POTENCIÁLIS MIKOTOXIN TERMELŐ ASPERGILLUS IZOLÁTUMOK AZONOSÍT ÁSA HAZAI MEZÖGAZDASÁGI TERMÉKEKEN

Átírás

1 ,.DE tudományos képzési mühelyeinek támogatása" TÁMOP-4.2.2/B-10/ POTENCIÁLIS MIKOTOXIN TERMELŐ ASPERGILLUS IZOLÁTUMOK AZONOSÍT ÁSA HAZAI MEZÖGAZDASÁGI TERMÉKEKEN BARANYI Nikolett' - KOCSUBÉ Sándor' - TÓTHBeáta 2 -PALÁGYI Andrea' SZEKERES András 1 - P ÁL Rita' -SZARVAS Csilla' - GYÖRI Tamás 1 - VARGA János' 1 Stegedi Tudományegyetem, Természcnudományi és Informatikai Kar, Mikrobiológiai Tanszék, 6726 Szeged, Kötép fasor 52.; nikolett lxlranyi@gmail.com 2 Gabonakutaló Nonprofit Közhaszntí Kft., 6726 S7.eged. Alsó kikötö sor 9. Bevezetés A globális klímaváltozás egyik legfontosabb hatása a mik:otoxinok szempontjából a melegkedvelő toxinterme l ő fajok megjelenése lehet a mérsékelt égövi országokban, ami az itt termesztett mezőgazdasági termékek a flatoxin-szennyeződését vonhatja maga után. A jelenséggel az utóbbi években Európa számos országában. így a hazánkkal határos Szerbiában, Szlovéniában, Horvátországban, Romániában és Ukrajnában is szembesülnünk kellett (Dobolyi és mtsi 2011). Számos mezőgazdasági termék (gabonafélék, chi li, szölő. stb.) ochratoxin szennyezettségét is észlelték a közelmultban a közép-európai régióban. Ochratoxin terme lő Aspergilius fajokat gyakran izolálnak importált termékekről is, mint kávébab, kakaóbab, szárított gyümölcsök és fűszerek. Ezek a megfigyelések vezettek bennünket arra, hogy vizsgáljuk a potenciális mikotoxin termelő fajok előfordulását hazai mezögazdasági termékeken. Irodalmi áttekintés A mikotoxinok a fonalas gombák másodiagos anyagcseretermékei, amelyek egyaránt ártalmasak az emberekre és az állatokra nézve is (Varga és mtsi 2009). Az aflatoxinok a legj elentősebb mik:otoxinok, melyeket az Aspergilius nemzetség fajai állítanak elö. A számos ismert aflatoxin közül az aflatoxin B l a leginkább mérgező. Erő s mutagén rákke l tő hatást mutattak ki laboratóriumi állatoknál, és sok bizonyíték utal arra, hogy emberek esetén a máj rákos elváltozását okozhatja (Varga és mtsi 2009). Az aflatoxin B l a természetben előforduló legerősebb rákkel tő anyag, melynek hatására májkárosodás és májrák alakulhat ki. Az Aspergilius jlavus a legjelentösebb aflatoxin termelő faj, emeljett fontos mezőgazdasági kártevő. Különböző mezőgazdasági termények esetében (kukorica, gyapot és földimogyoró) súlyos hozamveszteséget okoz világszerte. Az atlatoxinok a legalaposabban tanulmányozott mikotoxinok. A legtöbb szubsztrát támogatja a növekedést és az atlatoxigenikus formák aflatoxin termelését. Természetes szennyeződés a gabonafélékkel, a dióval, olajos magvakkal, fügével, dohánnyal, stb. fordul e lő a leggyakrabban (Bennett és Klich 2003). Hazánkban az aflatoxin te rmelő fajok közül az A.jlavus-t gyakran izolálják különböző mennyiségben mezögazdasági terményekből (kukorica. búza, szőlő). Az aflatoxinok a hazai éghajlati viszonyok között általában nem okoznak határérték feletti szennyezést a magyar élelmiszerekben, inkább importált mezögazdasági termékekben mutathatók ki. 104 t

2 .,Fiatal kutatók :v egészséges élelmiszerért'' Debrecen Az ahatoxin tennelés kedvező környezeti fe ltételei a magas nedvességtartalom és hőmérsé klet, ezért az A. jlavus melegebb, trópusi és szubtrópusi tcrületeken képes aflatoxinokat előállítani (Varga és mtsi 2009). Következtetésképpen, a közép-<!urópai országokban (Magyarország, Szcrbia, Szlovénia, Horvátország, Románia, Ukrajna), melyek a mérsékelt éghajlati övben helyezkednek el, a mezőgazdasági termékek aflatoxin-szcnnyezettsége ezidáig nem jelentett komoly egészségügyi kockázatot. Azonban a globális felmelegedés által okozott klímaváltozás jelentős változásokat idézett elő. Az utóbbi időben több tanulmány is foglalkozott az éghajlatváltozás hatására megjelenő aflatoxin termelő gombákkal és az aflatoxinok élelmiszerekben tö 11énő előfordul ásával (Paterson és Lima 2010, Tirado és mtsi 2010). Ezen vizsgálatok alapján a klímaváltozás miatt az aflatoxin termelő gombák, és következtetésképpen az aflatoxinok is, várhatóan egyre inkább elterjednek a mérsékelt éghaj lattal rendelkező országokban is. Sőt, a legújabb vizsgálatok jelezték az aflatoxin termelő gombák előfordulásá t és ezzel együtt a mezőgazdasági tennékek aflatoxin-szennyezettségét több olyan európai országban, ahol eddig még nem találkoztak ezzel a problémával (Dobolyi és mtsi 201 1). Hazánkat tekintve. Borbély és mtsi (2010) kelet-magyarországi gabona és kevert takarmány mintákban vizsgálták a mikotoxin szintet, és találtak olyan mintákat, melyekben az aflatoxin B.l megbaladja az uniós határértéket, míg Dobolyi és mtsi (20 ll) Magyarország különböző régióiból gyűj tött kukoricaszemekcn azonosítottak a fiatoxin termelő Aspergilius jlavus-t. Az ochratoxinok Aspergilius és Penicillium fajok által termelt mikotoxinok. Jelentösebb termelők : A. ochraceus, A. westerdijkiae, A. niger, A. awamori, P. verrucasum (Varga és mtsi 2008). Az ochratoxin A erősen toxikus, kifejezetten vesekárosító anyag, azonban májkárosító, idegrendszert és immunrendszert károsító hatását is igazolták. Állatkísérletben nagy mennyiségben bizonyítottan rákke l tő. Az ochratoxin A jeleniélét kimutatták már kölönböző élelmiszerekben, főleg gabonában, gabonatermékekben, hüvelyesekben, kávéban, sörben, szőlölében, mazsolában, borban, kakaóban, mogyorófélékben és fűszerekben (Varga és mtsi 2001). A fenti élelmiszereken kivül kimutatható ehe tő belsőségekből és vérb ől is. Mérsékelt égövi körűlmények között is te rmelődik, így az ochratoxin szennyezettség hazai viszonylatban is figyelmet érdemel. Anyag és módszer Mintavétel: A kukorica- és búzamintákat 2010 óta gyüjtjük. különböző hazai és vajdasági gabonatermő területekről aratás után. A vizsgált gabonatclék közé tartozott a kukorica, a búza és az árpa. Emellett különböző helyről származó chilipaprikát és diót is vizsgáltunk. A mintákat felszínsterilezést követően diklorán tartalmú bengálvörös (DRBC) táptalajra helyeztük (King és mtsi!979). A lemezeket 25 C-on sötétben inkubáltuk és időszakosan ellenőriztük növekvő micéliumokat. A kinőtt micéliumot tisztítás után malátás (MEA) táptalajra oltottuk Fajazonosítás: A DNS kivonáshoz YPD (é lesztő, pcpton, D-glükóz) tápoldatban tenyésztett kultúrát használtunk, melyet 4 napig 25 C-on rázattuk rpm-en. A DNS kivonáshoz az Epicentre Biotechnologies MasterPurct~ Yeast DNA Purification készletei használtuk a gyártó utasítása szerint. A fajazonosítást a kalmodulin gén egy 105

3 ,.DE tudományos képzési műhelyeinek támogatása'' TÁMOP-4.2.2/B-10/ szakaszának amplifikálása és szekvencia analizise révén végeztük cl (Pildain és mtsi 2008). A kapon kalmodulin szckvcnciákat nukleotid-nukleotid BLAST (blastn) (hnp:/lblast.ncbi.nlm.nih.gov: Altschul és mtsi 1990) segítségével hasonlítottuk össze a Genbank-ban található szekvenciákkal és a saját adatbázisunkkal is. Atlatoxin terme l ő képesség vizsgálata: Az Aspergilius jlavus izaiátumokat 2 ml YES (2% é l esztő, 20% szacharóz) tápoklatba oltottuk és 25 C-on sötétben inkubáltuk 7 napig. Az aflatoxin extrakciót 2 ml diklór-metánnal végezti.ik cl. Az izoláturnak aflatoxin terme l ő képességét vékonyréteg kromatográfiával (TLC) és HPLC-vel is elvégeztí.ik. Ochratoxin terme lő képesség vizsgálata: Az Aspergilius ochraceus és Alpergillus westerdijkiae törzseket 25 ml malátakivonatot tartalmazó tápoldatha oltotluk ki. majd 25 C-on, sötétben, 7 napig inkubáltuk. Az. inkubációs idő letelte után a" extrakciót 2x5 mj kloroformmal végeztük el. Az izolátumok allatoxin termelő képességél vékonyréteg kromatográfiával (TLC) és HPLC-vel is elvégeztük. Eredmények és értékelésük Az utóbbi időbe n számos Aspergilius fajt azonosítottak, melyek képesek aflatoxinokat e lőáll ítani (Varga és mtsi 2009). Ezek a fajok könnyen elkülöníthetőek a P-tubulin vagy kalmodulin gén szekvencia analízisc révén (Varga és mtsi 20 ll ). Munkánk során vizsgáltuk a potenciális aflatoxin termelő gombák e lőfordulását hazai gabonaféléken. A legtöbb izolátum telcpmorfológia és mikroszkopikus jellemzőik alapján az Aspergilius nemzetség Flavi szekciójába volt sorolható. A fajazonosítás a kalmodulin gén egy szakaszának szekvencia analízise alapján történt, melynek eredményeként megállapítottuk, hogy a legtöbb izolátum az A~pergillus flavus faj ba tartozott (Tóth és mtsi 2012). Nagyszámú (2 1) Aspergilius jlavus izolátumot azonosítottunk az ország különböző régióiból származó búzaszcmeken, melyek közi.il a legfert őzö ttebbnek az Alakor (egyszcmű búza, Triticum mrmococcum) bizonyult. Az Alakor ősi diploid búzafajta, mely igen ellenálló gombabetegségekkel szemben. A vizsgált búzamintákban nem tudtunk anatoxinokat kimutatni. Az izolátumok atlatoxin term e l ő képességének vizsgálatát vékonyréteg kromatográfiával és HPLC-vel is elvégeztük. Ennek eredményeként megállapítottuk, hogy az izolátumok nem voltak képesek atlatoxinokat előállítani. A hazai és vajdasági területekről származó kukoricaminták.ról azonosított izolátumok fajazonosítása folyamatban van. Előzetes morfológiai vizsgálatok és lts alapú szekvencia adatok alapján a lc&>több izolátum az Aspergilius nemzetség Flavi szekciójába sorolható. Vizsgáltuk továbbá chilipaprika és dióminták mikóbiótáját is, melynck során számos potenciális mikotoxin termelő Aspergilius törzset izoláltunk. Az izolátumokat 6 dió és ll paprika mintáról gyűjtötti.ik. Munkánk során 18 potenciális anatoxin termelő A. jlavus, valamint 7-7 potenciális ochratoxin termelő A. ochraceus és A. westerdijkiae izolátumot azonosítottunk. A chilipaprikáról és dióról származó A. flavus izolátumok esetében is vizsgáltuk az atlatoxin termelő képességet. Ebben az esetben is az e l őzete s vékonyréteg kromatográfiás (TLC) módszert követően HPLC-vel is elvégeztük. Vizsgálataink alapján néhány izolánun nagy mennyiségbcn termelt aflatoxinokat (l. táblázat). 106

4 .,Fiatal kutatók az. eg6sz.séges élelmiszerért" Debrecen. 20 l 3 A'L. A. ochraceus és A. wesrerd~jkiae izolátumok ochratoxin termelő képességének vizsgálata során az e l őzetes vékonyréteg kromatográfiás (TLC) módszett követően az izolárumok - 50%-a esetében ochratoxin termelést tapasztaltunk, a pontosabb eredmények érdekében a HPLC vizsgálatok folyamatbart vannak. l. ráhlázat. Chilipaprikáról s:~;ármazó A.flavus izolátumok által termelt atlatoxinok HPLC-velmeghatározott mennyisége (J) Izoláturu (2) Allatoxin 8, (3) Afla toxin 81 (n gimi) (n elm!) Chili 5a Chili4b 174,4 Chili 8a Chili 8c 11493,6 TableJ. Detection of produced aflatoxins by A.jlavus isolates by HPLC (l l Isolat: s. (2) Aflatoxin B.' ' (3) Aflawxin B ,2 Következtetések Vizsgálataink alapján az éghajlatváltozás következtében a mc leg-kedve lő mikotoxinogén Aspergilius fajok a mérsékelt égövi országokban, így hazánkban is egyre gyakrabban fordulnak elő különbözö mezőgazdasági termékeken (gabonafélék, paprika, dió, hagyma, stb). Egyéb mezögazdasági termékek mikobiótájának alaposabb vizsgálata is szi.ikségesnck tűnik a potenciális mikotoxin termelő AspergiLius fajok megjelenésének becslésérc, emellett nagyobb figyelmet kell fordítanunk a termőföldeken a mi ko toxin -termelő penészgomba fajok elleni védekezésre. Az erre irányuló törekvések egyike lehet rezisztens gabonafajták illetve egyéb termesztett növények kifej lesztése, valamint a biológiai védekezés (pl. antagonisták alkalmazása). Összefoglalás A globális k:límaváltozás egyik legfontosabb hatása a rnikotoxinok szempontjából a mejegkedvelö toxintermelő fajok megjelenése lehet a mérsékelt égövi országokban, ami az itt termesztett mezőgazdaság i termékek toxin-szennyeződését vonhatja maga után. A jelenséggel az utóbbi években Európa számos országában, így a hazánkkal határos Szerbiában, Szlovéniában, Horvátországban, Romániában és Ukrajnában is szembesülnünk kellett. Fenti észlelések hatására vizsgáltuk hazai és vajdasági gabonaszemek és termesztett növények mikobiótáját. A mintákat különbözö gabona te nnő területeken gyűjtöttü k aratás után, majd felülctsterilizálást követően szelektiv táptalajra helyeztük A'L. izolált gombatörzseket morfológiailag és szekvenciaalapú módszcrekkel azonosítottuk. Munkánk során nagyszámú Aspergilius jlavus izolátumot azonosítottunk az ország különböző régióiból származó búzas:t:emeken, valamint hazai és vajdasági kukoricaszemeken. A legfertőzöttebbnek az Alakor (egyszemíí búza, Trüicttm monococcum) bizonyult, azonban ezek az izolátumok nem termeltek aflatoxint a vizsgált körűlmények között. Munkánk során különböző helyről 107

5 u ~»E rudományos képzési műhelyeinek támogatása" TÁMOP-4.2.2/B \rmazó füszerpaprikát, chilipaprikát és diót is vizsgáltunk. Ezen mintákról az A. /1 11'1/s mellett potenciálisan ochratoxin terme l ő A. ochraceus és A. westerdijkiae lwlátumokat is sikerült azonosftanunk, melyek mikotoxin termelő képességének Vll~gálata folyamatban van. Kulcsszavak: Aspergilius, a fiatoxin, ochratoxin, klímaváltozás Köszönetnyilvánítás Jelen kutatási eredmények megjelenését,,az SZTE Kutatócgyetemi Kiválósági Központ ludásbálisának kiszélesítése és hosszú távú szakmai fenntarthatóságának megalapolása 11 kiváló tudományos utánpótlás biztosításával" cím ű, T Á1\10P-4.2.2/B-l0/l-20 l nosftószámú projekt támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg. Továbbá a K84122 és K84077 számú OTKA pályázatok és a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (Tóth B.), és c~y regionális magyar-szerb EU pályázat (HUSRB/1002/122/062- ToxFreeFecd) tenék lehetövé a kutatási munkát Irodalom Altschul S.F.- Gbh W.- Miller W.- Mycrs E.W.- Lipman DJ.: Basic local aligament search tool. J ourn~j of Molccular Biology.. 215: Benneu J.W. - Klich M.A Mycoltlxins. Clinical Micmbiology Reviews. 16: Borbély M. - Sipos P. - Pelles F. - Oy{\ri Z.: Mycotoxin contaminution in cereals. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 16: l)obolyi Cs.- Scbök F.- Varga J. - Kocsubé S.- Szigcti Gy. - Baranyi N. Szécsi Á.- Lustyik Gy. Micsinai A.- Tóth B.-Varga M.- Kriszt B.- Kul.olya J.: 2011 Allato~in -termeló Aspergill u.\ jlavus törzsek e l őfordulása hazai kukoríca szcmtermésben. Növ~nyvédelem. 47: (4). King A.D.Jr.- Hocking A.D. - Pitt J.T.: Dichloran-rose bengal medium for enumeration and bulalion of molds from foods. Applied and Environmental Microbiology. 37: Paterson R.RM. - Lima N.: How will elimate change affect mycotoxins in food? Food Research lntemational.43: Pildain M.B. - Frisvad J.C. - Vaamonde G. - Cabral D. Varga J. - Sarn~on R.A.: Two novel allatoxin-producing A~pt:rgillus species from Argentincan peanuls. lmemntional Journal ol Systematic and Evolutionary Microbiology. 58: Timdo M.C.- Clarke R.- Jaykus L.A.- McQuatters- Gollop A. Frank.I.M.: Climalc::: chungc and food safety: A review. Food Research.International. 43: Tóth B.- Török O.- Kótai É.- Varga M.-Toldiné Tóth É.- Pálfi X. - Háfra E. - Varga J.- Téren J. MMest.erhá/y Á.: Therole of Aspergilli and PenieJilia in mycotoxin contamination of Maize in Hungary. Acta Agmnomica Hungarica 60: Varga J. - Frisvad J.C. - Pildain M.B. - Vaamonde G.- Cabral D.- Samson R.A.: Two new aflatoxin producing species. and an overview of Aspersillus scction Flavi. Studics in Mycolngy. 69: Varga J.- Frisvad J.C. - Samson R.A.: A reappraisnl offungi produci n g nflatoxins. World Mycotoxin Journal. 2: Varga J. - Houbrakcn J - Saroson R.A. - Frisvad J.C.: Molecular divcrsity of Aspergilius and Pemcil/ium ~-pecies on fruits and vegetablcs. Academic p Press. New York, pp Varga J. - RigóK.- Téren J.- Meserhá7y Á.: Recent advances in ochratoxin research l. Production. detection and occurrance of ochrntoxin. Cereal Research Communications. 29:

6 ,.Fiatal kutatók az egészséges élelmjszerért" Debrecen, 2013 Identification of potential mycotoxin producing Aspergilli on agricultural products in Hungary [n view of agriculture, one of the most important effects of elimate chru1ge is the occurrence of thermotolerant ruycotoxin producing fungi in countries with temperate climate, causing mycotoxin contamination of agricultural products.lndeed, a shift has recemly been observcd in the oocurrence of allatoxin producing fungi in Europe. with consequent atlatoxin coutamination in agricultural commodities including maize in sever.1l European countties not facing with this problem before, including Serbia. Croatia, Slovenia, Romania and Ukraine. These observations led us to cxamine the occurrence of mycotoxin producing Aspergilli in agricultu(al products in Hungary. The samples werc colleeted fmm cercal fields in Hungary and Vojvodina after harvest. Surface-sterilízed cercal seeds were piaccd on selectíve media, and the isolated fungal st:rains were identified using morphological mcthods. The species identification of selceted isolates was carried out using sequence-based ruethods. Several polentiauy aflatoxigenic A.jlavus isolates were identified on ceceals including wheat and maize. The most severe! y contaminated wheat eu Itivar was Alakor, however, none of the A. jlavus isolates camc ftom this cultivar were able to produce allatoxins. During examination of the mycobiota of red pepper. chili and nut saruples. ochratoxigenic A. m;hraceus and A. westerdijkiae isolates have also becn identified besides A.jla.vus. Ex amination of mycotoxin producing abilities of the isolates is in progress. Keywor ds: elimate chru1ge, Aspergilfus, allatoxi n, ochratoxin 109