖBI-be Vácrátótra (aktív tároló) és az Aggteleki Nemzeti Park területére Bódvarákóra (bázistároló). Mivel a száraz magvak ütődésre, rázkódásra érzékenyebben reagálnak, így a magvak rendeltetési helyre történő szállítását rázkódásmentesen, légkondicionált, temperált utastérben, közvetlen napfénytől óvva kell biztosítani. DOKUMENTÁLÁS A Pannon Magbank projekt keretében az adatok végleges rögzítése egy a projekt számára kifejlesztett rendszerben történik. A dokumentálás során egy központi adatbázisban egyrészt rögzítjük a beérkezett minták gyűjtéshez kapcsolódó tulajdonságait (a gyűjtési adatlap információi alapján), valamint a legfontosabb tárolást érintő adatokat. A beérkezésétől a betárolásig elvégzett munkafolyamatok valamennyi adatának végső rögzítése ebben az adatbázisban történik. A legfontosabb rögzített paraméterek az alábbiakban olvashatók. 2. táblázat. A dokumentációs rendszer felépítése Keresés Gyűjtés Regisztráció Tárolás Törzsadat - gyorskereső - észlelt problémák - statisztikák - felajánlott tételek - ténylegesen begyűjtött tételek - NöDiK-be továbbított tételek - kifizetések - minták ellenőrzése során nyert adatok (minőségi, mennyiségi, taxonómiai) - tisztítási adatok - 4x100 magtömegek - tételbe vétel - szárítási adatok (aw, tömeg) - tárolási tömegek - csíráztatási paraméterek, eredmények - gyűjtők adatai - növények - tájegységek - egyéb 18

19 Csíráztatási adatlap kitöltése: - Ismétlésenként kumulatívan számolódnak a csírák (eltávolítás után is, vagyis nem nulláról folytatódnak a csíraszám értékek) - Az eltávolított csírák száma nem kumulatív, mindig az adatott napon eltávolított mennyiség jelenik meg - A fotók azonosító kódja az alábbi elv szerint épül fel: HUSEED szám_csírára rakás dátuma_cs_1_fotó sorszáma_a pl. HUSEED000324_ _CS_1_0001 a magyarázat: minden azonos HUSEED számú tétel esetén mindig a csírára rakás dátuma szerepel, mert ez egyúttal az adatlap azonosítója is arra az esetre, ha ugyanazt a tételt újracsíráztatjuk, a dátumból kiderül, hogy melyik csíráztatáshoz tartozik az adatlap. A CS betű különíti el a fotót a magokról készült fotóktól, az 1 és 2 számok pedig azt jelölik, hogy melyik ismétlésről készült a fotó. Az kis betűk (a, b, c stb.) teszik lehetővé a fotók azonosítását abban az esetben, ha egy tételről ugyanazon a napon több fotó is készül. 19

20 IRODALOM Agacka, M. Laskowska, D. Doroszewska, T. Hay, F. R. Börner, A. (2014): Longevity of Nicotiana seeds conserved at low temperatures in ex situ genebanks. Seed Sci. Technol. 42: Csontos, P. (2005): A selyemkóró (Asclepias syriaca L.) szárazon tárolt magvainak túlélőképessége. Folia Hist.-Nat. Mus. Matraensis 29: Csontos, P. Bózsing, E. Kósa, G. Zsigmond, V. (2006): Csírázóképesség vizsgálata természetes flóránk fajainak hagyományos gyűjteményekben őrzött magvain. Botanikai Közlemények 93(1-2): Ellis, R. H. Hong, T. D. Robert, E. H. (1985): Handbook of seed technology for genebanks. International Board for Plant Genetic Resources, Rome, 667 p. Engels, J. M. M. Visser, L. (eds.) (2003): A guide to effective management of germplasm collections. IPGRI Handbooks for Genebanks No. 6. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, 174 p. ENSCONET (2009a): ENSCONET Seed Collecting Manual for Wild Species. Royal Botanic Gardens, Kew (UK) & Universidad Politécnica de Madrid (Spain), 32 p. (interneten elérhető: ENSCONET (2009b): Maggyűjtési kézikönyv vadon élő fajokhoz. Fővárosi Állat- és Növénykert, 41 p. (interneten elérhető: ENSCONET (2009c): ENSCONET Curation Protocols & Recommendations. Royal Botanic Gardens, Kew, 45 p. (interneten elérhető: FAO (2013): Genebank Standards for Plant Genetic Resources for Food and Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 166 p. FAO/IPGRI (1994a): Genebank Standards. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, International Plant Genetic Resources Institute, Rome, 13 p. FAO/IPGRI (1994b): Génbank-szabványok. Az ENSZ Élelmezésügyi és Mezőgazdasági Szervezete, Róma, Növényi Genetikai Erőforrások Nemzetközi Intézete, Róma, 13 p. Groot, S. P. C. Groot, L. de Kodde, J. van Treuren, R. (2015): Prolonging the longevity of ex situ conserved seeds by storage under anoxia. Plant Genet. Resour. C. 13(1): Halmagyi, A. Pinker, I. (2014): Germination and cryopreservation responses of Jatropha curcas in relation of seed qualits. Seed Sci. Technol. 42: Holly L. (1982): A génbank célú magtárolás eredményei és problémái. Fajtakísérletezés 19: Az Országos Mezőgazdasági Fajtakísérletezési Intézet kiadványa, Budapest Hong, T. D. Ellis, R. H. (1996): A protocol to determine seed storage behaviour. IPGRI Technical Bulletin No. 1. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, 62 p. Lima, M. de Jr. Hong, T. D. Arruda, Y. M. B. C. Mendes, A. M. S. Ellis, R. H. (2014): Classification of seed storage behaviour of 67 Amazonian tree species. Seed Sci. Technol. 42:

21 Magyar Szabványügyi Testület (1985): Magyar Szabvány: Vetőmag-vizsgálati módszerek Biokémiai életképesség vizsgálata. 31 p. Magyar Szabványügyi Hivatal (Magyar Népköztársaság Országos Szabvány), Budapest. MSZ 6354/4-85. Magyar Szabványügyi Testület (1992): Magyar Szabvány: Vetőmag-vizsgálati módszerek A csírázóképesség meghatározása. 47 p. Magyar Szabványügyi Hivatal, Budapest. MSZ :1992. Magyar Szabványügyi Testület (2001): Vetőmag-vizsgálati módszerek A nedvességtartalom meghatározása. 6 p. Magyar Szabványügyi Hivatal, Budapest. MSZ :2001. Rao, N. K. Hanson, J. Dulloo, M. E. Ghosh, K. Novell, D. Larinde, M. (2006): Manual of seed handling in genebanks. Handbooks for Genebanks No. 8. Bioversity International, Rome, 147 p. Scmitdt, L. H. Thomsen, K. A. (2003): Tree seed processing. In: Smith, R. D. Dickie, J. B. Linington, S. H. Pritchard, H. W. Probert, R. J. (eds.) (2003): Seed Conservation: Turning Science Into Practice. Royal Botanic Gardens, Kew, UK, p Smith, R. D. Dickie, J. B. Linington, S. H. Pritchard, H. W. Probert, R. J. (eds.) (2003): Seed Conservation: Turning Science Into Practice. Royal Botanic Gardens, Kew, UK, 1023 p. Suszka, B. Muller, C. Bonnet-Masimbert, M. (2008): Az erdei lombos fák magjai a begyűjtéstől a vetésig. Mezőgazda Kiadó, Budapest, 291 p. [1] Royal Botanic Gardens, Kew. Seed Information Database. 21